Peripheral blood lymphocyte subpopulations as a marker of severe mechanical soft tissue injury in rats: immunocytochemical study and ROC analysis

Full Text

Исследование выполнено на 18 белых беспородных крысах массой 180-200 г, которым с помощью специальной установки (падающий груз) в нашей модификации вызывали механическую травму бедра, моделирующую высококинетическое повреждение мягких тканей [11]. Объектом воздействия служила правая задняя конечность. Все манипуляции с экспериментальными животными  при моделировании механической травмы мягких тканей бедра выполнялись под эфирным наркозом согласно приказу МЗ России №199н от 01.04.2016 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа 2014 г. №51) Исследование одобрено Локальным Этическим комитетом ФГБОУ ВО «Башкирский Государственный Медицинский Университет» МЗ РФ (протокол № 3 от 18.03.2021). Животных опытной группы (n=12) содержали в одинаковых условиях вивария на стандартном сбалансированном рационе при свободном доступе к воде и пище. Группы формировались из общего потока травмированных животных путем рандомизации с помощью случайных чисел: 1) группа I – контрольные животные (n=6); 2) группа II – группа с механической травмой через 3 и 14 суток (n=12). Гибели животных не наблюдалось.

Через 3 и 14 сут эксперимента в утренние часы осуществляли забор крови у животных из хвостовой вены. Проведена количественная оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови. С помощью панели моноклональных антител выявляли относительное и абсолютное содержание следующих субпопуляций лимфоцитов: CD3⁺ (все Т-лимфоциты, Тл), CD4⁺ (Т-хелперы, Тлх), CD8⁺ (Т-цитотоксические лимфоциты, Тлц), CD19⁺ (В-лимфоциты, Вл), CD56⁺ (NK-клетки, Нл) [12].

На предварительно обработанные 0,1% поли-L-лизином (Serva, Германия) предметные стекла наносили суспензию лимфоцитов в лунку (20 мкл клеточной взвеси в концентрации 5х10⁶/мл). После инкубирования во влажной камере, материал фиксировали 70% этиловым спиртом, отмывали в фосфатном буфере (PBS) 3 раза по 5 мин. На подготовленные таким образом клетки наносили специфические моноклональные антитела (Dako, Дания) (по 20 мкл) к CD-маркерам клеток (1/100) и PBS в качестве контроля, инкубировали во влажной камере при комнатной температуре (30 мин). Стекла трижды отмывали в PBS, наносили вторые связывающие антитела (20 мкл), инкубировали 10 мин. На последнем этапе промывали стекла PBS, наносили стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой (20 мл, инкубация 10 мин), промывали фосфатным буфером. В каждую лунку вносили 30 мкл приготовленный ex tempore (3-диаминобензидин тетрахлорид), затем промывали дистиллированной водой, подсушивали.

Для визуализации и подсчета иммунопозитивных клеток использовали бинокулярный световой микроскоп (Axioscop «Carl Zeiss», Германия). CD-позитивные клетки имели отчетливое коричневое окрашивание. Определяли относительное содержание (%) клеток, экспрессирующих CD-белки, в 20 полях зрения в контроле, через 3 и 14 сут после травмы.

Статистическая обработка данных была проведена с помощью прикладных программ STATISTICA V.7.0 ("StatsoftInc", США). Характер распределения вариационных рядов (определяли с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро, p<0,05) не соответствовал требованиям к применению параметрических критериев. Поэтому проверку статистических гипотез при сравнении независимых групп проводился с помощью непараметрических методов (критерий Манна-Уитни для парного сравнения) Количественные данные представлены в виде Me [Q1; Q3], где Ме – медиана, Q1 – нижний квартиль, Q3 – верхний квартиль. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Полная площадь под данной ROC-кривой является важным статистическим показателем, который представляет собой вероятность правильного прогноза при наблюдении тестовой переменной (когда один объект случайным образом выбирается из группы наблюдений, а другой случайным образом выбирается из контрольной группы). ROC-анализ поддерживает вывод для отдельной площади под кривой, кривых точность-полнота (precision-recall, PR), а также содержит возможности для сравнения двух ROC-кривых, сгенерированных либо из независимых групп, либо из попарных объектов.

