Gene expression of cytokines and wound-healing potential of macrophages derived from rat bone marrow and peripheral blood

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Макрофаги относятся к клеткам врождённого иммунитета и представляют большой интерес для исследователей ввиду их участия в физиологических и патологических процессах, таких как острый респираторный дистресс синдром, преэклампсия, длительное заживление ран, атеросклероз и других [1–6]. Макрофаги (МФ) играют ключевую роль в воспалительных процессах и регенерации тканей [7]. Участие в полярно направленных процессах является характерной особенностью данного типа клеток и обозначается термином пластичность. Поляризация МФ в про- или противовоспалительный фенотип — это комплексная реакция клеток на микроокружение, включающая не только изменения на генном уровне, но и перестройку метаболизма, в частности путей превращения аминокислоты L-аргинина, необходимой для синтеза белков, нуклеотидов и полиаминов [8].

Для подавления бактериальных инфекций и усиления воспаления провоспалительные МФ выделяют большое количество оксида азота (NO), образующегося из L-аргинина под действием фермента индуцибельной синтазы оксида азота (inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS или NOS2) [9]. Стимуляция синтеза коллагена, формирования новой соединительной ткани и ангиогенеза противовоспалительными МФ ассоциирована с высоким уровнем аргиназы-1 (Arg1). Баланс активности NOS2 и Arg1 в метаболических путях превращения L-аргинина определяет эффективность регенерации тканей и зависит от поляризации МФ [10].

Известно, что на начальных этапах после повреждения целостности кожных покровов (фаза воспаления) основная функция МФ заключается в инициации воспалительной реакции, что достигается за счёт выработки NO и цитокинов, включая интерлейкин-1β (IL-1β), фактор некроза опухоли α (TNFα) и другие. В то же время МФ посредством фагоцитоза очищают рану от погибших клеток и микроорганизмов, способствуя тем самым подготовке среды для регенерации. По мере развития процесса заживления раны (фаза пролиферации) в МФ активируются механизмы, приводящие к секреции факторов роста — VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), TGF-β (Transforming Growth Factor beta), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), — стимулирующих ангиогенез и активирующих фибробласты. Дисбаланс двух состояний МФ (про- и противовоспалительного) в пролиферативную фазу регенерации приводит к хроническому воспалению, либо к избыточному рубцеванию. В дальнейшем, на этапе ремоделирования раны адекватное функционирование МФ позволяет избежать фиброза или несостоятельности рубца [6].

Таким образом, использование МФ в качестве клеточной терапии у человека, в том числе при нарушениях, связанных с физиологическим заживлением ран, имеет значительный потенциал [11].

Подходящим модельным объектом для оценки возможности применения МФ для клеточной терапии таких патологий, как острые и хронические раны, являются крысы. Их преимуществами являются относительно крупные размеры и простота обращения, а также то, что, в отличие от мышей, у крыс имеются два источника макрофагов: красный костный мозг (ККМ) и периферическая кровь (ПК). Особенностью использования ККМ в качестве источника МФ является возможность получения большего количества клеток, чем из ПК. Однако для выделения ККМ необходимо вывести животное из эксперимента, а применение таких МФ может привести к активации иммунной системы у реципиента, несмотря на линейность животных. Альтернативным источником получения МФ служит периферическая кровь, при этом животное остаётся в эксперименте и может быть использовано для аутологичного введения МФ, что значительно снижает количество животных в исследовании [12, 13].

Для человека показано, что неполяризованные МФ, культивированные из периферической крови и красного костного мозга, обладают сходным фенотипом и фагоцитарной активностью [12]. Однако для крыс область прямых сравнительных исследований уровней экспрессии генов и влияния МФ, выделенных из разных источников, на процесс заживления ран остаётся малоизученной. Большинство данных получено в результате межвидовых сравнений или сфокусировано на отдельных субпопуляциях, например, перитонеальных макрофагах.

Цель исследования — сравнить уровни экспрессии генов регуляторных и провоспалительных цитокинов (IL- 1β, IL-6, IL-10) и генов ферментов превращения аминокислоты L-аргинина (Arg1 и NOS2) в макрофагах, полученных из моноцитарных предшественников красного костного мозга и из моноцитов периферической крови, а также оценить их влияние на заживление ран кожи.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Для подтверждения гипотезы о различиях макрофагов, полученных из двух источников, по уровням экспрессии генов IL-1β, IL-6, IL-10, Arg1, NOS2, а также по их влиянию на заживление ран кожи проведено экспериментальное подтверждающее исследование в параллельных группах. Животных включали в исследование методом случайного отбора с последующей простой рандомизацией по группам.

