The effect of different lighting modes on the ultrastructure of rat pinealocytes

Full Text

Обоснование

Эпифиз (пинеальная, шишковидная железа) играет ключевую роль в регуляции циркадных ритмов и синтезе мелатонина — гормона, отвечающего за суточные биоритмы и адаптацию организма к изменениям освещённости. Известно, что активность и морфологическое состояние пинеалоцитов, основных клеток эпифиза, тесно связаны с условиями светового режима. Различные режимы освещения, включая темновую депривацию (ТД), постоянную темноту, а также воздействие света разной длины волны, способны вызывать значительные ультраструктурные изменения в пинеалоцитах крыс.

Нормальная работа эпифиза – важное условия для поддержания гомеостаза в процессе старения. С возрастом в пинеалоцитах происходят значительные ультраструктурные изменения, включая увеличение количества плотных телец (лизосом), появление липофусциновых гранул, а также прогрессирующую кальцификацию, что отражает возрастные процессы дегенерации и снижение функциональной активности железы [1-4].

Ранее было показано, что при воздействии постоянной темноты у крыс наблюдается увеличение числа и размеров митохондрий, липидных капель, а также расширение цистерн шероховатой эндоплазматической сети, что свидетельствует о повышении метаболической активности клеток. В то же время, при постоянном освещении отмечается уменьшение количества митохондрий и липидных включений, а также снижение активности пинеалоцитов [5].

Кратковременные световые импульсы ночью вызывают быстрое уменьшение объёма митохондрий, аппарата Гольджи и липидных капель, что интерпретируется как морфологические признаки снижения активности клеток [6]. Кроме того, воздействие света различной длины волны по-разному влияет на ультраструктуру пинеалоцитов: синий свет приводит к снижению числа и нарушению структуры митохондрий, тогда как красный свет оказывает менее выраженное влияние[7-8].

Исследования показывают, что у старых животных уменьшается общее количество пинеалоцитов, увеличивается доля так называемых «тёмных» клеток с признаками дегенерации, а также накапливаются кальциевые конкременты, преимущественно в митохондриях и липидных каплях. Эти процессы сопровождаются снижением ночной продукции мелатонина, что может способствовать нарушению суточных ритмов и развитию возрастных патологий [9].

Таким образом, изучение влияния различных режимов освещения на ультраструктуру пинеалоцитов крыс позволяет глубже понять механизмы адаптации эпифиза к изменениям внешней среды и регуляции циркадных ритмов, а также может иметь значение для разработки подходов к коррекции нарушений биоритмов.

Цель исследования – изучить ультраструктуру эпифиза крыс стока Вистар в условиях постоянного освещения и светового режима, модулирующего сменный режим работы «сутки / двое».

Методы

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное контролируемое, рандомизированное, продольное исследование на лабораторных животных с параллельными группами.

Условия проведения исследования

Исследование было проведено на крысах-самцах линии Вистар (n=120) весом 220±15 грамм в возрасте 5 мес. Животные были получены из питомника. Исследование проводилось в осенне-зимний период.

Всех животных содержали в стандартных пластиковых клетках, при температуре 20–22°С и относительной влажности воздуха 60-70%. Животные имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб», Россия; сертификат соответствия No POCCRU.nO81B00113, ГОСТ P50258-92) и первоначально содержались при естественном освещении.

Критерии соответствия (отбора)

Критерием включения в исследование являлось отсутствие видимых отклонений в поведении и внешнем виде (состоянии шерсти, глаз, конечностей).

Описание вмешательства

Экспериментальные животные были разделены нами на 3 равные группы:

1) Контроль – (n=40) – содержалась в условиях фиксированного светового режима (ФС) (соотношение свет/темнота 10:14).

2) I экспериментальная группа – (n=40) – находилась под влиянием темновой депривации (ТД).

3) II экспериментальная группа – (n=40) – находилась в условиях светового режима, моделирующего сменную работу (1 сутки – круглосуточное освещение, двое суток – световой режим, аналогичный контрольной группе).

Каждый эксперимент длился три недели. Выведение животных из эксперимента с помощью передозировки диэтиловым эфиром проводили 22-е сутки в четырёх временных точках (9:00, 15:00, 21:00, 3:00).