 

Результаты

Распределение изученных переменных (относительное содержание лимфоцитов) периферической крови контрольных животных было близким к нормальному (критерий Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилк тест) для Т- и В-лимфоцитов (p>0,20), но отличалось от такового для NK-клеток (p=0,02) (рис. 1 и 2). Через 3 сут после травмы распределение Т-хелперов стало отличаться от нормального (p=0,02), а распределение всех остальных переменных не изменилось. Через 14 сут после травмы отличное от нормального было распределение Т-цитотоксических лимфоцитов (р=0,001), В-лимфоцитов (р=0,02) и  NK-клеток (р=0,001) (рис. 1 и 2). Все это свидетельствовало об статистически значимом изменении структуры распределения показателей признаков после травмы. Кроме характера распределения изменялась и относительная плотность субпопуляций лимфоцитов, что наглядно видно на гистограммах плотности (рис. 1 и 2). Через 3 сут она уменьшалась, а через 14 сут частично восстанавливалась.

 

Рисунок 1 – Гистограмма содержания (доля, отн. ед., ордината) основных типов изученных лимфоцитов по содержанию (%, абсцисса) в периферической крови белых крыс после травмы бедра.

Примечание (на рисунках 1 и 2: сплошная кривая – через 14 сут, пунктирная – через 3 сут, точечная – контроль.

Picture 1 – The histogram of the content (percentage, rel.unit, ordinate) the mane types of lymphocytes studied in terms of content (%, the abscissa) in peripheral blood of white rats after hip injury

Note (in pic. 1 and 2: the solid curve – after 14 days, dotted line – after 3 days, spot map - control)

 

Рисунок 2 – Гистограмма распределения (доля, отн. ед., ордината) Т-лимфоцитов по содержанию (%, абсцисса) в периферической крови белых крыс после травмы бедра.

Picture 2 – The histogram of the content (percentage, rel.unit, ordinate) of  T-lymphocytes studied in terms of content (%, the abscissa) in peripheral blood of white rats after hip injury

 

ROC-анализ позволяет точно оценить качество бинарной классификации – влияние какого-нибудь фактора на состояние составляющих систему изучения компонентов. В настоящем случае дает возможность доказать влияние (да или нет) фактора наличия высококинетической травмы мягких тканей бедра на относительное содержание отдельных субпопуляций лимфоцитов периферической крови белой крысы через 3 и 14 сут после воздействия, а также фактора времени.

Сравнивались три группы – 1) контроль (нет травмы – 0) и через 3 сут (есть травма, острый период – 1); 2) контроль (нет травмы – 0) и через 14 сут (есть травма, отдаленный период – 1); 3) травма, 3 сут (острый период – 0) и травма через  14 сут (отдаленный период – 1).  На графике ROC-кривых видно, что через 3 сут после травмы все переменные свидетельствовали о том, что у этих животных в посттравматическом периоде было такое воздействие на организм, которое изменило относительное содержание всех субпопуляций лимфоцитов (рис. 3). При этом основной показатель связи фактора травмы и содержания лимфоцитов AUC (или area under curve — это просто площадь под кривой ROC) был очень высоким (0,82-1,0). Через 14 сут ROC-кривые изменялись, но применительно к В-лимфоцитам и NK-клеткам. Это свидетельствовало о том, что присоединение фактора времени влияло в основном на В-лимфоциты и NK-клетки, но не влияло на Т-лимфоциты.

В третьей группе сравнения, учитывающем наличие временного фактора, установлено, что все переменные (лимфоциты) могут быть предикторами наличия длительного периода от момента травмы (рис. 4).

 

Рисунок 3 – Графики ROC-кривых основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови белых крыс через 3 и 14 сут после травмы бедра: результаты определения чувствительности, специфичности, AUC (площадь под кривой) и критериев отсечения (без травмы, травма) переменных. Фактор – наличие травмы.

Picture 3 – Graphs of ROC-curves the mane types of lymphocytes in peripheral blood after 3 and 14 days after hip injury: results of sensitivity and specificity determination, AUC (the area under the curve) and criteria for clipping (with injury, without injury) variables. The factor is the presence of injury

 

Рисунок 4 – Графики ROC-кривых основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови белых крыс после травмы бедра: результаты определения чувствительности, специфичности, AUC (площадь под кривой) и критериев отсечения (без травмы, травма) переменных. Фактор – длительное время после травмы.