Для in vitro исследования выделяли макрофаги из периферической крови и красного костного мозга; сравнивали уровни экспрессии генов IL-1β, IL-6, IL-10, Arg1, NOS2 в них, а также экспрессию маркеров CD68, CD45 и CD34. Перед проведением in vivo эксперимента животных случайным образом разделили на 3 группы по 3 особи в каждой. Проведено подтверждающее экспериментальное неослеплённое исследование в параллельных группах.

Критерии отбора и содержание животных

Исследование проведено на 12 самцах крыс линии Sprague-Dawley, полученных из питомника Филиала ИБХ РАН (Пущино, Россия): масса (250 ± 30) г, возраст 6 месяцев. Животных содержали в стандартных полипропиленовых клетках (по 4 особи в каждой) в помещениях с контролируемой температурой (20 ± 2) °C и относительной влажностью воздуха 40–60%, при обратном цикле свет/темнота (12/12 ч). Животные имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму (ПК-120-1, ООО «Лабораторснаб», Россия). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и её пересмотренным вариантом 2000 г., а также с рекомендациями ARRIVE и Директивой ЕС 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях [13]. Для эвтаназии применяли передозировку изофлурана (Laboratories Karizoo S.A., Испания) с использованием испарителя Matrix VIP3000 (Baxter, Германия).

Экспериментальное воздействие

У 3-х животных после эвтаназии выделяли моноциты из красного костного мозга; 9 крысам моделировали послойную эксцизионную рану кожи в области спины. За 7 дней до моделирования раны у трёх животных проводили забор периферической крови из хвостовой вены под глубоким инъекционным наркозом, индуцированным внутримышечным введением смеси тилетамина и золазепама (Virbac, Франция) в дозе 30 мг/кг. Каждое животное маркировали для последующего введения аутологичных МФ.

Модель послойной эксцизионной раны кожи спины

Полнослойную эксцизионную рану кожи моделировали с использованием стерильного скальпеля в области лопаток, поскольку эта зона свободна от выраженной мышечной активности и характеризуется относительно постоянной толщиной кожного покрова. Сразу после проведения манипуляции трём животным в края раны вводили по 0,5 × 10⁶ аутологичных МФ, полученных из периферической крови (МФ-ПК), в кондиционированной культуральной среде объёмом 200 мкл. У трёх крыс края раны оставляли интактными — группа контрольных животных. Оставшимся трём животным в края раны вводили МФ, полученные из моноцитарных предшественников, выделенных из красного костного мозга (МФ-ККМ). Клетки вводили с помощью инсулинового шприца с иглой 30G. Вмешательство проводили под действием наркоза, индуцированного внутримышечным введением смеси тилетамина и золазепама в дозе 30 мг/кг. В послеоперационном периоде анальгетики не применяли; каждую группу животных содержали в отдельной полипропиленовой клетке в стандартных условиях вивария. На 7 и 14 день после формирования раны и введения МФ визуально оценивали её состояние: наличие отёка и гиперемии краёв раны, а также наличие экссудата, его характер и количество (гнойный или геморрагический). Проводили фотографирование для последующего определения скорости сближения краёв раны с использованием программы ImageJ (v.1.54p) [14].

Получение и культивирование макрофагов

Выделение моноцитов (n = 3) из красного костного мозга проводили методом градиентного центрифугирования, описанным в работе N. Halimani и соавт. [15]. После отделения бедренных костей удаляли эпифизы, а диафиз промывали раствором Хенкса («ПанЭко», Россия), содержащим 1000 МЕ/мл гепарина (АО «Синтез», Россия). Полученную суспензию центрифугировали (400 g, 30 мин, 20 °С) на градиенте плотности Фиколла (1,09 г/ см³; «ПанЭко», Россия). Фракцию мононуклеарных клеток отбирали и промывали двукратным центрифугированием в растворе Хенкса (300 g, 20 мин, 20 °С).

При выделении моноцитов из периферической крови для культивирования макрофагов (n = 3) клеточную фракцию также получали методом градиентного центрифугирования (400 g, 40 мин, 20 °C, без торможения) на Фиколле, с последующим двукратным промыванием клеток (300 g, 10 мин, 20 °C) в растворе Версена («Пан-Эко», Россия).

В обоих случаях после промывания осадок ресуспендировали в соответствующем растворе и оценивали количество и жизнеспособность клеток по включению трипанового синего с использованием анализатора TC20 (Bio-Rad Laboratories, США). Клетки в количестве 2–3 млн ресуспендировали в 3–4 мл полной ростовой среды (ПРС) следующего состава: RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), 10% фетальной телячьей сыворотки (PAA Lab., Австрия), 1% смеси пенициллина и стрептомицина («ПанЭко», Россия), 1% L-глютамина. Кроме того, в ПРС добавляли 50 нг/мл рекомбинантного макрофаг-колониестимулирующего фактора (rM-CSF; Cloud-Clone, Китай). Получившуюся суспензию клеток помещали в лунки 6-ти луночного планшета или в чашки Петри (∅ 3 см) и культивировали в условиях CO₂-инкубатора (37 °C, 5% CO₂, относительная влажность 95%) в течение 7 дней. На вторые сутки культивирования из культуры убирали клетки, не прикрепившиеся к пластику, для чего полностью заменяли ПРС с добавлением rM-CSF на свежую порцию; частичную замену культуральной среды проводили также на 4-е сутки. Через 7 дней культивирования, перед введением животным, питательную среду, содержащую rM-CSF, полностью удаляли.

