Pancreatic progenitors and bi-hormonal cells in the neuro-insular complexes of the developing human pancreas

Full Text

Обоснование

Сахарный диабет - одно из самых широко распространённых заболеваний, приводящее к развитию серьезных осложнений, ранней инвалидизации и смертности [1, 2], что диктует необходимость поиска эффективных способов лечения данной патологии. Перспективными и активно развивающимися направлениями в данной области являются разработка методов трансплантации панкреатических островков, а также методов восстановления собственных β-клеток пациента. Очевидно, что успешная реализация данных подходов напрямую зависит от полноты сведений о механизмах дифференцировки эндокринных клеток и морфогенеза островков поджелудочной железы в период пренатального развития и при нарастании массы эндокринных клеток в постнатальный период. Поэтому изучение данных вопросов сохраняет свою актуальность как для фундаментальной науки, так и для прикладной медицины.  

Согласно экспериментальным данным, полученным на мышах и культурах клеток, в пренатальный и ранний постнатальный важную роль в регуляции дифференцировки и созревания эндокринных клеток, а также морфогенеза панкреатических островков играют структуры нервной системы [3–5]. У человека, в период пренатального развития поджелудочная железа человека обильно иннервирована [6–8]. Причем структуры нервной системы тесно взаимодействуют с гормоносодержащими клетками, образуя так называемые нейро-инсулярные комплексы [6, 7]. Нейро-инсулярные комплексы I типа представляют собой отдельные эндокринные клетки и/или панкреатические островки, интегрированные с телами нейронов и их отростками, а в нейро-инсулярных комплексах II типа тела нейронов отсутствуют [9]. Такие комплексы появляются в зачатке поджелудочной железы с 14-й недели гестационного развития и наиболее многочисленны на сроках 14–28 недель, в период активного морфогенеза эндокринной части [6].

Механизмы образования нейро-инсулярных комлексов и их функциональная роль остаются до конца не ясными. Известно, что все типы клеток поджелудочной железы (экзокринные, эндокринные, клетки протоков) имеют энтодермальное происхождение и дифференцируются из эпителиоцитов первичных протоков [10], в то время как нейроны и нервные волокна являются производными нейроэктодермы [11]. Впервые предположение о формировании нейро-инсулярных комплексов путем выселения островковых клеток из эпителия протоков и их интеграции со структурами нервной системы, и o возможной регуляции дифференцировки эндокринных клеток со стороны нервной системы было высказано при описании этих комплексов в 1927 году [цит. по 9]. Однако в последующих работах это предположение было опровергнуто тем фактом, что у исследованных видов животных большинство островков поджелудочной железы, в том числе при ее развитии, не формируют нейро-инсулярные комплексы [цит. по 9].

Применение иммуногистохимии позволило показать, что при развитии поджелудочной железы человека структуры нервной системы взаимодействуют не только с гормоносодержащими клетками, но и с эпителиальными клетками, иммуноположительными к цитокератину 19 (ЦК19), расположенными в протоках железы или в виде тяжей и отдельных клеток [8]. Таким образом, наиболее вероятным механизмом образования нейро-инсулярных комплексов представляется интеграция структур нервной системы не с гормоносодержащими клетками, выселяющимися из протоков, а с эпителиальными клетками-предшественницами, которые впоследствии дифференцируются в эндокринные клетки [8]. Однако, для подтверждения этой гипотезы крайне важны данные о взаимодействиях структур нервной системы с клетками, обладающими прогениторным иммунофенотипом, которые в современной литературе отсутствуют.

В качестве маркеров прогениторных клеток используют различные факторы транскрипции, регулирующие дифференцировку клеток поджелудочной железы. Одним из ранних факторов транскрипции служит PDX1 – гомеобокс поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки 1 [12, 13]. Кроме того, во многих работах, в том числе на образцах поджелудочной железы человека, отмечается, что отдельные этапы дифференцировки и созревания эндокринных клеток сопровождаются экспрессией нескольких гормонов [14, 15]. Поэтому бигормональные клетки также рассматривают в качестве клеток с прогениторным иммунофенотипом.

Цель

Изучить распределение клеток, содержащих фактор транскрипции PDX1, и бигормональных клеток в составе нейро-инсулярных комплексов при развитии поджелудочной железы человека.