Исходы исследования

Основной исход исследования.

Была проведена оценка качественных и количественных изменений структурной картины эпифиза и ультраструктуры пинеалоцитов

Дополнительные исходы исследования

не изучали.

Методы регистрации исходов

Световая микроскопия.

Часть эпифизов фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине с дальнейшей проводкой по спиртам возрастающей концентрации (50°, 60°, 70°, 80° и 96°) и ксилолам с последующей заливкой в гистологическую среду «Гистомикс» (БиоВитрум, Россия). Серийные гистологические срезы толщиной 5-6 мкм изготавливали на роторном микротоме Leica SM2010 R (Германия). Окраску гематоксилином и эозином осуществляли по общепринятой методике.

Микроскопию гистологических препаратов проводили на цифровом микроскопе Leica DM 2500 с применением цифровой фотокамеры Leica DFC 290 (Германия). Для микроскопии были использованы окуляры ×10, объективы ×4, ×10, ×20, ×40. С каждого исследованного препарата выполняли по 5 цифровых снимков случайно выбранных полей зрения при увеличении ×200, с использованием которых оценивали морфологическую картину структур эпифиза.

Электронная микроскопия.

Образцы эпифиза размерами до 2 мм³ фиксировали 2,5-% раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), затем дофиксировали в 1-% растворе оксида осмия (OsO₄), обезвоживали в этаноле, в процессе обезвоживания контрастировали 1-% уранилацетатом на 70-% этаноле и проводили заливку в смесь эпон-аралдит по стандартной методике [10].

Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме UC Enuity (Leica Microsystems CMS GmbH, Германия), дополнительно контрастировали с использованием цитрата свинца по Рейнольдсу, просматривали в сканирующем электронном микроскопе с полевой эмиссией HIMERA EM50X (CIQUTEK, Китай) и фотофиксировали.

Для микроморфометрической оценки митохондриального аппарата пинеалоцитов в каждом препарате анализировали 20 непересекающихся полей зрения при увеличении 20 тыс. и 10 полей зрения при увеличении 50 тыс. Для стандартизации результатов исследования на полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, для анализа выбирали однотипные участки.

Для стереометрических исследований использовали метод диссектора [11]. С помощью программы QuPath определяли:

• площадь профиля пинеалоцита,
• площадь поперечного сечения ядра пинеалоцита,
• периметр ядра пинеалоцита.

При помощи программы «ImageJ» определяли:

• среднюю площадь профиля одной митохондрии,
• долю профиля митохондрий,
• средний периметр одной митохондрии,
• среднее количество крист в 1 митохондрии,

Так же на электронограммах определяли:

• площадь профиля аппарата Гольджи,
• доля профиля липидных капель в цитоплазме 1 пинеалоцита,
• площадь профиля лизосом.

Все измерения проводили на поперечном срезе митохондрий. Для анализа выбирали однородные области. Анализ проводили в 10 случайных полях зрения (×10 000, площадь 25 мкм² каждое) для определения численной плотности митохондрий и размеров пинеалоцитов и их ядер, а также в 10 случайных полях зрения (×20 000, площадь 6,25 мкм² каждое) для микроморфометрии митохондрий и комплекса Гольджи [12-15].

Анализ в подгруппах

Не планировался

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

Количество животных в группе определялось для обеспечения статистической достоверности проводимого в дальнейшем косинор-анализа полученных данных. Согласно данным литературы, размер выборки n=10 на группу обеспечивает приблизительно 80% статистической мощности при уровне значимости α=0,05 в данном случае. Таким образом, для обеспечения достоверности результатов было использовано по 10 животных на каждую временную точку, что в итоге составило 40 животных в экспериментальной группе [16-18].

Статистические методы

Статистическую обработку результатов и построение графиков выполняли в программе GraphPad Prism v8.41 (GraphPad Software, США). Для проверки типа распределения значений в выборках использовали тест Д’Агостино–Пирсона. При нормальном распределении показателя использовали t-тест Стьюдента для парного сравнения и тест Тьюки для сравнения трёх и более групп. Различия между группами исследования и контролем оценивали с помощью теста Даннета. При распределении, отличном от нормального, использовали тест Манна–Уитни для парного сравнения и тест Данна для сравнения трёх и более групп. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости (α) или вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы ниже 5% (p <0,05).

