Cytokine gene expression and wound healing potential of macrophages derived from rat red bone marrow and peripheral blood

Full Text

Введение

Макрофаги (МФ) - клетки врожденного иммунитета, представляющие большой интерес для исследователей ввиду участия как физиологических, так и в патологических состояниях. Описано участие макрофагов, как ключевых звеньев патогенеза, при таких патологиях как острый респираторный дистресс синдром, преэклампсия, атеросклероз и др. [1–4]. Использование МФ для клеточной терапии имеет неограниченный потенциал, о чем говорит наличие зарегистрированных клинических исследований [5].

Неотъемлемой частью изучения функционирования МФ, воздействия на них различных веществ и их использования в качестве терапевтического агента является этап с использованием животных моделей. Крысы, ввиду относительно большого размера и простоты обращения, являются удобными для изучения влияния адоптивного переноса макрофагов для клеточной терапии. Красный костный мозг (ККМ) - источник прогениторных клеток, позволяющий сразу получить большое количество макрофагов. Однако, выделение красного костного мозга связано с выведением животного из эксперимента, а применение таких МФ несмотря на линейность животных тем не менее может привести к активации иммунной системы реципиента. Альтернативным источником получения МФ может служить периферическая кровь (ПК). В данном случае, животное из эксперимента не выводится и может быть использовано для аутологичного введения макрофагов, что приведет к снижению количества животных, используемых для экспериментов [6, 7].  Считается, что макрофаги человека, полученные путем CD14+ селекции из ККМ и ПК демонстрируют схожие профили экспрессии генов и функциональную активность[8]. Однако для крыс область прямых сравнительных исследований уровней экспрессии генов и функциональной активности между МФ из ККМ и МФ из ПК остается малоизученной. Большинство данных получены в результате межвидовых анализов или сфокусированы на конкретных субпопуляциях (например, перитонеальных макрофагах).

Таким образом целью данной работы стало, сравнение макрофагов, культивированных из красного костного мозга (МФ ККМ), и макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови (МФ ПК), на генном и функциональном уровнях для потенциального использования в качестве аутологичного источника клеток.

Материалы и методы

Этическое разрешение

Все манипуляции с животными проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE и Директивой ЕС 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях [9]. Получено одобрение Комитета по биоэтике НИИ морфологии человека им. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» (протокол № 21 от 29 марта 2019 г.).

Животные

Исследование проведено на 12 самцах крыс линии Sprague-Dawley (SD) массой тела 250 (±30г), полученных из питомника Отраслевого института биологической химии РАН (г. Пущино). 3 животных использованы для выделения моноцитов из красного костного мозга после проведения эвтаназии изофлураном. 9 крысам моделировали и лечили рану, а также производили забор периферической крови из хвостовой вены как для проведения анализов так и в целях последующего ведения. Все животные содержались в полипропиленовых клетках (по 4 крысы в ​​клетке) в помещениях с контролируемой температурой (20 ± 2 °C) и влажностью (40-60 %) при обратном цикле свет/темнота (12/12 ч). Животные имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму (ПК-120-1; ООО «Лабораторснаб», Россия). Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000г, а также с рекомендациями ARRIVE и Директивой ЕС 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях [9]. Были приложены все усилия для минимизации страданий и дистресса животных. Получено разрешение Биоэтического комитета НИИ морфологии человека им. А.И. Авцына ФГБНУ «НМИЦ хирургии им. акад. И.М. Петровского» (протокол № 21 от 29 марта 2019 г.).