Иммуноцитохимическое окрашивание макрофагов

Для иммуноцитохимического окрашивания выделенных клеток часть из них (1,5–2,0 млн клеток в 500 мкл ПРС) распределяли на поверхности предметных стёкол, помещённых в чашки Петри. Через 1–2 часа добавляли необходимый объём ПРС, содержащей rM-CSF (50 нг/мл), и культивировали в условиях CO₂-инкубатора в течение 7 дней. На вторые сутки из культуры убирали клетки, не прикрепившиеся к пластику, для чего полностью заменяли ПРС с добавлением rM-CSF на свежую порцию; частичную замену культуральной среды проводили также на 4-е сутки культивирования. Через 7 дней стёкла двукратно промывали фосфатно-солевым буферным раствором (1 × PBS), фиксировали в ледяном метаноле в течение 2 мин с последующей фиксацией в 2% растворе параформальдегида (Panreac AppliChem, Германия) в течение 10 мин при комнатной температуре. Далее стёкла вновь промывали три раза в 1 × PBS для удаления остатков параформальдегида и наносили первичные антитела в разведении 1:200 в 1 × PBS: к CD68 (ab125212, Abcam, Великобритания), CD43 (#130-133-013, Miltenyi Biotec, Германия) и к маркеру гемопоэтических стволовых клеток — CD34 (#PAB18289, Abnova, Тайвань). Образцы инкубировали с первичными антителами в течение 24 часов при температуре +4 °С. Затем стёкла промывали в 1 × PBS для удаления остатков несвязанных антител и проводили реакцию со вторичными антителами, меченными FITC (ab97050, Abcam, Великобратания) в течение 1,5 часа при +37 °С. После инкубации и удаления излишков вторичных антител стёкла помещали в раствор DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, 1 мкг/мл в 1 × PBS; Servicebio, Китай) для окрашивания ядер, инкубировали 5 мин при +37 °С. Далее стёкла промывали в 1 × PBS, заключали в среду Aqua-Poly/ Mount (Polysciences Inc., США) и хранили при температуре +4 °С. Съёмку проводили с помощью прямого флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000 B (Leica Microsystems, Германия) и программного обеспечения LAS AF (v.3.1.0 build 8587; Leica Microsystems, Германия). Для каждого препарата делали микрофотографии 10 непересекающихся полей зрения, подсчёт количества флуоресцентно меченных клеток проводили в программе ImageJ (v.1.54p).

Определение уровней экспрессии генов в макрофагах

Для определения уровней экспрессии про- и противовоспалительных генов в МФ-ККМ и МФ-ПК через 7 дней культивирования удаляли культуральную среду и лизировали клетки в 1 мл реагента для выделения РНК Magzol (Magen Biotechnology, Китай). Образцы МФ-ККМ и МФ-ПК анализировали в трёх биологических повторах. Выделение РНК проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Первую цепь кДНК для определения уровней экспрессии генов IL-6, IL-10, IL-1β, NOS2, Arg1 и Nfkb1 получали из 1 мкг тотальной РНК с помощью набора M-Mlv kit (Evrogen JSC, Россия) согласно рекомендациям производителя. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР) проводили в объёме 25 мкл, содержащем: 400 нг кДНК матрицы, по 400 нМ прямого и обратного праймеров (табл. 1) и 5 × qPCRmixHS SYBR (Evrogen JSC, Россия). Все реакции проводили в трёх повторах в детектирующем амплификаторе DTprime ДТ96 (ООО «ДНК-технология», Россия). Специфичность полученного продукта проверяли с помощью анализа кривой плавления ПЦР-продукта в программном обеспечении Real Time PCR (ООО «ДНК-Технология», Россия). По кривой накопления сигнала флуоресценции определяли пороговые циклы (Ct) для всех исследуемых генов. Уровень относительной экспрессии генов рассчитывали по методу 2^(−ΔCt). Нормирование экспрессии каждого гена проводили на ген «домашнего хозяйства» β2-микроглобулин (β2M).