 

Результаты

Формирование выборки

Формирование выборки и этапы исследования отражены на рисунке 1.

Рис. 1. Последовательность формирования выборки исследования.

Характеристики выборки

Основные результаты исследования

Проведенное исследование позволило установить, что морфологическая картина эпифиза крыс контрольной группы соответствует норме. В железе отмечены четко оформленные дольки, разделённые между собой трабекулами. Основной пул клеток эпифиза представлен двумя типами пинеалоцитов и глиальными клетками. Ядра пинеалоцитов округлые или овальные, занимали большую часть цитоплазмы. На светооптическом уровне дифференцировать светлые и темные пинеалоциты не удалось. Признаков патологических изменений не наблюдалось (Рис. 2, А). У крыс I экспериментальной группе при сохранной структуре органа отмечается наличие вакуолей в пинеалоцитах, встречаются отдельные некротизированные клетки (отмечены стрелкой) (Рис. 2, Б). структура органа животных II экспериментальной группы соответствовала норме.

Рис. 2. Срезы эпифиза крыс Вистар при различных световых режимах. Обозначения: В – вакуоли в пинеалоцитах, стрелка – некротизированные клетки. А – контрольная группа, Б – I экспериментальная группа, В – II экспериментальная группа. Окрашивание гематоксилином и эозином, ×400.

Анализ клеточности показал, что у животных первой группы количество профилей пинеалоцитов на 1 мкм² снижается от 785,2±54,7 шт/мкм² в контроле до 646,6±62,1 шт/мкм², в то время как у животных второй группы этот показатель составил 800,4±72,84 шт/мкм², что достоверно выше, чем у крыс первой группы, но не отличается от показателей контроля.

Анализ ультраструктуры пинеалоцитов позволил установить, что в эпифизе контрольных животных цитоплазма светлых пинеалоцитов содержит большое число секреторных пузырьков и цистерн, крупные митохондрии с малым числом крист и электроннопрозрачным матриксом. Для светлых пинеалоцитов характерно умеренное развитие шероховатой ЭПС и выраженное – комплекса Гольджи (Рис. 3, А-В). Темные пинеалоциты, диффузно расположенные между светлыми, характеризуются меньшим линейными размерами, электронноплотной цитоплазмой, содержащей большое число гранул, развитой гладкой и шероховатой ЭПС, содержанием большого числа мелких конденсированных митохондрий с плотной упаковкой крист, мелких секреторных пузырьков. Для темных пинеалоцитов характерно более высокое содержание в цитоплазме липидных капель. Данные клетки имеют длинные отростки, контактирующие с многочисленными кровеносными сосудами (Рис. 3, Г). Клетки обоих типов содержат крупные эухроматические ядра неправильной формы. Картина ультраструктурного строения эпифиза в контрольной группе соответствует норме.

Рис. 3. Эпифиз животных контрольной группы. Ультраструктурная картина соответствует норме. Обозначения: Я –ядро, ГЭР – гранулярный эндоплазматический ретикулум, КГ – комплекс Гольджи, ПС – полисомы, М – митохондрии, НМ – наружная мембрана, ВН – внутренняя мембрана, МП (стрелка) – мембранное пространство, К – кристы, М – матрикс. ТЭМ, А, Г － ×8000, Б － ×14000, В － ×30000.

В эпифизах животных группы, подвергавшейся воздействию постоянного освещения, отмечается выраженный отек стромы. Нарушен контакт отростков темных пинеалоцитов с кровеносными сосудами. Цитоплазма как светлых, так и темных темных пинеалоцитов значительно вакуолизирована; липидные включения в цитоплазме подвержены деструкции, характерной для процесса перекисного окисления. Аналогичный процесс затрагивает компоненты ряда мембранных органоидов (ЭПС, комплекс Гольджи), приводя к образованию миелиноподобных телец. Сохранные участки мембранных органоидов расширены, вакуолизированы (Рис. 4, В-Г). Ядра пинеалоцитов характеризуются выраженными инвагинациями кариолеммы, усилением гетерохроматизации, формированием перинуклеарного венца (Рис. 4, А).

