Perivascular macrophages in rat liver lack the cd68 protein

Full Text

Обоснование

Резидентные (тканевые) макрофаги присутствуют в большинстве тканей у млекопитающих. Они являются ключевыми регуляторами тканевого гомеостаза в норме, а также важными участниками процесса воспаления и репарации [1]. При этом макрофаги представляют собой гетерогенную популяцию клеток в фенотипическом и функциональном отношении. В печени популяция резидентных макрофагов представлена клетками Купфера, располагающимися в непосредственном контакте с синусоидными кровеносными капиллярами. Кроме того, помимо клеток Купфера в печени присутствуют другие клеточные популяции клеток моноцитарно-макрофагального ряда, что, при исследовании воспалительных реакций, делает дифференцировку субпопуляций печеночных макрофагов актуальной научной задачей.

Широко известным макрофагальным маркером является лизосомный гликопротеин CD68, позволяющий выявлять фагоцитирующие клетки в различных тканях организма, в том числе клетки Купфера печени. Кальций связывающий белок Iba-1 также является распространенным маркером выявления активированных макрофагов вне зависимости от их субпопуляции [2] хотя и традиционно считается высокоселективным маркером микроглии. Это позволяет рассматривать его в качестве дополнительного маркера при исследовании клеток моноцитарно-макрофагального ряда.

Цель

В соответствии с этим целью настоящего исследования было охарактеризовать иммунофенотип макрофагов печени с использованием маркера фагоцитарной активности CD68 и микроглиального маркера Iba-1.

Методы

Дизайн исследования. Проведено экспериментальное одноцентровое сплошное неконтролируемое простое слепое исследование. Исследование проводилось на парафиновых срезах печени и головного мозга половозрелых самцов крыс Wistar (6-9 месяцев, n=8).

Описание вмешательства. Образцы тканей фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде и заливали в парафин по стандартной методике. Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла с адгезивным покрытием HistoBond®+ (Paul Marienfeld, Германия). После депарафинирования препаратов по стандартной методике проводили тепловое демаскирование антигенов в водном растворе тиосульфата натрия (патент № RU 2719163 C1) в течение 23 минут. Ингибирование эндогенной пероксидазы путем инкубации срезов в 3% водном растворе перекиси водорода в течение 10 минут. Смесь первичных антител наносили на срезы в соотношении 1:1. Препараты инкубировали в первичных реагентах при температуре 22°С в течение 92 часов. Для одновременного выявления Iba-1 и CD68 использовали козьи поликлональные антитела к Iba-1 в разведении 1:200 (ab5076, Abcam, Великобритания) и кроличьи поликлональные антитела к CD68 (GB113109, Servicebio, Китай) в разведении 1:250. В качестве вторичных реагентов использовали реагенты из набора Cell & Tissue Staining Kit (CTS008, R&D Systems, США) в соответствии с рекомендациями производителя, и козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена из набора Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit (ab236466, Abcam, Великобритания). Для выявления продукта реакции срезы обрабатывали конъюгатом стрептавидина с флуорохромом Cy2 (016-220-084, Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:150) и раствором козьих антител против пероксидазы хрена, конъюгированных с флуорохромом Cy3 (123-165-021, Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:100).

Исходы исследования. Оценивали распределение белков Iba-1 и CD68 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда печени и головного мозга крыс. Дополнительно проводили анализ колокализации исследуемых маркеров.

Методы регистрации исходов. Анализ и фотографирование препаратов проводили с использованием конфокального лазерного микроскопа LSM800. Обработку полученных изображений проводили в программе Zen 3 (Carl Zeiss AG, Германия). Для выявления колокализации использовали плагин Colocalization Finder (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html) для ImageJ.

Результаты

Объекты исследования. В работе использованы 8 парафиновых блоков с образцами печени и головного мозга крыс Wistar из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, Россия).

Основные результаты исследования. Двойное иимунофлуорсцентное маркирование с использованием антител против Iba-1 и CD68 во всех исследованных образцах выявило многочисленные клетки различных иммунофенотипов (Iba-1⁺/CD68⁺ и Iba-1⁺/CD68^-). Реакция характеризуется высокой интенсивностью, благодаря чему клетки легко идентифицируются. Неспецифическое фоновое окрашивание отсутствует или минимально.