Материалы и Методы

Исследование выполнено на аутопсийном материале поджелудочной железы 15 плодов, гестационный возраст 9–25 недель, из коллекции лаборатории развития нервной системы Научно-исследовательского института морфологии человека имени академика А.П. Авцына Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского. Возраст плодов определен на основании данных ультразвукового исследования и представлен в неделях с даты последней менструации. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского (Протокол № 5 от 23 мая 2025 г.).

Материал фиксировали в нейтральном формалине (4% параформальдегид на 0,1М фосфатном буфере, рН=7,0–7,4) («БиоВитрум», Россия). Поджелудочную железу целиком для плодов ранних сроков развития (9–19 недель) или фрагменты из тела поджелудочной железы для плодов более поздних сроков (20–25 недель) обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и диоксане, заливали в парафин и готовили серийные срезы толщиной 5–10 мкм.

Методом тройного иммунофлуоресцентного окрашивания на парафиновых срезах проводили реакции с применением следующих комбинаций антител: инсулин/PDX1/β3-тубулин; инсулин/глюкагон/β3-тубулин и инсулин/соматостатин/β3-тубулин. Перечень использованных в работе первичных и вторичных антител приведен в табл. 1. Для каждой комбинации антител окрашивали не менее 5 срезов на образец, расположенных на расстоянии 100-150 мкм друг от друга.

При постановке реакций срезы депарафинировали, регидратировали, проводили демаскирования антигенов путем термической обработки (кипячение в 0,01М цитратном буфере («Диа-М», Россия) в течение 10 мин с последующим остыванием в течение 20 мин, а затем инкубировали с 5% раствором нормальной козьей сыворотки («JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.», США) в трис-буферном растворе, содержащем 0,1% Tween 20 (TBST) («BioinnLabs», Россия) для блокировки неспецифического связывания. Первичные антитела разводили в 5% растворе нормальной козьей сыворотки в TBST и инкубировали со срезами во влажной камере в течение 20 ч при +4 ^оС. Вторичные антитела разводили в TBST и инкубировали со срезами в течение 2 ч при комнатной температуре. Для заключения препаратов и одновременной окраски ядер использовали отвердевающую среду, содержащую DAPI («Biotium», США).

В каждую реакцию для каждого образца включали по три негативных контроля, в которых исключали из комбинации одно из первичных антител, и одному негативному контролю, в котором всю комбинацию первичных антител заменяли 5% раствором нормальной козьей сыворотки в TBST.

Для исключения перекрестной реакции вторичных антител с первичными антителами, полученными от разных видов, на двух образцах поджелудочной железы были поставлены реакции, в которых срезы инкубировали отдельно с каждым из первичных антител, а затем с комбинацией вторичных антител, из которой исключали специфичные для первичных вторичные антитела.

Препараты анализировали при помощи конфокальной микроскопии (микроскоп Olympus FV4000). Обработку изображений проводили в программе ImajeJ 1.54p (США).

Результаты

При окрашивании антителами к инсулину, PDX1 и β3-тубулину на исследованных сроках развития (9–25 недель) обнаружено следующее распределение иммунореактивоности к перечисленным маркерам. Реакция с антителами к инсулину выявлялась в виде гранул в цитоплазме β-клеток, локализованных поодиночке, в небольших кластерах, и в формирующихся панкреатических островках. Положительное окрашивание на PDX1 наблюдалось в ядрах большинства эпителиоцитов, расположенных в протоках поджелудочной железы и их выростах, а также в ядрах большинства инсулин-положительных β-клеток. В структурах нервной системы реакция на инсулин и PDX1 была иммунонегативной. При этом в цитоплазме нейронов формирующихся интрамуральных ганглиев, нервных волокнах и цитоплазме большинства клеток, ассоциированных с нейронами и нервными волокнами, наблюдалась интенсивная иммуноположительная реакция с антителами к β3-тубулину. Менее интенсивное окрашивание на β3-тубулин обнаружено в цитоплазме инсулин-положительных β-клеток. Кроме того, среди эпителиоцитов, расположенных в протоках железы и их выростах, присутствовали немногочисленные PDX1-положительные клетки с иммунонегативной реакцией на инсулин, но с положительной реакцией на β3-тубулин в цитоплазме. Таким образом, иммунофенотип большинства β-клеток был инсулин+/PDX1+/β3-тубулин+, иммунофенотип клеток в составе структур нервной системы – инсулин¯/PDX1¯/β3-тубулин+, а эпителиоциты протоков железы и их выростов обладали преимущественно иммунофенотипом инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ и, реже, инсулин¯/PDX1+/ β3-тубулин+.