 

Таблица 1. Последовательности праймеров

Table 1. Primer sequences

Название гена	Прямой праймер (Forward)	Обратный праймер (Reverse)
IL-6	TACATATGTTCTCAGGGAGAT	GGTAGAAACGGAACTCCAG
IL-10	GCCCAGAAATCAAGGAGCAT	TGAGTGTCACGTAGGCTTCTA
IL-1β	CTGTCTGACCCATGTGAGCT	ACTCCACTTTGGTCTTGACTT
NOS2	CGCTGGTTTGAAACTTCTCAG	GGCAAGCCATGTCTGTGAC
Arg1	GGATGAGCATGAGCTCCAAG	GCCAGCTGTTCATTGGCTT
Nfkb1	AGAGCAACCGAAACAGAGAGG	TTTGCAGGCCCCACATAGTT
β2M	CTCGCTCGGTGACCGTGAT	GGACAGATCTGACATCTCGA

 

Статистические методы

Размер выборки

Расчёт размера выборки для in vivo эксперимента заранее не проводили. Размер групп был эмпирическим и определялся имеющимися ресурсами. Поскольку исследование носило пилотный характер, размер групп был минимально возможным.

Условия досрочного прекращения исследование не планировались. Исследование проведено в полном объёме.

Статистический анализ

Определение статистических различий в уровнях экспрессии генов между МФ-ПК и МФ-ККМ проводили в программе GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США) с использованием критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне p < 0,05. Для графического представления данные преобразовывали в диаграммы типа «min to max», включающие медиану и верхние/нижние экстремальные значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение зрелости и чистоты получаемой культуры макрофагов оценили с помощью иммуноцитохимического окрашивания на внутриклеточный пан макрофагальный лизосомально-ассоциированный мембранный белок CD68 и трансмембранный гликопротеин лейкосиалин — CD43 [15]. Окрашивание на оба маркера визуализировалось как в МФ-ККМ, так и в МФ-ПК (рис. 1, 2). При этом положительное окрашивание на маркер гемопоэтических стволовых клеток CD34 не выявлено (рис. 3).

 

Рис. 1. Экспрессия пан макрофагального маркера CD68: a — экспрессия CD68 (зелёная флуоресценция) в макрофагах, полученных из красного костного мозга (МФ из ККМ); b — экспрессия CD68 в макрофагах, полученных из периферической крови (МФ из ПК); c — графическое представление процентного содержания CD68-положительных клеток; синяя флуоресценция — ядра; увеличение ×400.

Fig. 1. Expression of the pan-macrophage marker CD68: a, CD68 expression (green fluorescence) in macrophages derived from red bone marrow (RBM-derived MPs); b, CD68 expression in macrophages derived from peripheral blood (PB-derived MPs); c, graphical representation of the percentage of CD68-positive cells; blue fluorescence: nuclei; magnification: ×400.

 

Рис. 2. Экспрессия маркера CD43 в макрофагах: a — экспрессия CD43 (красная флуоресценция) в макрофагах, культивированных из красного костного мозга (МФ из ККМ); b — экспрессия CD43 в макрофагах, культивированных из периферической крови (МФ из ПК); c — графическое представление процентного содержания CD43-положительных клеток; синяя флуоресценция — ядра; увеличение ×400.

Fig. 2. Expression of the CD43 marker in macrophages: a, CD43 expression (red fluorescence) in macrophages cultured from red bone marrow (RBM-derived MPs); b, CD43 expression in macrophages cultured from peripheral blood (PB-derived MPs); c, graphical representation of the percentage of CD43-positive cells; blue fluorescence: nuclei; magnification: ×400.

 

Рис. 3. Отсутствие экспрессии маркера CD34 в макрофагах: a — полученных из красного костного мозга; b — полученных из периферической крови; синяя флуоресценция — ядра; увеличение ×400.

Fig. 3. Absence of CD34 marker expression in macrophages: a, derived from red bone marrow; b, derived from peripheral blood; blue fluorescence: nuclei; magnification: ×400.

 

Таким образом, и из красного костного мозга, и из периферической крови были выделены моноциты, которые в присутствии видоспецифического макрофагального колониестимулирующего фактора (rM-CSF) дифференцировались в макрофаги.

На следующем этапе в интактных макрофагах из обоих источников сравнили относительные уровни экспрессии генов, кодирующих регуляторные цитокины (IL-6 и IL-10), провоспалительный цитокин IL-1β (IL-1β), субъединицу p50 транскрипционного фактора Nf-κb (Nfkb1), аргиназу-1 (Arg1) и индуцибельную NO-синтазу (NOS2). Уровни экспрессии генов IL-10 и IL-6 статистически значимо выше в МФ-ККМ, чем в МФ-ПК (р = 0,027 и р = 0,029 соответственно); экспрессия Arg1 и NOS2, напротив, была выше в МФ-ПК (р = 0,029 для обоих генов; рис. 4, 5). Не выявлено статистически значимых различий в уровне экспрессии генов IL-1β и Nfkb1.

 

Рис. 4. Относительная экспрессии генов, кодирующих индуцибельную синтазу оксида азота (NOS2) и аргиназу-1 (Arg1) в макрофагах: МФ из ККМ — макрофаги, полученные из красного костного мозга; МФ из ПК — макрофаги, полученные из периферической крови; Критерий Манна–Уитни, * p < 0,05.