Рис. 4. Эпифизы животных группы, подвергавшейся воздействию постоянного освещения. Обозначения: АФС – аутофагосома, Я – ядро, М – митохондрии, ГЭР – гранулярный эндоплазматический ретикулум, ЭР – гладкий эндоплазматический ретикулум, КГ – комплекс Гольджи, Л – лизосомы, Р – рибосомы, ПС – полисомы, СС – синаптическая сфера, СЛ – синаптическая лента. ТЭМ, А, Б – ×8000, В – ×12000, Г – ×28000.

Отмечается повсеместное набухание митохондрий с вакуолизацией и частичной деструкцией их крист, запустением матрикса. Новообразованные митохондрии отличаются полиморфизмом форм с тенденцией к удлинению и веретеновидности (Рис. 5, А). В ряде клеток отмечаются как обычные, так и гигантские фаголизосомы, содержащих многочисленные фрагменты клеточных органоидов. Отмечается значительное присутствие отдельных клеток в состоянии некроза. Периваскулярно наблюдается присутствие лейкоцитарного инфильтрата (Рис. 5, Б).

Рис. 5. Эпифизы животных группы, подвергавшейся воздействию постоянного освещения. ТЭМ, А – набухшая митохондрия, ×45000, Б – периваскулярный лейкоцитарный инфильтрат, ×12000. Обозначения: ЛЦ – лейкоцитарный инфильтрат, К- капилляр, Я –ядро, ГХ – гетерохроматин, Л – лизосомы, ПС – полисомы, НМ – наружная мембрана, ВН – внутренняя мембрана, МП (стрелка) – мембранное пространство, К – кристы, М – матрикс.

Ультраструктурная картина эпифиза при воздействии сменного режима (сутки-двое) имеет ряд отличий. Так, при аналогичной направленности изменений в органоидах пинеалоцитов животных в данной группе, они характеризуются различной выраженностью: отмечается сохранность функционально активных ЭПС и комплекса Гольджи, при локальном их набухании, малое содержание вакуолей в цитоплазме (Рис. 6, А). Однако в ядрах пинеалоцитов животных данной группы значительно более выражена гетерохроматизация (Рис. 6, Б). Наиболее же выраженным проявлением эффекта сменного режима в пинеалоцитах в данной группе являются изменения в ультраструктуре митохондрий. Функционально активные митохондрии отличаются крупными размерами, чрезвычайно низкой электронной плотностью матрикса, извитой формой и набуханием крист при их локальной деструкции с образованием в митохондрии мембранных агрегатов. При этом количество погибших, вакуолизированных митохондрий превышает таковое в группе, подвергавшейся воздействию постоянного освещения (Рис. 6, В-Г).

Рис. 6. Эпифизы животных группы, подвергавшейся воздействию сменного режима. Обозначения: АФС – аутофагосома, Я – ядро, М – митохондрии, ГЭР – гранулярный эндоплазматический ретикулум, ЭР – гладкий эндоплазматический ретикулум, КГ – комплекс Гольджи, ПС – полисомы, СЛ – синаптическая лента. ТЭМ, А, – ×14000, Б – ×4500, В – ×20000, Г – ×40000.

Межклеточный отек выражен в меньшей степени, однако отмечается значительный периваскулярный. Выраженность некротических изменений незначительная (Рис. 7).

Рис. 7. Эпифиз животных группы, подвергавшейся воздействию сменного режима. ПО – периваскулярный отёк. ТЭМ, ×2300.

Проведенные микроморфометрические исследования позволили выявить рад межгрупповых различий в величине исследованных показателей.

Так, что доля светлых клеток в экспериментальных группах оказывается ниже, чем в контроле, и соответственно, у животных этих групп увеличивается доля темных пинеалоцитов (Табл. 1).

Таблица 1. Доля светлых и темных пинеалоцитов в эпифизе крыс.

Table 1. The proportion of light and dark pinealocytes in the rat pineal gland.

Группа	Светлые клетки, %	Темные клетки, %
Контроль	70,80±3,87	29,12±3,85
I группа	65,41±6,16 **	34,55±6,16 **
II группа	62,90±6,14 ***	37,10±6,14 ***

Примечание: здесь и далее в таблицах: * p ≤0,05; ** p ≤0,005; *** p ≤0,0005 по сравнению с контрольной группой, + p ≤0,05; ++ p ≤0,005; +++ p ≤0,0005 – между I и II группами.