На ранних сроках развития зачаток поджелудочной железы образован эпителиоцитами протоков и их выростов, окруженными мезенхимой. Инсулиносодержащие β-клетки располагаются поодиночке или в небольших кластерах среди эпителиальных клеток протоков. Структуры нервной системы представлены пучками нервных волокон и формирующимися ганглиями, локализованными в мезенхиме. Во всех образцах поджелудочной железы 9–11-недельных плодов обнаружены ганглии и нервные волокна, контактирующие с инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ эпителиоцитами, расположенными в протоках и их выростах (рис. 1 a–d). В отдельных ганглиях, среди инсулин¯/PDX1¯/β3-тубулин+ клеток структур нервной системы, выявлены единичные клетки с иммунофенотипом инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯, характерным для эпителиоцитов протоков (рис. 1 a–d).

С 12-й недели гестационного развития в зачатке поджелудочной железы появляются формирующиеся панкреатические островки, которые на сроках 12–25 недель имеют либо плащевую (β-клетки располагаются в центральной части островка, а α-клетки – на периферии), либо биполярную (β- и α- клетки располагаются на разных полюсах) структурную организацию. Нейро-инсулярные комплексы присутствовали во всех исследованных образцах поджелудочной железы 14–25-недельных плодов. При оценке их клеточного состава установлено, что в нейро-инсулярных комплексах 1 типа, образованных как панкреатическими островками плащевого, так и биполярного типа, интегрированными с ганглионарными нейронами и нервными волокнами, среди инсулин¯/PDX1¯/β3-тубулин+ клеток структур нервной системы присутствовали отдельные инсулинонегативные клетки с положительным ядерным окрашиванием на PDX1 (рис. 1 e–l). Причем такие PDX1+ клетки были представлены двумя иммунофенотипами – инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ и   инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+, сходными с иммунофенотипом эпителиоцитов протоков. Кроме того, во всех образцах поджелудочной железы 12–25-недельных плодов, как и на более ранних сроках развития, обнаружены отдельные ганглии, в составе которых присутствовали инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ и   инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+ клетки (рис. 1 m–p).

На препаратах, окрашенных комбинациями антител инсулин/глюкагон/β3-тубулин и инсулин/соматостатин/β3-тубулин, проведена оценка распределения бигормональных клеток в нейро-инсулярных комплексах. Во всех образцах поджелудочной железы обнаружены клетки, одновременно содержащие инсулин с глюкагоном (инсулин+/глюкагон+ клетки) и инсулин с соматостатином (инсулин+/соматостатин+ клетки). Среди бигормональных клеток выявлялись как клетки с положительным окрашиванием на β3-тубулин в цитоплазме (инсулин+/глюкагон+/β3-тубулин+ и инсулин+/соматостатин+/β3-тубулин+ клетки), так и клетки с иммунонегативной реакцией на данный маркер (инсулин+/глюкагон+/β3тубулин¯ и инсулин+/соматостатин+/β3-тубулин¯ клетки). При этом в большинстве моногормональных глюкагон+ и соматостатин+ клеток реакция на β3-тубулин была иммунонегативной. Положительное цитоплазматическое окрашивание на этот маркер наблюдалось лишь в некоторых глюкагон+ и соматостатин+ клетках.

На исследованных сроках развития бигормональные клетки располагались преимущественно поодиночке, в небольших скоплениях эндокринных клеток, а также в панкреатических островках плащевого и биполярного типа, и не контактировали со структурами нервной системы. Однако, в поджелудочной железе 14-25-недельных плодов обнаружены немногочисленные бигормональные клетки, входящие в состав нейро-инсулярных комплексов (рис. 2, 3 a–h). Бигормональные клетки, расположенные в нейро-инсулярных комплексах, были представлены различными иммунофенотипами – инсулин+/глюкагон+/β3-тубулин¯; инсулин+/глюкагон+/β3-тубулин+; инсулин+/соматостатин+/β3-тубулин¯ и инсулин+/соматостатин+/β3-тубулин+ (рис. 2, рис. 3 a–h), сходными с иммунофенотипами бигормоналньых клеток, локализованных вне нейро-инсулярных комплексов.

Наиболее часто инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+ клетки выявлялись в комплексах, образованных панкреатическими островками или кластерами эндокринных клеток, интегрированными со структурами нервной системы (рис. 2 a–h, рис. 3 a–h). В таких комплексах инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+ клетки контактировали как с β3-тубулин-положительными клетками и их отростками, так и с другими типами эндокринных клеток (рис. 2 a–h, рис. 3 a–h).