Культивирование макрофагов из красного костного мозга

Выделение моноцитов из красного костного мозга проводили путем градиентного центрифугирования по методике описанной [10]. После отделения бедренных костей самцов крыс SD, удаляли эпифизы и диафиз промывали раствором Хенкса (ПанЭко, Россия), содержащим 1000 МЕ/мл гепарина (Синтез, Россия). Полученную суспензию центрифугировали (400g, 30 мин., 20°С) на градиенте плотности препарата Фиколл (1,09 г/см3) (ПанЭко, Россия). Отбирали фракцию мононуклеарных клеток и промывали двукратным центрифугированием при 300g в течение 20 мин. при 20°С в растворе Хенкса. Полученный осадок клеток растворяли в растворе Хенкса и оценивали количество и жизнеспособность клеток по включению трипанового синего на анализаторе TC20 (Bio-Rad, США). По 2-3 млн клеток в объеме 3-4 мл полной ростовой среды (ПРС) ((RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) + 10% фетальной телячьей сыворотки (PAA Lab., Австрия) + 1% пенициллина-стрептомицина (ПанЭко, Россия) + 1% L-глютамина) с добавлением + 50 нг/мл rMCSF (Cloud Clone))) помещали в лунки 6-ти луночного планшета или 3 см чашки Петри и культивировали в условиях CO2-инкубатора (37°C, 5% CO2) 7 дней. На вторые сутки из культуры убирали клетки, не прикрепившиеся к пластику. Частичную замену культуральной среды проводили на 4 сутки. Через 7 дней проводили исследования.

Получение и характеристика макрофагов из периферической крови крысы

Выделение моноцитов из периферической крови и культивирование макрофагов проводили после забора крови из хвостовой вены под глубоким иньекционным наркозом (Золетил, Франция). Фракцию мононуклеарных клеток получали методом градиентного центрифугирования (400g, 40 мин, 20°C, пауза 0) на препарате Фиколл плотностью 1,09 г/см3 (ПанЭко, Россия). После двукратного промывания (300g, 10 мин, 20°C) раствором Версена (ПанЭко, Россия) жизнеспособность и количество клеток оценивали на анализаторе TC20 (Bio-Rad, США) с использованием Трипанового синего 0,04%. По 2-3 млн клеток в объеме 3-4 мл ПРС с добавлением 50 нг/мл rMCSF (Cloud Clone) помещали в лунки 6-ти луночного планшета или 3см чашки Петри. Культивировали в условиях CO2-инкубатора (37°C, 5% CO2) 7 дней. На вторые сутки из культуры убирали клетки, не прикрепившиеся к пластику. Частичную замену культуральной среды проводили на 4 сутки. Через 7 дней проводили исследования.

Иммуноцитохимическое окрашивание (ИЦХ)

Для проведения ИЦХ по 1.5-2 млн клеток в объеме 500 мкл распределяли на предметных стеклах, помещенных в чашки Петри. Через 1-2 часа добавляли необходимый объем ПРС с добавлением 50 нг/мл rMCSF (Cloud Clone)) и культивировали в условиях CO2-инкубатора (37°C, 5% CO2) 7 дней. На вторые сутки из культуры убирали клетки, не прикрепившиеся к пластику. Частичную замену культуральной среды проводили на 4 сутки. Через 7 дней стекла двукратно промывали раствором 1x PBS, фиксировали ледяным метанолом в течение 2х минут с последующей фиксацией 2% раствором параформальдегида в течение 10 мин на комнатной температуре. Далее стекла промывали три раза 1x PBS для удаления остатков параформальдегида и наносили первичные антитела в 1x PBS в разведении 1:200. Использовали первичные антитела к CD68 (Abcam, Ab125212). Также использовали антитела к CD43 (Miltenyi Biotech, #130-133-013) Проводили также оценку наличия маркера гемопоэтических стволовых клеток - CD34. Через 24 часа инкубирования с первичными антителами при +4С, 1хPBS использовали для удаления остатков несвязанных антител и проводили окрашивание вторыми антителами в течение 1.5 часа при +37С. После удаления излишков вторых антител стекла помещали в раствор DAPI (1 мкг/мл 1хPBS) для окрашивания ядер. Через 5 мин инкубирования при +37С промывали стекла, заключали раствором Aqua-Poly/Mount (Polysciences) и помещали на +4С. Флуоресцентную микроскопию проводили через 24 часа на приборе Leica.