Note: here and further in the tables: * p <0.05; ** p <0.005; *** p <0.0005 compared to the control group, + p <0.05; ++ p < 0.005; +++ p <0.0005 – between groups I and II.

Режим освещения оказывает влияния на размеры ядер и профиля клеток. В светлых пинеалоцитах отмечается резкое и высокодостоверное уменьшение площади ядра на 25%, уменьшение площади ядра менее выражено во второй группе. Периметр ядра и площадь профиля пинеалоцита достоверно снижается только в пинеалоцитах 1 группы (Табл. 2)

Таблица 2. Микроморфометрические параметры светлых пинеалоцитов эпифиза крыс.

Table 2. Micromorphometric parameters of pale pinealocytes of the rat pineal gland.

Группа	Площадь поперечного сечения ядра пинеалоцита, мкм2	Периметр ядра пинеалоцита, мкм	Площадь профиля пинеалоцита, мкм2
Контроль	13,67±1,92	15,04±1,11	39,92±6,77
I группа	10,29±1,37 ***	13,24±1,94 ***	33,68±5,40 ***
II группа	12,26±2,06 * +++	14,65±2,53 +	37,35±5,41 +

В темных пинеалоцитах существенное снижение ядра относительно контроля отмечается только в первой группе, то же справедливо и в отношении площади профиля пинеалоцита. Колебания периметра ядра не носят достоверный характер (Табл. 3).

Таблица 3. Микроморфометрические параметры темных пинеалоцитов эпифиза крыс.

Table 3. Micromorphometric parameters of dark pinealocytes of the rat pineal gland.

Группа	Площадь поперечного сечения ядра пинеалоцита, мкм2	Периметр ядра пинеалоцита, мкм	Площадь профиля пинеалоцита, мкм2
Контроль	9,93±1,22	10,98±1,22	29,37±1,84
I группа	8,15±0,73 ***	10,69±1,27	25,26±2,55 ***
II группа	9,64±1,27 +++	10,56±1,22	28,45±3,24 +++

Стереологические исследования вследствие технических возможностей удалось провести только в отношении светлых пинеалоцитов. В частности, в них отмечено увеличение доли профиля митохондрий и профиля лизосом при снижении доли профиля комплекса Гольджи и липидных капель (Табл. 4).

Таблица 4. Профили площадей органоидов и включений в светлых пинеалоцитах.

Table 4. Profiles of organoid areas and inclusions in light pinealocytes.

Группа	Доля профиля митохондрий,%	Доля профиля комплекса Гольджи, %	Площадь профиля липидных капель, мкм2	Площадь профиля лизосом, мкм2
Контроль	19,10±1,27	2,31±0,19	4,40±0,37	0,30±0,032
I группа	28,15±1,83 ***	1,25±0,19 ***	2,12±0,16 ***	0,59±0,098 ***
II группа	27,16±2,44 *** +++	1,72±0,20 *** +++	2,0±0,15 *** ++	0,72±0,062 *** +++

В митохондриях происходит снижение площади профиля в первой группе и снижение периметра и количеств крист в митохондриях пинеалоцитов обеих экспериментальных групп (Табл. 5).

Таблица 5. Микроморфометрические показатели митохондрий светлых пинеалоцитов.

Table.5. Micromorphometric parameters of light pinealocyte mitochondria.

Группа	Площадь профиля митохондрии, мкм2	Периметр митохондрии, мкм	Количество крист в митохондрии, шт
Контроль	0,36±0,057	1,97±0,1	15,01±0,93
I группа	0,22±0,077 ***	1,38±0,16 ***	10,06±1,43 ***
II группа	0,23±0,08	1,59±0,16 *** +++	11,90±2,20 *** +++

Дополнительные результаты исследования

Нежелательные явления

Обсуждение

Резюме результатов исследования

Проведенное исследование ультраструктурных изменений пинеалоцитов крыс линии Вистар в условиях различных режимов освещения выявило комплекс значительных морфофункциональных изменений органа, отражающих нарушения циркадной регуляции и клеточного метаболизма в эпифизе. Полученные данные не только согласуются с результатами предыдущих исследований, но и позволяют глубже понять адаптационные и дезадаптационные процессы в пинеальной железе при хроническом световом стрессе и нестабильном световом режиме.