В комплексах, образованных отдельными эндокринными клетками, ассоциированными со структурами нервной системы, преобладали моногормональные глюкагон+ и соматостатин+ клетки.  В части глюкагон+ клеток, интегрированных с нервными волокнами или расположенных внутри ганглиев, наблюдалась слабая иммуноположительная реакция на инсулин (инсулин+/глюкагон+ клетки) (рис. 2 i–p). При этом среди соматостатин+ клеток, локализованных в ганглиях и нервных волокнах, инсулин+/соматостатин+ клетки в исследованных образцах поджелудочной железы не обнаружены (рис. 3 i–p).

Обсуждение

В ходе данного исследования установлено, что в поджелудочной железе 9–25-недельных плодов в составе ганглиев присутствуют клетки с иммунофенотипом, характерным для эпителиоцитов протоков (инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ и инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+). С 9-й недели гестационного развития и на всех последующих сроках такие клетки выявлялись в отдельно расположенных ганглиях, а с 14-й недели гестационного развития и в ганглиях, интегрированных с плащевыми и биполярными панкреатическими островками в нейроинсулярные-комплексы I типа. Кроме того, в нейро-инсулярных комплексах 14–25-недельных плодов обнаружены бигормональные (инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+) клетки.

Согласно экспериментальным данным, PDX1 регулирует образование дорсального и вентрального зачатков поджелудочной желез, спецификацию разных клеточных линий, а также дифференцировку и созревание β-клеток [12, 13]. В отсутствии PDX1 у мутантных мышей поджелудочная железа не развивается, а инактивация PDX1 после формирования зачатка поджелудочной железы приводит к существенным нарушениям, в том числе к снижению количества и функциональной активности β-клеток [12, 13]. Аналогичные нарушения наблюдаются у людей. Описан случай аплазии поджелудочной железы при гетерозиготной однонуклеотидной мутации в PDX1, а также мутации в гене PDX1, приводящие к развитию одной из форм диабета взрослого типа у молодых (MODY4) [12, 13].

В развивающейся поджелудочной железе человека окрашивание на PDX1 выявляется с 29-го–31-го дня после оплодотворения в клетках презумптивной энтодермы, а затем в ядрах эпителиоцитов протоков и ядрах β-клеток по мере их появления [15–17]. При этом интенсивная совместная реакция на PDX1 и ЦК19 в клетках протоков характеризует незрелые клетки, способные к разнонаправленной дифференцировке [18]. На исследованных нами сроках развития распределение иммунореактивности к PDX1 было сходным с описанным в литературе. В протоках железы гормононегативные клетки с интенсивной реакцией на PDX1 были представлены двумя иммунофенотипами – инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ и инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+. Ранее положительное окрашивание на β3-тубулин в клетках протоков не отмечалось. Однако есть данные о присутствии β3-тубулина в клетках панкреатических островков [19, 20], а также в клетках многих опухолей, в том числе в нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы [19], что подтверждается нашими результатами, свидетельствующими о положительном окрашивании на β3-тубулин в большинстве β-клеток, а также в части α-, δ- и бигормональных клеток. Можно предположить, что инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+, расположенные в протоках, представляют собой α-, δ- или бигормональные клетки, содержащие PDX1. С другой стороны, эти клетки могут быть дифференцирующимися эндокринными клетками, в которых β3-тубулин появляется до начала синтеза гормонов. Для проверки этих предположений необходимы дальнейшие исследования.

В предыдущем исследовании нами описаны различные формы взаимодействий структур нервной системы с ЦК19-положительными эпителиальными клетками [8]. Однако, сам по себе ЦК19 не может служить маркером незрелых клеток, поскольку данный маркер на ранних сроках развития (до 16 недель) выявляется во всех эпителиальных клетках, включая эндокринные, и сохраняется в зрелых клетках протоков [16, 21], и определение принадлежности клеток к различным популяциям без дополнительных маркеров не представляется возможным.  Применение тройного иммунофлуоресцентного окрашивания и фактора транскрипции PDX1 в качестве маркера недифференцированных клеток позволило выявить клетки с иммунофенотипом, характерным для незрелых эпителиоцитов протоков, в составе отдельных ганглиев и ганглиев, образующих нейро-инсулярные с панкреатическими островками. Эти результаты существенно дополняют ранее полученные данные и позволяют сделать вывод об интеграции прогениторных клеток поджелудочной железы со структурами нервной системы во время пренатального развития человека.