Выделение РНК, получение кДНК и ПЦР с детекцией в режиме реального времени

Для определения уровней экспрессии про- и противовоспалительных генов в МФ из ККМ и ПК 2-3*10^⁶ мононуклеарных клеток, после выделения на градиенте плотности, помещали в каждую лунку 6-ти луночного планшета в объеме 3 мл ПРС с добавлением 50 нг/мл rMCSF. Через 7 дней, убирали культуральную среду и лизировали клетки 1 мл реагента для выделения РНК Magzol (Magen, Китай). МФ из ККМ и МФ из ПК анализировали в трех биологических повторах. Далее проводили выделение в соответствии с рекомендациями производителя. Первую цепь кДНК для определения уровней экспрессии генов получали из 1 мкг тотальной РНК с помощью наборов M-Mlv kit (Evrogen, Россия) согласно рекомендациям производителя. ПЦР в реальном времени проводили в объёме 25 мкл, содержащем 400 нг кДНК матрицы, по 400 нМ прямого и обратного праймеров и 5х qPCRmixHS SYBR (Евроген, Россия). Все реакции проводили в трех повторах. Реакцию проводили в детектирующем амплификаторе DTprime ДТ96 (ДНК-технология, Россия). Специфичность полученного продукта проверяли с помощью анализа кривой плавления ПЦР-продукта в программном обеспечении Real Time PCR (ДНК-Технология, Россия). По кривой накопления сигнала флуоресценции определяли пороговые циклы (Ct) для всех исследуемых генов. Уровень относительной экспрессии генов рассчитывали по 2^(-ΔCt) методу. Нормирование экспрессии каждого гена проводили на ген «домашнего хозяйства» beta-2 microglobulin. Последовательности праймеров, использованные в работе, указаны в Таблице 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров

Прямой праймер (Forward)	Обратный праймер (Reverse)
IL6
TACATATGTTCTCAGGGAGAT	GGTAGAAACGGAACTCCAG
IL10
GCCCAGAAATCAAGGAGCAT	TGAGTGTCACGTAGGCTTCTA
IL1 beta
CTGTCTGACCCATGTGAGCT	ACTCCACTTTGGTCTTGACTT
NOS2
CGCTGGTTTGAAACTTCTCAG	GGCAAGCCATGTCTGTGAC
ARG-1
GGATGAGCATGAGCTCCAAG	GCCAGCTGTTCATTGGCTT
NF-kb
AGAGCAACCGAAACAGAGAGG	TTTGCAGGCCCCACATAGTT
b2m
CTCGCTCGGTGACCGTGAT	GGACAGATCTGACATCTCGA

Модель раны

9 самцам крыс SD массой тела 250 (±30г) делали глубокую рану и рандомно делили на 3 группы по 3 животных в каждой: контрольная группа – рана оставалась интактной, МФ из ПК – в края раны вводили макрофаги, культивированные из периферической крови в объеме 200 мкл кондиционированной культуральной, МФ из ККМ -  в края раны вводили макрофаги, культивированные из красного костного мозга в объеме 200 мкл кондиционированной культуральной среды. Манипуляции проводили в состоянии глубокого инъекционного наркоза (Золетил, Франция).   Введение клеток в культуральной среде проводили инсулиновой иглой. Оценивали состояние раны на 7 и 14 день.

Статистический анализ

Статистический анализ был проведен в программе Prism 8.0 (GraphPad, США) с использованием теста Шапиро-Вилка для оценки нормальности распределения, критерием t-test для попарного сравнения. Различия считались статистически достоверным при уровне значимости p < 0.05. Для графического представления данные были преобразованы в диаграммы типа «min to max», включающие медиану и верхние/нижние максимальные значения.

Результаты

Определение зрелости и чистоты получаемой культуры макрофагов из двух источников оценивали иммуноцитохимически по наличию экспрессии внутриклеточного пан макрофагального лизосомально-ассоциированного мембранного белка CD68 и трансмембранной молекулы гликопротеина лейкосиалина - CD43[11]. Оба маркера определялись как в макрофагах, культивируемых из костного мозга так и в макрофагах, культивируемых из периферической крови (Рис. 1-2).

Рис.1. Экспрессия пан макрофагального маркера CD68 в макрофагах, культивированных из красного костного мозга (А) и периферической крови (Б). Увеличение 400х.