Интерпретация результатов исследования

Ультраструктурная картина эпифиза животных контрольной группы, находящихся в стандартном виварийном режиме освещения (10 часов света / 14 часов темноты), полностью соответствует классическим представлениям о морфологии функционально активной пинеальной железы [19-21]. Четкое разделение паренхимы на дольки, представленные двумя основными популяциями клеток – светлыми и темными пинеалоцитами, – является гистологической нормой.

Наблюдаемые ультраструктурные различия между этими типами клеток, по всей видимости, отражают разные функциональные состояния или фазы секреторного цикла одного и того же клеточного типа [7]. Светлые пинеалоциты представляются клетками в фазе активного синтеза и секреции мелатонина и других пептидных соединений. Такая организация цитоплазмы оптимальна для интенсивного метаболизма и векторного транспорта секреторных продуктов. Темные пинеалоциты могут соответствовать либо менее активной фазе, либо, что более вероятно, фазе синтеза и накопления предшественников. Соотношение светлых и темных клеток в контрольной группе (примерно 70% к 30%) является, по-видимому, оптимальным для поддержания нормального циркадного ритма секреции мелатонина. Это динамическое равновесие находится под строгим контролем супрахиазматического ядра и напрямую зависит от симпатической иннервации, активирующейся в темноте.

Влияние постоянного освещения приводит к выраженным негативным ультраструктурным изменениям, которые можно охарактеризовать как картину тяжелого клеточного стресса, дезинтеграции метаболических процессов и прямого подавления секреторной функции.

Выраженный отек стромы и нарушение контактов отростков пинеалоцитов с кровеносными сосудами являются весьма важными находками. Отек свидетельствует о нарушении гемодинамики и проницаемости сосудистой стенки, возможно, вследствие высвобождения вазоактивных веществ и провоспалительных цитокинов на фоне хронического стресса [19]. Разрыв контактов между пинеалоцитами и капиллярами физически затрудняет процесс секреции мелатонина в системный кровоток, что является прямым морфологическим подтверждением его сниженной продукции.

Массивная вакуолизация цитоплазмы светлых и темных пинеалоцитов – классический признак повреждения мембран. Деструкция липидных включений с образованием миелиноподобных телец однозначно указывает на интенсификацию процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Постоянный свет, подавляя синтез мелатонина, лишает эпифиз его мощного эндогенного антиоксиданта. Мелатонин известен своей способностью нейтрализовать реактивные формы кислорода (АФК) и стимулировать активность антиоксидантных ферментов [22]. В его отсутствие АФК, образующиеся в ходе нормального метаболизма, особенно в митохондриях, беспрепятственно атакуют полиненасыщенные жирные кислоты мембран, приводя к их дестабилизации, увеличению проницаемости и формированию миелиноподобных структур. Расширение и вакуолизация цистерн ЭПС и комплекса Гольджи также являются следствием мембранного повреждения и нарушения ионного гомеостаза в клетке.

Выраженная гетерохроматизация ядер, инвагинации кариолеммы и формирование перинуклеарного венца являются ультраструктурными маркерами подавления транскрипционной активности в клетке. Переход хроматина в конденсированное, гетерохроматиновое состояние означает репрессию генов. Учитывая, что ключевые ферменты синтеза мелатонина, такие как AA-N-AT (арилалкиламин-N-ацетилтрансфераза), регулируются на транскрипционном уровне и их экспрессия резко возрастает в темноте, наблюдаемые ядерные изменения можно рассматривать в качестве морфологического субстрата репресии синтеза ферментов под действием света.

Изменения митохондрий при постоянном освещении носят парадоксальный характер. С одной стороны, стереологические данные показывают увеличение доли профиля митохондрий в цитоплазме светлых пинеалоцитов почти на 50 %. Это можно трактовать как компенсаторную реакцию – попытку клетки увеличить энергетическую мощность в условиях стресса. Однако качественный анализ свидетельствует о глубокой патологии этих органелл: набухание, вакуолизацию и деструкцию крист, запустение матрикса. Микроморфометрия подтверждает это: при увеличении общей митохондриальной массы, площадь профиля отдельной митохондрии и количество крист снижается.