Fig. 4. Relative expression of genes encoding inducible nitric oxide synthase (NOS2) and arginase-1 (Arg1) in macrophages: RBM-derived MPs, macrophages derived from red bone marrow; PB-derived MPs, macrophages derived from peripheral blood; Mann–Whitney U test, * p < 0.05.

 

Рис. 5. Относительная экспрессия генов, кодирующих интерлейкин-10 (IL-10) и интерлейкин-6 (IL-6) в макрофагах: МФ из ККМ — макрофаги, полученные из красного костного мозга; МФ из ПК — макрофаги, полученные из периферической крови; Критерий Манна–Уитни, * p < 0,05.

Fig. 5. Relative expression of genes encoding interleukin-10 (IL-10) and interleukin-6 (IL-6) in macrophages: RBM-derived MPs, macrophages derived from red bone marrow; PB-derived MPs, macrophages derived from peripheral blood; Mann–Whitney U test, * p < 0.05.

 

Одной из ключевых функций МФ является участие в процессах регенерации, в том числе в заживлении ран кожи. Оценка эффектов МФ, полученных из двух источников, на заживление ран показала, что на следующий день после введения МФ-ПК по краям раны визуализировался выпот желтоватого цвета, а у крыс после инъекции МФ-ККМ рана кровоточила (данные не представлены). На 7-й день после воздействия края ран у крыс контрольной группы спокойные, рана не гиперемирована; у животных, которым вводили МФ-ККМ, отмечалась повышенная кровоточивость. На 14-й день — у крыс контрольной группы струп не визуализировался; у крыс, которым вводили МФ-ПК и МФ-ККМ струп начал отпадать, однако у животных после введения МФ-ККМ отмечена повышенная гиперемия (рис. 6). Таким образом, введение макрофагов существенно не изменило темпы заживления ран кожи (рис. 7). Тяжёлых побочных эффектов после введения МФ не выявлено, однако при использовании МФ-ККМ отмечена высокая кровоточивость ран.

 

Рис. 6. Репрезентативные фотографии ран у крысы контрольной группы и у животных, которым вводили макрофаги, культивированные из периферической крови (МФ из ПК) и из красного костного мозга (МФ из ККМ), на 0, 7 и 14-е сутки после моделирования эксцизионной раны.

Fig. 6. Representative images of wounds in control rats and in animals treated with macrophages cultured from peripheral blood (PB-derived MPs) and red bone marrow (RBM-derived MPs) on days 0, 7, and 14 after excisional wound modeling.

 

Рис. 7. Изменение размера раны с течением времени: контроль — крысы, у которых рана оставалась интактной; МФ из ККМ — крысы, которым вводили макрофаги, полученные из моноцитарных предшественников красного костного мозга; МФ из ПК — крысы, которым вводили макрофаги, полученные из моноцитов периферической крови.

Fig. 7. Changes in wound size over time: Control, rats with untreated wounds; RBM-derived MPs, rats treated with macrophages derived from bone marrow monocyte precursors; PB-derived MPs, rats treated with macrophages derived from peripheral blood monocytes.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме результатов исследования

Впервые проведено сравнение уровней экспрессии генов, кодирующих цитокины, и участия макрофагов, полученных из двух источников — костного мозга и периферической крови — в заживлении ран кожи. Определение фенотипа МФ, культивированных в присутствии видоспецифического ростового фактора, показало отсутствие различий в экспрессии панмакрофагального маркера CD68 и панлейкоцитарного маркера CD43.

При определении уровней экспрессии генов, ассоциированных с иммунным ответом, а именно генов регуляторных цитокинов IL-6 и IL-10, выявлены значимые различия между МФ-ККМ и МФ-ПК. Макрофаги, полученные из ККМ, демонстрировали высокий уровень экспрессии генов IL-6 и IL-10, что, вероятно, указывает на их повышенный потенциал к быстрой активации в ответ на сигналы микроокружения. В то же время, в МФ-ПК повышена экспрессия генов, кодирующих ферменты, участвующие в превращениях L-аргинина (Arg1 и NOS2) и отражающие способность макрофагов влиять на регенеративные процессы в тканях.

На экспериментальной модели послойной эксцизионной раны кожи спины показано, что несмотря на отсутствие различий в темпах регенерации, при введении в края раны МФ-ККМ и МФ-ПК наблюдаются особенности тканевых реакций. Применение МФ-ККМ сопровождалось повышенной кровоточивостью раны и её гиперемией. Однако отсутствие тяжёлых осложнений свидетельствует о приемлемой безопасности обоих типов клеток при их применении in vivo.