Рис. 2.  Экспрессия маркера CD43 в макрофагах, культивированных из красного костного мозга (А) и периферической крови (Б). Увеличение 400х.

Таким образом, и из костного мозга, и из периферической крови были выделены моноциты, которые в присутствии видоспецифического макрофагального колониестимулирующего фактора (rMCSF) дифференцировались в макрофаги.

Клетки, стоящие на первой линии обороны организма от внешних воздействий, макрофаги, всегда готовы молниеносно отвечать на вторжение извне, поэтому даже в физиологических условиях они имеют некоторую степень активации. Показано, например, что альвеолярные макрофаги и клетки Хофбауэра имеют фенотип близкий к противовоспалительному [2, 8]. Поэтому на следующем этапе было решено сравнить в интактных макрофагах, культивированных из двух источников, относительные уровни экспрессии генов регуляторных (интерлейкинов 6 и 10) и провоспалительного цитокина (ИЛ1 бета), транскрипционного фактора Nf-kb и генов аргиназы 1 (Arg1) и индуцибельной NO – синтазы (NOS2). Уровни экспрессии генов IL10 и IL6 были значимо выше в МФ ККМ (непарный           t-тест, р (IL6) <0,0001, р (IL10) <0,0001), а Arg1 и Nos2 (непарный      t-тест, р (Arg1) <0,0001, р (Nos2) = 0,0001) были выше в макрофагах, культивируемых из ПК (Рис.3). Не было выявлено значимых различий для генов IL1beta и Nf-kb.

Рис. 3. Относительные уровни экспрессии генов IL10, IL6, Arg1 и Nos2 в макрофагах, культивируемых из красного костного мозга (МФ ККМ) и периферической крови (МФ ПК). Непарный t-тест, p < 0.05.

Полученный результат отражает повышенную способность к быстрой активации под действием микроокружения МФ, культивируемых из красного костного мозга по сравнению с МФ из периферической крови. С другой стороны, в МФ из ПК наиболее активны гены, вовлеченные в метаболические процессы.

 

Одной из ключевых функций макрофагов является участие в регенераторных процессах, в том числе в ранозаживлении. Оценку отсутствия тяжелых нежелательных осложнений, таких как нагноение, при использовании макрофагов, культивированных из двух источников, проводили после введения клеток в культуральной среде в края раны. На следующий день после введения МФ из ПК по краям раны у крыс с инъекцией визуализировался выпот желтоватого цвета, при этом у животных получивших МФ из ККМ рана кровоточила (данные не представлены). На 7 день края ран у контрольной группы спокойные, рана не гиперемирована, а животных, которым вводили МФ из ККМ, отмечалась повышенная кровоточивость. На 14 день у контрольной группы струп не визуализировался. В группе введения МФ из ПК и МФ из ККМ в это же время струп начал отпадать, однако после введения клеток, культивированных из красного костного мозга, отмечалась повышенная гиперемия (Рис.4). Таким образом, в данном эксперименте введение макрофагов, не привело к ускорению ранозаживления.  Ярких побочных эффектов, таких как нагноение также не было выявлено, однако при использовании МФ из ККМ отмечена высокая кровоточивость раны. 

Рис.4. Репрезентативные фотографии ран контрольных животных и крыс, которым вводили макрофаги, культивированные из периферической крови (МФ из ПК) и из красного костного мозга (МФ из ККМ) в день моделирования раны, через 7 и  14 дней.

Обсуждение

Макрофаги представляют большой интерес для клеточной терапии различных заболеваний. Не смотря на то что их изучением занимаются уже более 100 лет до настоящего момента нет стандартного протокола для культивирования клеток. В качестве фактора дифференцировки моноцитов в макрофаги используют МКСФ человека, кондиционированную среду клеток линии L929-CM, обогащенную МКСФ [12, 13]. Такие различия в условиях культивирования приводят не только к вариабельности получаемых результатов, но и обусловливают необходимость подтверждения наличия ключевых маркеров макрофагов. В данной работе для этих целей были использованы панмакрофагальный маркер CD68 и панлейкоцитарный маркер CD43 [11]. Наличие их экспрессии как на макрофагах, культивированных из костномозговых предшественников так и на клетках, полученных из периферической крови, говорит о том, что условия (видоспецифичный фактор роста) культивирования оптимальны.