Функциональная роль взаимодействий между структурами нервной системы и прогениторными клетками поджелудочной железы у человека остается не ясной. При развитии поджелудочной железы мышей в отсутствии клеток нервного гребня и их производных происходит нарастание массы β-клеток за счет их пролиферации [3, 4]. При этом в β-клетках наблюдается снижение экспрессии факторов транскрипции PDX1 и MAFA и нарушение морфологии гранул, что свидетельствует об их функциональной незрелости [4]. Исходя из результатов морфологических исследований, демонстрирующих тесную ассоциацию клеток нервного гребня и их производных с дифференцирующимися эндокринными клетками при развитии поджелудочной железы мышей, выдвинуто предположение, что в период пренатального онтогенеза происходит паракринная или юкстакринная регуляция массы и созревания β-клеток со стороны нервной системы [4, 22]. Не исключено, что сходные механизмы наблюдаются и при развитии поджелудочной железы человека, и интеграция структур нервной системы с прогениторными клетками необходима для регуляции массы и созревания β-клеток.

В недавнем исследовании на образцах поджелудочной железы человека с использованием методов секвенирования транскриптома отдельных клеток и пространственной транскриптомики получены важные данные, подтверждающие интеграцию предшественников эндокринных клеток с дифференцирующимися клетками нервной системы [23]. На 15-й неделе развития обнаружена пространственная ассоциация кластеров предшественников эндокринных клеток с кластерами шванновских клеток и определен лиганд-рецепторный комплекс за счет которого могут осуществляться взаимодействия между этими кластерами [23]. Интересно, что при оценке связей между различными клеточными линиями, основанной на экспрессии генов в кластерах, авторы выявили пересечения одного из кластеров шванновских клеток с одним из кластеров эндокринных клеток, а также траекторию дифференцировки шванновских клеток в сторону эндокринных [23]. Возможным объяснением такого пересечения может быть сходства программ развития и морфофункциональные сходства эндокринных клеток поджелудочной железы с клетками нервной системы, отмеченные во многих работах [обобщено в обзоре 24]. Тем не менее, секвенирование транскриптома отдельных клеток и пространственная транскриптомика служат прекрасными инструментами, которые необходимы для определения характера регуляторных воздействий нервной системы на дифференцировку эндокринных клеток у человека.

В нейро-инсулярных комплексах нами также обнаружены бигормональные инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+ клетки. Как показано на мышах, на ранних сроках развития поджелудочной железы (с 9,5 дня после оплодотворения) большинство инсулиносодержащих клеток одновременно содержат глюкагон, а с 14,5 дня после оплодотворения доля инсулин+/глюкагон+ клеток постепенно снижается [25]. Сходные результаты, демонстрирующие присутствие бигормональных клеток на ранних сроках развития (9–16 недель) и снижение их числа к 21-й неделе, получены на образцах поджелудочной железы человека методами иммуногистохимии и иммуноцитохимии [14, 15], и подтверждаются молекулярно-генетическими данными [23].

Известно, что активация программ дифференцировки β- и α-клеток тесно взаимосвязана. Например, при моделировании диабета у животных существенный вклад в снижение массы β-клеток вносит так называемая «потеря идентичности» – дедифференцировка в менее зрелые фенотипы и трансдифференцировки в α-клетки в условиях метаболического стресса [26]. При этом значительная часть клеток в островках коэкспрессируют маркеры β- (инсулин, PDX1, NKX6.1, MAFA и др.) и α- (глюкагон, ARX, PAX6, MAFB) клеток [26]. С другой стороны, многие протоколы получения β-клеток из эмбриональных клеток поджелудочной железы или из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток in vitro дают значительный процент функционально незрелых бигормональных (инсулин+/глюкагон+) клеток [27]. Вероятно, это обусловлено преждевременной эндокринной дифференцировкой, поскольку рекапитуляция эмбриональных сигнальных механизмов, например активация эндокринной дифференцировки после активации NKX6.1 в PDX1+ прогениторных клетках, приводит к дифференцировке PDX1+/NKX6.1+ предшественников в функционально зрелые моногормональные β-клетки [27]. Кроме того, в недавнем исследовании с отслеживанием судьбы клеток показано, что большинство эндокринных клеток взрослых мышей дифференцируются из гормоносодержащих клеток, появляющихся в пренатальный период. Причем почти 4% постнатальных β-клеток возникают из эмбриональных клеток, экспрессирующих глюкагон [28].