Полученные результаты указывают на гетерогенность макрофагов, культивированных из ККМ и ПК, а также обосновывают преимущества использования МФ-ПК при разработке клеточной терапии заживления ран кожи.

Интерпретация результатов исследования

Макрофаги представляют большой интерес для клеточной терапии различных заболеваний. Несмотря на то, что изучением этих клеток занимаются уже более 100 лет, до сих пор не существует стандартного протокола их культивирования. В качестве фактора дифференцировки моноцитов в макрофаги используют M-CSF человека или кондиционированную среду клеток линии L929-CM, обогащённую M-CSF [16, 17]. Различия в условиях культивирования приводят не только к вариабельности результатов, но и обусловливают необходимость подтверждения экспрессии ключевых маркеров макрофагов в полученных популяциях клеток. В данной работе дифференцировка моноцитов в макрофаги проведена в присутствии рекомбинантного видоспецифического макрофагального колониестимулирующего фактора rM-CSF. Макросиалин (CD68) и лейкосиалин/сиалофорин (CD43) были использованы для идентификации полученных клеток [18]. CD68 — высокогликозилированный гликопротеин, конститутивно экспрессирующийся в макрофагах [18]. Показана его связь с лизосомальными белками, что указывает на участие в процессах фагоцитоза [18]. Несмотря на то, что роль CD68 в функционировании макрофагов остаётся не до конца изученной, в исследовательской и клинической практике этот маркер используют для обнаружения и количественной оценки макрофагов в различных тканях, включая очаги воспаления и опухоли [19]. При опухолях, например при раке молочной железы, инфильтрация CD68⁺ клетками коррелирует с клиническими исходами [19].

Лейкосиалин обнаруживается на поверхности Т-лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и макрофагов. Основная функция лейкосиалина в функционировании моноцитов и макрофагов — это участие в адгезии и миграции клеток, а также в их дифференцировке и апоптозе [20]. По уровню экспрессии CD43 в популяции моноцитов крысы, как и у человека, выделяют два подтипа клеток — CD43^high (неклассические моноциты) и CD43^low (классические). Первый подтип является мажорным и составляет 90% всех моноцитов; клетки второго подтипа характеризуются высоким уровнем экспрессии CD200R — рецептора к мембранному белку CD200, выступающему костимулятором пролиферации T-лимфоцитов. CD200R участвует в регуляции продукции провоспалительных факторов TNFα и NO [21]. Отмечено, что макрофаги в меньшей степени, чем моноциты экспрессируют CD43, однако CD43 на их поверхности представлен высокогликозилированной изоформой [22].

Таким образом, экспрессия CD68 и CD43 в макрофагах, культивированных из периферической крови и костномозговых предшественников, говорит о том, что при воздействии видоспецифического фактора роста, а именно макрофагального колониестимулирующего фактора крыс, моноциты из обоих источников дифференцируются в макрофаги.

Две популяции макрофагов оценили по относительной экспрессии (относительно гена домашнего хозяйства бета-2-микроглобулина) генов, кодирующих провоспалительный цитокин IL-1β, транскрипционный фактор Nf-κb, регуляторные цитокины IL-6 и IL-10 и ферменты, участвующие в обмене L-аргинина — аргиназу-1 и индуцибельную синтазу оксида азота. IL-10 — это плейотропный цитокин, секретируемый практически всеми типами иммунных клеток, включая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы и NK-клетки. IL-10 взаимодействует со своим специфическим рецептором на поверхности макрофагов и тем самым инициирует активацию сигнальных путей STAT3 и PI3K/ Akt/mTORC1. Этот механизм обусловливает противовоспалительный эффект IL-10, проявляющийся в модификации локального цитокинового окружения, уменьшении представления антигенов, а также в снижении продукции оксида азота и активных форм кислорода. Кроме того, IL-10 способствует изменению клеточного метаболизма и направляет его преимущественно в сторону окислительного фосфорилирования [23]. Однако в условиях хронического воспаления высокий уровень IL-10 приводит к персистенции патогена и повреждению тканей [24]. Первоначально IL-6 был описан как провоспалительный цитокин, однако более поздние исследования показали, что он участвует в формировании противовоспалительного фенотипа макрофагов. IL-6 способствует поляризации макрофагов в направлении, характеризующемся повышенной экспрессией таких маркеров, как аргиназа-1, хитиназоподобный белок Ym1 (Chil3) и маннозный рецептор CD206 [25]. Реализация этого эффекта часто требует костимуляции интерлейкинами IL-4 и IL-13 [26]. Кроме того, IL-6 может подавлять продукцию оксида азота, индуцированную липополисахаридом внешней стенки грамотрицательных бактерий, и ингибировать продукцию цитокинов активированными CD4⁺ T-клетками, то есть выполнять иммунорегуляторные функции [26]. Для МФ-ККМ показан конститутивно высокий уровень экспрессии гена IL- 6, необходимого для кроветворения, что согласуется с нашими результатами [27]. Таким образом, учитывая роль IL-6 и IL-10 в развитии и разрешении воспалительных реакций, высокий уровень экспрессии этих генов в МФ-ККМ может отражать исходно повышенную функциональную активность клеток, способствующую более быстрому реагированию на внешние воздействия.