Далее две популяции макрофагов оценивали по относительным к гену домашнего хозяйства бета 2 микроглобулина (b2m) уровням экспрессии генов провоспалительного цитокина интелейкина 1 бета (IL1beta) и гена транскрипционного фактора Nf-kb; генам регуляторных цитокинов интерлейкина 6 и 10 (IL6 и IL10) и генов ферментов, участвующих в обмене L-аргинина -  аргиназы 1 (Arg1) и индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2). ИЛ10 - плейотропный цитокин, секретируемый практически всеми типами иммунных клеток (Т - и В-лимфоциты, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы и NK клетки). ИЛ10 взаимодействуя со своим специфичным рецептором на поверхности МФ, активирует STAT3 и PI3K/Akt/mTORC1 сигнальные пути, результатом чего является противовоспалительное действие этой молекулы, выражающееся в изменении местного цитокинового микроокружения, снижение презентации антигенов и выработки оксида азота и реактивных форм кислорода, а также способствует сдвигу метаболизма в сторону окислительного фосфорилирования [14]. Однако, в условиях хронического воспаления высокий уровень ИЛ10 приводит к персистенции патогена и повреждению тканей [15]. Первоначально IL6 был описан как провоспалительный цитокин, однако некоторые исследования показали, что он участвует в противовоспалительном фенотипе макрофагов. IL-6 способствует поляризации макрофагов в направлении, характеризующемся повышенной экспрессией маркеров, таких как аргиназа-1, Ym1 и CD206. Этот эффект часто требует костимуляции с IL-4 и IL-13 [16]. Также IL-6 может подавлять индуцированную ЛПС продукцию оксида азота и ингибировать продукцию цитокинов активированными CD4+ T-клетками, способствуя иммунорегуляторным функциям [16].  Для макрофагов, выделяемых из красного костного мозга показан конститутивно высокий уровень экспрессии гена IL-6, который в данном случае необходим для кроветворения [17]. Таким образом, исходя из основных функций ИЛ6 и ИЛ10 можно предположить, что значимо высокие уровни экспрессии генов IL10 и IL6 в МФ ККМ могут свидетельствовать о конститутивно более предактивированном состоянии МФ ККМ, об их способности быстрее реагировать на раздражители.

Было отмечено, что уровни экспрессии генов, вовлеченных в метаболизм L-аргинина NOS2 и ARG1 были значимо повышены в МФ ПК. Метаболизм L-аргинина играет важную роль в заживлении ран посредством выработки оксида азота (NO) индуцируемой синтазы оксида азота (NOS2) и пролина аргиназой (Arg-1) [18].  NO усиливает антимикробную активность, способствует вазодилатации и улучшает приток крови к ране, облегчая доставку кислорода и питательных веществ, необходимых для заживления, а пролин имеет решающее значение для пролиферации клеток и синтеза коллагена соответственно. Таким образом, высокий уровень экспрессии этих генов в макрофагах, культивированных из ПК, потенциально отражает полученный результат in vivo использования в модели раны, где визуально было отмечено отсутствие нежелательных эффектов (нагноения) при их использовании. При этом использование МФ из ККМ привело не только к большей длительности восстановления целостности кожного покрова, но и к развитию побочного эффекта в виде гиперемии и повышенной кровоточивости. 

Таким образом, использование МФ из ПК возможно предпочтительнее ввиду низкого предактивированного статуса по сравнению с клетками из ККМ, что потенциально приведет к более ожидаемому результату при направленном изменении фенотипа.

Заключение

Таким образом, было проведено прямое сравнение макрофагов, культивируемых из периферической крови и красного костного на генном уровне и функциональной активности in vivo. Полученные результаты показывают, что макрофаги, культивируемые из периферической крови, представляют собой хорошую альтернативу макрофагам, культивируемым из костного мозга, для использования в качестве аутологичной клеточной терапии в животных моделях. Тем не менее необходимы дополнительные исследования, такие как оценка системного введения макрофагов, для подтверждения данного предположения.