На основании перечисленных экспериментальных данных предполагают, что бигормональные клетки представляют собой дифференцирующиеся и созревающие эндокринные клетки. Присутствие таких клеток в нейро-инсулярных комплексах косвенно подтверждает участие нервной системы в регуляции дифференцировки и созревания эндокринных клеток в пренатальный период. Согласно полученным нами результатам, среди отдельных эндокринных клеток, интегрированных со структурами нервной системы, преобладали моногормональные глюкагон+ и соматостатин+ клетки, слабое окрашивание на инсулин обнаружено лишь в части глюкагон+ клеток. Бигормональные инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+ клетки выявлялись преимущественно в кластерах эндокринных клеток и формирующихся панкреатических островках, интегрированных со структурами нервной системы. Можно предположить, что среди глюкагон+ и соматостатин+ клеток присутствуют предшественники, в которых впоследствии активируется программа дифференцировки и созревания β-клеток и начинается синтез инсулина, что приводит к появлению инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+ клеток, а затем моногормональных инсулин+ β-клеток.

Тем не менее, определение регуляторных эффектов, оказываемых нервной системой на дифференцировку и созревание эндокринных клеток, на материале поджелудочной железы человека ограничено отсутствием возможности постановки эксперимента и отслеживания судьбы дифференцирующихся клеток. Необходимо также сказать, что  взаимодействия прогениторных клеток со структурами нервной системы скорее всего не являются единственным эмбриональным механизмом, запускающим дифференцировку и созревание эндокринных клеток, а происходят на отдельных этапах развития эндокринной части, поскольку в поджелудочной железе плодов нейро-инсулярные комплексы присутствуют одновременно с эндокринными клетками и панкреатическими островками, не образующими связей с нейронами и нервными волокнами. Дальнейшие морфологические исследования, в комбинации с современными молекулярно-генетическими подходами и результатами экспериментальных работ помогут определить роль нервной системы в развитии эндокринной части поджелудочной железы у человека.

Заключение

Механизмы диффереренцировки эндокринных клеток поджелудочной железы интенсивно исследуются уже более века, что во многом обусловлено необходимостью разработки эффективных методов лечения сахарного диабета, направленных на восстановление массы инсулин-секретирующих β-клеток. Результаты немногочисленных экспериментальных работ демонстрируют, что нервная система может контролировать такие ключевые морфогенетические события, как пролиферация β-клеток, их созревание и формирование панкреатических островков. Однако участие нервной системы в развитии эндокринной части поджелудочной железы, в особенности у человека, остается малоизученным. В рамках данного исследования получены новые данные о присутствии в составе нейро-инсулярных комплексов развивающейся поджелудочной железы человека клеток с иммунофенотипом, характерным для незрелых клеток протоков железы (инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ и инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+), а также бигормональных (инсулин+/глюкагон+ и инсулин+/соматостатин+) клеток. Эти результаты служат морфологическим подтверждением интеграции структур нернвой системы с прогениторными клетками и дифференцирующимися и созревающими эндокринными клетками во время пренатального развития поджелудочной железы человека. Вероятно, такая интеграция необходима для регуляции пролиферации и созревания β-клеток, как это было показано в экспериментальных работах. Дальнейшие исследования, направленные на определение фенотипов дифферецирующихся эндокринных клеток и их взаимодействий со структурами нервной системы, в том числе с привлечением методов секвенирования транскриптома отдельных клеток и пространственной транскриптомики, в комплексе с экспериментальными работами, помогут выяснить характер и функциональную роль регуляторных воздействий нервной системы на дифференцировку эндокринных клеток у человека.

 

 

 

Дополнительная информация

Источник финансирования. Проведение исследования и написание статьи осуществлено в рамках государственного задания № 123053000048-6.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Ю.С. Кривова — дизайн исследования, проведение иммуногистохимических реакций, анализ препаратов, получение и обработка изображений и написание текста статьи; А.Е. Прощина — дизайн исследования, сбор и анализ литературных источников, редактирование текста статьи; О.С. Годовалова — проведение иммуногистохимических реакций, сбор и анализ литературных источников, редактирование текста статьи; С.В. Савельев — дизайн исследования, анализ препаратов, написание текста и редактирование статьи.