При анализе канала флуоресценции, соответствующего Iba-1, на срезах печени было обнаружено множество Iba-1 иммунопозитивных структур, расположенных между гепатоцитами и вдоль профилей синусоидных капилляров, морфологически соответствующих резидентным макрофагам печени – клеткам Купфера. Данные клетки располагались, преимущественно, в перипортальной и интермедиальных зонах дольки печени и имели от 2 до 5 цитоплазматических отростка. В результате реакции были также выявлены клетки, морфологически схожие с типичными тканевыми макрофагами, имеющие безотросчатую округлую форму и располагающиеся преимущественно в междольковой соединительной ткани и вблизи крупных сосудов печени.

В ходе анализа канала флуоресценции, соответствующего CD68, были обнаружены CD68⁺ клетки, которые так же, как и Iba-1⁺ клетки, локализовались вдоль синусоидов и имели морфологическое сходство с клетками Купфера. При этом CD68⁺ клетки отсутствовали в области триад.

Анализ двойного иммуномаркирования в препаратах печени показал, что резидентные макрофаги проявляли Iba-1⁺/CD68⁺ иммунофенотип и располагались, преимущественно в перипортальной зоне ацинуса. Тогда как клетки морфологически схожие с тканевыми макрофагами не демонстрировали коэкспрессии (рис. 1б), характеризовались Iba-1⁺/CD68^- фенотипом и выявлялись в области междольковой соединительной ткани печени и единично в области крупных сосудов (рис. 1а, стрелки).

В ткани головного мозга фенотип Iba-1⁺/CD68^- характерен для многочисленных отростчатых клеток, соответствующие рамнифицированным микроглиоцитам (рис. 1в, стрелка). Продукт иммуногистохимической реакции на CD68 обнаруживается, преимущественно, в периваскулярных клетках. Такие клетки головного мозга имеют фенотип Iba-1⁺/CD68⁺. Они имеют овальную или вытянутую форму и выраженную CD68-гранулярность в цитоплазме. Это дополнительно подтверждается анализом колокализации исследуемых маркеров (рис. 1г).

Обсуждение

Резюме основного результата исследования. В печени выявленные CD68⁺ клетки по особенностям структуры и локализации соответствуют клеткам Купфера. Это крупные клетки вытянутой или лопастной формы, которые ассоциированы с эндотелиоцитами синусоидных капилляров печени. Клетки Купфера занимают ведущую роль в иммунологическом надзоре печени, и экспрессия CD68 напрямую связана с их высокой фагоцитарной активностью. При этом иммунногистохимическая реакция на Iba-1 в печени дополнительно выявляет интерстициальные макрофаги и периваскулярные макрофаги в области печеночных триад. По-видимому, недавно мигрировавшие в ткань макрофаги могут быть менее дифференцированными или недостаточно вовлеченными в провоспалительный сигналинг клеток печени, поэтому экспрессия маркера активации CD68 отсутствует. Кроме того известно, что при длительном пребывании в тканях иммунофенотип макрофагов может изменяться с CD68⁺ на CD68^- [3]. Другое скрининговое исследование печеночных макрофагов крыс показывает, что количество CD68⁺ клеток в области триад и междольковой соединительной ткани печени значительно ниже, чем в остальных зонах дольки [4].

Интересным фактом является то, что для периваскулярных макрофагов головного мозга характерен другой фенотип – Iba-1⁺/CD68⁺. Кроме того, следует обратить внимание на то, что другой тип родственных макрофагам клеток головного мозга – клетки рамнифицированной микроглии обладают фенотипом Iba-1⁺/CD68^- [5]. Это указывает на необходимость более детальной характеристики тканевых макрофагов с учетом их региональных особенностей.

Заключение

Применение выбранного методического подхода позволило выявить и охарактеризовать различные популяции макрофагов печени крысы. Было установлено, что клетки Купфера, подобно периваскулярным макрофагам головного мозга содержат оба анализируемых маркера, тогда как интерстициальные клетки печени содержат Iba-1 и не содержат CD68. Таким образом, периваскулярные макрофаги обладают органоспецифическими особенностями фенотипа, что проявляется в экспрессии главного маркера, ассоциированного с фагоцитозом – макросиалина (CD68).

About the authors

Inga A. Nikitina

Institute of Experimental Medicine

Email: inga06819@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5789-6475
SPIN-code: 3488-8851

Junior Research Associate, Laboratory of Experimental Histology and Confocal Microsopy, Department of General and Special Morphology

Russian Federation, Saint Petersburg

Valeria A. Razenkova

Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Author for correspondence.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-code: 8877-8902

научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Russian Federation

Dmitrii E. Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-code: 3252-3029

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files