 

About the authors

Viktoriia Kiseleva

Research Institute of Molecular and Cellular Medicine, Рeoples’ Friendship University of Russia (RUDN University);
Federal State Budget Institution «National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatol-ogy named after Academician V.I. Kulakov» Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: victoria.kurnosova.1991@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3001-4820
SPIN-code: 2698-1448

Junior Researcher, Laboratory of Regenerative Medicine,  National Medical Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology after V.I. Kulakov

Russian Federation, 6 Miklukho-Maklaya Street, Moscow, 117198, Russian Federation; 4 Oparina Street, 117997 Moscow, Russian Federation;

Polina Vishnyakova

Научно-исследовательский институт молекулярной и клеточной медицины ФГАОУ ВО "Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы", г. Москва, Россия;
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва, Россия

Email: vpa2002@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8650-8240
SPIN-code: 3406-3866

Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Regenerative Medicine, Federal State Budgetary Institution “National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov” of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia

6 Miklukho-Maklaya Street, Moscow, 117198, Russian Federation; 4 Oparina Street, 117997 Moscow, Russian Federation

Ivan Tsvetkov

Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn, Federal State Budgetary Scientific Institution “Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky”, Moscow, Russia

Email: davedm66@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0946-1105
SPIN-code: 6842-0264

Candidate of Biological Sciences, Head of the Experimental Biological Clinic of Experimental Animals (vivarium), Senior Researcher of the Laboratory of Inflammation Immunomorphology of the A.P. Avtsyn Research Institute of Human Morphology of the B.V. Petrovsky Russian Scientific Center of Surgery, Moscow, Russia,

Russian Federation, 3 Tsurupa Street, 117418 Moscow, Russian Federation

Andrey Elchaninov

Research Institute of Molecular and Cellular Medicine, Рeoples’ Friendship University of Russia (RUDN University);
Federal State Budget Institution «National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatol-ogy named after Academician V.I. Kulakov» Ministry of Healthcare of the Russian Federation;
Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn, Federal State Budgetary Scientific Institution “Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky”, Moscow, Russia

Email: elchandrey@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2392-4439
SPIN-code: 5160-9029

Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Laboratory of Growth and Development of the Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn of the Federal State Budgetary Scientific Institution "Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky"

Russian Federation, 6 Miklukho-Maklaya Street, Moscow, 117198, Russian Federation; 4 Oparina Street, 117997 Moscow, Russian Federation; 3 Tsurupa Street, 117418 Moscow, Russian Federation

Anna Kosyreva

Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn, Federal State Budgetary Scientific Institution “Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky”, Moscow, Russia;
Research Institute of Molecular and Cellular Medicine, Рeoples’ Friendship University of Russia (RUDN University);

Email: kosyreva.a@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-6182-1799
SPIN-code: 5421-5520

Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Laboratory of Neuromorphology, Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn, Federal State Budgetary Scientific Institution "Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky"

Russian Federation, 3 Tsurupa Street, 117418 Moscow, Russian Federation; 6 Miklukho-Maklaya Street, Moscow, 117198, Russian Federation

Timur Fathudinov

Research Institute of Molecular and Cellular Medicine, Рeoples’ Friendship University of Russia (RUDN University);
Federal State Budget Institution «National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatol-ogy named after Academician V.I. Kulakov» Ministry of Healthcare of the Russian Federation;
Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn, Federal State Budgetary Scientific Institution “Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky”, Moscow, Russia

Author for correspondence.
Email: tfat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6498-5764
SPIN-code: 7919-8430

Doctor of Medical Sciences, Professor, Director of the Research Institute of Molecular and Cellular Medicine, Head of the Department of Histology, Cytology and Embryology, Deputy Director for Science of the Medical Institute of RUDN University

6 Miklukho-Maklaya Street, Moscow, 117198, Russian Federation; 4 Oparina Street, 117997 Moscow, Russian Federation; 3 Tsurupa Street, 117418 Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files