Additional information

Funding source. The research and writing of the article were carried out within the framework of the state assignment N 123053000048-6.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Yu.S. Krivova — study design, immunohistochemistry, analysis of preparations, image capturing and processing, manuscript writing; A.E. Proshchina — study design, collection and analysis of literary sources, manuscript editing; O.S. Godovalova — immunohistochemistry, collection and analysis of literary sources, manuscript editing; S.V. Saveliev — study design, analysis of preparations, manuscript writing and editing.

 

 

 

Таблицы

Таблица 1. Перечень использованных в работе первичных и вторичных антител.

Table 1. The list of the used primary and secondary antibodies.

№	Название Name	Производитель Company	Кат. № Cat. No.	Рабочие разведения Dilutions
1	Поликлональные антитела морской свинки к инсулину Polyclonal guinea pig antibodies to insulin	Thermo Fisher Scientific Inc.	PA1-26938	1:400
2	Мышиные моноклональные антитела к глюкагону Mouse monoclonal antibodies to glucagon	Sigma	G2654	1:4000
3	Кроличьи поликлональные антитела к соматостатину Rabbit polyclonal antibodies to somatostatin	Abcam	Ab103790	1:500
4	Кроличьи моноклональные антитела к PDX1 Rabbit monoclonal antibodies to PDX1	Huabio	ET1705-99	1:400
5	Кроличьи поликлональные антитела к нейрон-специфическому β3 тубулину Rabbit polyclonal antibodies to neuron-specific β3 tubulin	Abcam	ab18207	1:500
6	Мышиные моноклональные антитела к нейрон-специфическому β3 тубулину Mouse monoclonal antibodies to neuron-specific β3 tubulin	Abcam	ab78078	1:500
7	AlexaFluor®488 goat anti-guinea pig IgG(H+L)	Molecular Probes	A11073	1:500
8	IFluor™594 conjugated goat anti-rabbit IgG	Huabio	HA1126	1:500
9	IFluor™594 conjugated goat anti-mouse IgG	Huabio	HA1122	1:500
10	Cy5 conjugated goat anti-mouse IgG	Huabio	HA1110	1:500
11	Cy5 conjugated goat anti-rabbit IgG	Huabio	HA1103	1:500

 

 

Подписи к Рисункам

Рис. 1. Изображения оптических срезов поджелудочной железы плодов на 9-й (a–d), 15-й–16-й (e–h), 20-й–21-й (i–l) и 21-й–22-й неделях гестационного развития, иллюстрирующие присутствие инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин¯ (стрелки) и инсулин¯/PDX1+/β3-тубулин+ (короткие стрелки) клеток в составе отдельно расположенных ганглиев (a–d, i–l) и ганглиев, образующих нейро-инсулярные комплексы с панкреатическими островками плащевого (c–h) и биполярного (m–p) типа. Тройное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к инсулину (зеленый) (b, f, j, n), PDX1 (пурпурный) (c, g, k, o) и β3-тубулину (белый) (d, h, l, p); a, e, i, m – совмещенные изображения; ядра окрашены DAPI. Зелеными стрелками отмечены некоторые одиночные β-клетки; 1 – проток поджелудочной железы; 2 – нервный ганглий; 3 – панкреатический островок.

Fig. 1. Images of the z-planes of the sections of the fetal pancreas at 9^th (a–d), 15^th–16^th (e–h), 20^th–21^st (i–l) and 21^st–22^nd gestational weeks illustrating the presence of insulin¯/PDX1+/β3-tubulin¯ (arrows) and insulin¯/PDX1+/β3-tubulin+ (arrowheads) cells in the separately located ganglia (a–d, i–l) and ganglia forming neuro-insular complexes with the mantle (c–h) and bipolar (m–p) pancreatic islets. Triple immunofluorescent staining for insulin (green) (b, f, j, n), PDX1 (magenta) (c, g, k, o) and β3-tubulin (white) (d, h, l, p); a, e, i, m – merged images; nuclei are stained by DAPI. Green arrows show single β-cells; 1 – pancreatic duct; 2 – ganglion; 3 – pancreatic islet.