Picture 4 – Graphs of ROC-curves the mane types of lymphocytes in peripheral blood after hip injury: results of sensitivity and specificity determination, AUC (the area under the curve) and criteria for clipping (with injury, without injury) variables. The factor -long time after of injury

 

Обсуждение

По данным проведенного нами ROC-анализа, относительное содержание лимфоцитов в периферической крови можно рассматривать как маркер механической травмы мягких тканей бедра. Однако, наличие ROC-кривых с высоким AUC (площадь под кривой), % чувствительности и специфичности, а также низким уровнем р не всегда гарантировало построение классификационной модели.

Так, по данным логистической регрессии, через 3 сут после травмы не удалось построить модель связи переменной «относительное содержание В- и Т-лимфоцитов» с фактом наличия травмы (да-нет). Для NK-клеток модель корректно классифицировала распределение случаев между контролем и травмой в 68,3% (95% ДИ AUC = 0,68-0,93%; 95% ДИ ОШ = 0,16-0,65; c2 = 20,6, р <0,0001). Примечание: ОШ – отношение шансов, 95% ДИ – 95% доверительный интервал, AUC – площадь под кривой. 

Через 14 сут после травмы не удалось построить модель связи переменной «относительное содержание В-лимфоцитов» с фактом наличия травмы (да-нет). Однако, подобную модель можно было построить для Т-лимфоцитов (сумма Т-цитотоксических лимфоцитов и Т-хелперов) и NK-клеток. При использовании Т-лимфоцитов процент случаев корректной классификации (между контролем и травмой) составил 95,0 (95% ДИ AUC = 0,82-0,99%; 95% ДИ ОШ = 0,05-0,42; c2 = 30,2, р <0,0001). Для NK-клеток связь была менее очевидной: процент случаев корректной классификации (между контролем и травмой) составил всего 50,0 (95% ДИ AUC = 0,59-0,87%; 95% ДИ ОШ = 0,31-0,87; c2 = 7,3, р =0,007). Стоить отметить, что сформировать более сложные модели из двух переменных не удалось.

Классифицировать животных по времени после травмы оказалось возможным только по NK-клеткам: процент случаев корректной классификации (между 3 и 14 сут после травмы) составил всего 56,1 (95% ДИ AUC = 0,58-0,87%; 95% ДИ ОШ = 1,07-2,61; c2 = 5,6, р =0,018).

Заключение

Таким образом, содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови может быть специфичным и чувствительным маркером высококинетической механической травмы мягких тканей бедра у белой крысы. Однако, по нашим данным, в остром периоде (через 3 сут) только NK-клетки оказались информативными для создания рабочей модели классификации животных по бинарному признаку (да-нет) наличия травмы. В более отдаленном периоде (через 14 сут) модели классификации можно было получить уже на основании переменной «содержание Т-лимфоцитов» и «содержание NK-клеток», при этом совместно в модели они не работали. Полагаем, что подобные особенности связаны с фактором времени (через 3 и 14 сут). В течение этого временного промежутка в организме и иммунокомпетентных органах происходили процессы, существенно изменяющие структуру факторных ассоциаций и материально разделяющие острый и отдаленный посттравматический периоды. Кроме того, необходимо учитывать высокую функциональную специфичность разных субпопуляций лимфоцитов в норме, остром и отдаленном периодах после травмы, а также, вероятно, у разных животных одной группы [13, 14].  С учетом данных литературы [15, 16], найденные нами закономерности имеют большое значение для исследования реакции иммунной системы организма на повреждение и оценке течения воспалительных процессов

About the authors

Albina Lanicheva

ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет МЗ РФ

Author for correspondence.
Email: lanichevaa@mail.ru
SPIN-code: 9390-2689

к.м.н., доцент кафедры гистологии

Russian Federation, 435008, Russia, Ufa, Lenin St., 3

Valery Vasilyevich Semchenko

ФГБОУ ВО «Омский государственный агарный университет имени П.А. Столыпина».

Email: ivm_omgau_gistology@mail.ru
Scopus Author ID: 7005656558

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, анатомии, гистологии, физиологии и патологической анатомии

Russian Federation, 644008, Russia, Omsk, Institutskaya Square, 1

References

Supplementary files