В результате проведённого исследования установлено, что экспрессия генов, вовлечённых в превращение L-аргинина — NOS2 и Arg1, — значимо повышена в МФ- ПК. Условно незаменимая аминокислота L-аргинин играет важную роль в заживлении ран кожи как напрямую, так и опосредованно через изменение фенотипа макрофагов. В первом случае индуцируемая синтаза оксида азота (NOS2) катализирует окисление L-аргинина до оксида азота и цитруллина. NO усиливает антимикробную активность, способствует вазодилатации и улучшает приток крови к ране, облегчая тем самым доставку кислорода и питательных веществ, необходимых для восстановления тканей. Аргиназа участвует в гидролизе L-аргинина — отщепляет от него мочевину с образованием L-орнитина, из которого впоследствии образуется L-пролин. Пролин является важной аминокислотой для синтеза коллагена, необходимого для поддержания структуры и функций соединительной ткани (кожи, костей и хрящей) и играющего ключевую роль в формировании новой ткани [28, 29].

В контексте настоящего исследования наибольший интерес представляет опосредованное через поляризацию макрофагов участие условно незаменимой аминокислоты L-аргинина в заживлении ран кожи. Известно, что для провоспалительного фенотипа МФ в очаге воспаления характерен повышенный уровень экспрессии NOS2, тогда как для противовоспалительного фенотипа МФ в пролиферативной и регенераторной фазах заживления ран кожи — аргиназы-1 [30]. Таким образом, баланс между активностью NOS2 и Arg1 в процессах превращения аминокислоты L-аргинина определяет эффективность регенерации тканей и зависит от поляризации МФ.

У животных с послойной эксцизионной раной кожи после введения макрофагов в зону повреждения не выявлено увеличения темпов заживления, однако отмечены различия в локальной реакции. У крыс, которым в края раны вводили МФ-ККМ, наблюдали повышенную кровоточивость и гиперемию. Возможно, что такая тканевая реакция связана с более высокой исходной функциональной активностью МФ-ККМ, поскольку нами показан повышенный уровень экспрессии генов, кодирующих регуляторные цитокины IL-10 и IL-6 в этих клетках. Можно предположить, что при попадании в очаг воспаления МФ поляризуются в провоспалительные клетки и усиливают воспалительную реакцию, что приводит к гиперемии и кровоточивости. С другой стороны, при введении в края раны МФ-ПК с высоким базовым уровнем экспрессии гена аргиназы-1 происходит усиленная секреция пролина, необходимого для регенерации. Отсутствие тяжёлых побочных эффектов от введения макрофагов в обеих опытных группах свидетельствует о хорошей переносимости клеточной терапии. Вместе с тем выявленные визуальные различия указывают на необходимость дальнейшего изучения того, как источник выделения макрофагов влияет на их участие в регенеративных процессах [31].

В проведённом исследовании обнаружены значимые различия между МФ-КММ и МФ-ПК по уровням экспрессии генов, участвующих в иммунных реакциях. При этом, несмотря на сходный фенотип (экспрессию CD68 и CD43), МФ-ККМ характеризуются более высокой экспрессией генов регуляторных цитокинов IL-6 и IL-10, что указывает на повышенный потенциал к активации. В то же время для МФ-ПК характерна более значительная экспрессия генов, связанных с превращениями L-аргинина (Arg1, NOS2), что отражает их потенциальную роль в репаративных процессах. Различия в уровнях экспрессии генов между двумя опытными группами согласуются с результатами, полученными in vivo. Наблюдавшиеся гиперемия и кровоточивость раны после введения МФ-ККМ, вероятно, связаны с провоспалительной активацией этих клеток в раневом микроокружении. В то же время МФ-ПК предположительно способствуют репаративным процессам за счёт продукции пролина и регуляции метаболизма L-аргинина.

Полученные данные свидетельствуют о значительном потенциале макрофагов, культивируемых из периферической крови, для разработки методов лечения ран кожи. МФ-ПК характеризуются потенциальной способностью улучшать регенерацию тканей и более низкой провоспалительной активностью. Однако для экстраполяции полученных результатов на человека необходимы дальнейшие исследования, которые будут включать гистологическую детализацию процессов восстановления целостности кожных покровов при введении макрофагов, а также подбор оптимального количества вводимых клеток.