 

 Рис. 2. Изображения оптических срезов поджелудочной железы плодов на 16-й (a–d, i–l), 18-й (e–h), и 21-й–22-й неделях гестационного развития, иллюстрирующие присутствие бигормональных инсулин+/глюкагон+/β3-тубулин¯ (стрелки) и инсулин+/глюкагон+/β3-тубулин+ (короткие стрелки) клеток в нейро-инсулярных комплексах. Тройное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к инсулину (зеленый) (b, f, j, n), глюкагону (красный) (c, g, k, o) и β3-тубулину (белый) (d, h, l, p); a, e, i, m – совмещенные изображения; ядра окрашены DAPI. a–d: инсулин+/глюкагон+ клетки в ганглии, интегрированном с панкреатическим островком; e–h: инсулин+/глюкагон+ клетка в кластере эндокринных клеток, интегрированном с пучком нервных волокон; i–l: отдельная инсулин+/глюкагон+ клетка в нервном волокне, отходящем от ганглия; m–p: инсулин+/глюкагон+ клетки в отдельно расположенном ганглии.    1 – нервный ганглий; 2 – панкреатический островок; 3 – нервные волокна.

Fig. 2. Images of the z-planes of the sections of the fetal pancreas at 16^th (a–d, i–l), 18^th (e–h), and 21^st–22^nd gestational weeks illustrating the presence of bi-hormonal insulin+/glucagon+/β3-tubulin¯ (arrows) and insulin+/glucagon+/β3-tubulin+ (arrowheads) cells in the neuro-insular complexes. Triple immunofluorescent staining for insulin (green) (b, f, j, n), glucagon (red) (c, g, k, o) and β3-tubulin (white) (d, h, l, p); a, e, i, m – merged images; nuclei are stained by DAPI. a–d: insulin+/glucagon+ cells in the ganglion integrated with the pancreatic islet; e–h: insulin+/glucagon+ cells in the cluster of endocrine cells integrated with the nerve bundle; i–l: single insulin+/glucagon+ cell in the nerves passing from the ganglion; m–p: insulin+/glucagon+ cells in the separately located ganglion. 1 – ganglion; 2 – pancreatic islet; 3 – nerve fibers.

 

Рис. 3. Изображения оптических срезов поджелудочной железы плодов на 15-й–16-й (a–d), 19-й (e–h), 16-й (i–l) и 25-й (m–p) неделях гестационного развития, иллюстрирующие распределение бигормональных инсулин+/соматостатин+/β3-тубулин¯ (стрелка) и инсулин+/соматостатин+/β3-тубулин+ (короткая стрелка) клеток в нейро-инсулярных комплексах. Тройное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к инсулину (зеленый) (b, f, j, n), соматостатину (красный) (c, g, k, o) и β3-тубулину (белый) (d, h, l, p); a, e, i, m – совмещенные изображения; ядра окрашены DAPI. a–h: инсулин+/соматостатин+ клетки в комплексах, образованных структурами нервной системы, интегрированными с панкреатическими островками (a–d) или кластерами эндокринных клеток (e–h); i–p: моногормональные соматостатин+ в комплексах, состоящих из отдельных гормоносодеражщих клеток интегрированных с нейронами (i–l) и нервными волокнами (m–p), в которых инсулин+/соматостатин+ клетки не обнаружены. 1 – нервный ганглий; 2 – панкреатический островок; 3 – нервные волокна.

Fig. 3. Images of the z-planes of the sections of the fetal pancreas at 15^th–16^th (a–d), 19^th (e–h), 16^th (i–l) and 25^th gestational weeks illustrating the distribution of insulin¯/somatostain+/β3-tubulin¯ (arrows) and insulin¯/somatostatin+/β3-tubulin+ (arrowheads) cells in the neuro-insular complexes. Triple immunofluorescent staining for insulin (green) (b, f, j, n), somatostatin (red) (c, g, k, o) and β3-tubulin (white) (d, h, l, p); a, e, i, m – merged images; nuclei are stained by DAPI. a–h: insulin+/somatostatin+ cells in complexes consisting of the structures of the nervous system integrated with the pancreatic islets (a–d) and endocrine cell clusters (e–h); i–p: monohormonal somatostain+ cells in complexes consisted of single endocrine cells integrated with the ganglia (i–l) or nerve fibers (m–p), in which insulin+/somatostain+ cells were not etected. 1 – ganglion; 2 – pancreatic islet; 3 – nerve fibers.

About the authors

Yuliya S Krivova

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Center of Surgery

Author for correspondence.
Email: homulkina@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-9692-3616

к.б.н.

Russian Federation, Moscow

Alexandra E. Proshchina

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: proshchina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0515-8275
SPIN-code: 8899-5104

Dr. Sci. (Biol.), Associate Professor

Russian Federation, Moscow

Olga S. Godovalova

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: asinello@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9285-7241
SPIN-code: 8770-0481

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Sergey V. Saveliev

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: braincase@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1447-7198
SPIN-code: 2079-6351

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files