Ограничения исследования

Данное исследование имеет ряд ограничений. В связи с ограниченностью ресурсов в исследование не включена группа животных, которым в края раны вводили бы только кондиционированную среду без клеток. Весомым недостатком in vivo эксперимента является проведение только визуального осмотра животных. Для подтверждения полученных результатов необходимы дополнительные исследования с увеличением количества групп животных и применением дополнительных методов оценки процесса заживления ран, таких как гистологическое исследование.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённое исследование позволило охарактеризовать молекулярно-биологические особенности макрофагов, полученных из двух источников — красного костного мозга и периферической крови, а также оценить их терапевтический потенциал в модели послойной эксцизионной раны кожи спины. Ключевым результатом исследования стало выявление различий в экспрессии генов, регулирующих иммунный ответ и метаболические процессы. МФ-ККМ характеризуются повышенной экспрессией генов регуляторных цитокинов (IL-6 и IL-10), что свидетельствует о более высоком потенциале этих клеток к быстрой активации в ответ на изменения микроокружения. В то же время МФ-ПК проявляли более высокую активность генов, кодирующих ферменты, участвующие в преобразованиях L-аргинина (Arg1 и NOS2), что отражает способность этих клеток влиять на процессы регенерации тканей. Полученные данные согласуются с представлениями о функциональной пластичности макрофагов и зависимости их активности от источника происхождения. Экспериментальная апробация МФ в модели послойной эксцизионной раны кожи спины не выявила значимого увеличения темпов заживления, однако продемонстрировала различия в локальной реакции тканей. Введение МФ-ККМ сопровождалось кровоточивостью раны и гиперемией прилежащих тканей, что, вероятно, связано с провоспалительным потенциалом этих клеток. Вместе с тем отсутствие тяжёлых осложнений свидетельствует о безопасности применения обоих типов МФ. Таким образом, полученные результаты подчёркивают важность выбора источника получения макрофагов для клеточной терапии и подтверждают потенциальную возможность их использования при лечении нарушений заживления ран у человека. Необходимы дополнительные исследования, направленные на оптимизацию клеточного продукта и включающие апробацию применения обоих типов МФ на разных фазах раневого процесса (острое воспаление или репарация), использование клеток, модифицированных in vitro, а также определение оптимальной дозы введения.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. В.В. Киселева — определение концепции, проведение исследования, написание черновика рукописи; П.А. Вишнякова — определение концепции, руководство исследованием; И.С. Цветков — проведение исследования; А.М. Косырева — определение концепции, руководство исследованием, пересмотр и редактирование рукописи; А.В. Ельчанинов и Т.Х. Фатхудинов — руководство исследованием, обеспечение исследования, администрирование. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Исследование проведено в соответствии с решением Этического комитета НИИ морфологии человека им. А.И. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского», протокол № 21 от 29 марта 2019 г. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с рекомендациями ARRIVE и Директивой ЕС 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях [13]. Были приложены все усилия для минимизации страданий и дистресса животных.

Источники финансировании. Работа поддержана Российским научным фондом (номер гранта 24-25-00203).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: V.V. Kiseleva: conceptualization, investigation, writing — original draft; P.A. Vishnyakova: conceptualization, supervision; I.S. Tsvetkov: investigation; A.M. Kosyreva: conceptualization, supervision, writing — review & editing; A.V. Elchaninov: supervision, resources, project administration; T.Kh. Fatkhudinov: supervision, resources, project administration. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was conducted in accordance with the decision of the Ethics Committee of the Research Institute of Human Morphology named after A.I. Avtsyn, Petrovsky Russian Research Center of Surgery, Minutes No. 21 dated March 29, 2019. All animal procedures were performed in accordance with the ARRIVE guidelines and Directive 2010/63/EU of the European Parliament on the protection of animals used for scientific purposes [13]. All efforts were made to minimize animal suffering and distress.

Funding sources: The study was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 24-25-00203).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in the article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This article was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer-review process involved two external reviewers, a member of the Editorial Board, and the in-house science editor.

About the authors

Viktoriia V. Kiseleva

Peoples' Friendship University of Russia; Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Author for correspondence.
Email: victoria.kurnosova.1991@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3001-4820
SPIN-code: 2698-1448
Russian Federation, Moscow; Moscow

Polina A. Vishnyakova

Peoples' Friendship University of Russia; Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vpa2002@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8650-8240
SPIN-code: 3406-3866

Cand. Sci. (Biology), Assistant Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Ivan S. Tsvetkov

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: davedm66@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0946-1105
SPIN-code: 6842-0264

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

Andrey V. Elchaninov

Peoples' Friendship University of Russia; Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: elchandrey@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2392-4439
SPIN-code: 5160-9029

Dr. Sci. (Biology), Assistant Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

Anna M. Kosyreva

Peoples' Friendship University of Russia; Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: kosyreva.a@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-6182-1799
SPIN-code: 5421-5520

Dr. Sci. (Biology), Assistant Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Timur Kh. Fathudinov

Peoples' Friendship University of Russia; Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: tfat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6498-5764
SPIN-code: 7919-8430

Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files