Такого рода изменения являются признаком некогерентной гиперплазии – увеличения количества структурно неполноценных органелл [23-24]. Новообразованные митохондрии полиморфны, часто удлинены, что может быть связано с нарушением процессов митохондриального биогенеза и фиссии/фузии в условиях окислительного стресса. Снижение количества крист напрямую указывает на снижение площади внутренней мембраны, где расположены дыхательные цепи, а значит, и на резкое падение способности к синтезу АТФ. Таким образом, митохондрии в первой группе хоть и многочисленны, но функционально несостоятельны, что ведет к энергетическому голоданию клетки.

Присутствие обычных и гигантских фаголизосом, содержащих фрагменты органелл является явным признаком активированного аутофагического процесса[25]. В условиях стресса аутофагия является механизмом выживания, позволяющим утилизировать поврежденные компоненты и получить дополнительные ресурсы [26-27]. Стереометрическое увеличение доли профиля лизосом почти на 100% подтверждает активацию этой системы. Однако наличие многочисленных клеток в состоянии некроза и лейкоцитарного инфильтрата свидетельствует о том, что компенсаторные механизмы (аутофагия, увеличение числа митохондрий) оказались неспособными компенсировать повреждения, вызванные постоянным освещением, и гибель клеток становится массовой.

Ультраструктурные изменения в эпифизе крыс II группы, подвергавшихся воздействию сменного режима освещения, имеют иную качественную и количественную выраженность. Если постоянный свет – это модель прямого подавления функции, то нерегулярный, непредсказуемый режим – это модель хронического десинхроноза, при котором нарушается сама временная организация физиологических процессов.

В отличие от первой группы, во второй отмечается относительная сохранность ЭПС и комплекса Гольджи при локальном их набухании. Меньшая вакуолизация цитоплазмы также говорит о менее выраженном оксидативном стрессе. Это может быть связано с тем, что в периоды темноты у животных все же происходили эпизоды активации синтеза мелатонина, который оказывал свое антиоксидантное действие. Однако сам факт наличия патологических изменений указывает на то, что этих эпизодов было недостаточно для полной нормализации состояния, либо непредсказуемая смена циклов сама по себе является мощным стрессором.

Гетерохроматия ядер в этой группе была даже более выраженной, чем при постоянном свете. Это может отражать глубокое нарушение работы циркадных осцилляторов на уровне генома. Супрахиазматическое ядро, получающее противоречивые сигналы из-за нестабильного режима, не может адекватно синхронизировать периферические часы в эпифизе. В результате гены, работающие циркадно, теряют свою ритмичность и, как следствие, свою нормальную экспрессию, что морфологически проявляется в конденсации хроматина.

Самым значительным отличием второй группы являются изменения в митохондриях. Они были крупными, с чрезвычайно низкой электронной плотностью матрикса и извитыми, набухшими кристами. При этом количество вакуолизированных, погибших митохондрий было даже выше, чем в первой группе. По-видимому, в данном случае наблюдается нарушение регуляции митоптоза. Низкая электронная плотность матрикса свидетельствует о нарушении трансмембранного потенциала и ионного гомеостаза, что является триггером для открытия пор митохондриальной проницаемости и запуска клеточной смерти [26]. Таким образом, сменный режим, возможно, в большей степени, чем постоянный свет, провоцирует именно митохондриально-опосредованные пути гибели клеток.

Меньшая выраженность межклеточного отека и некротических изменений по сравнению с I группой указывает на то, что тотальный оксидативный стресс здесь играет меньшую роль, чем нарушение временной организации и сигнальных путей, регулирующих жизненный цикл клетки и ее органелл.

Стереологические и микроморфометрические данные предоставляют объективное доказательство выявленных ультраструктурных сдвигов.

Достоверное снижение доли светлых пинеалоцитов с одновременным увеличением доли темных в обеих экспериментальных группах является важным количественным показателем, мвидетельствующим о переходе части светлых, функционально активных клеток в темное, менее активное состояние в ответ на стресс. Более выраженное изменение во II группе может косвенно свидетельствовать о большей дезадаптации клеточной популяции при десинхронозе.

Уменьшение площади ядер и профиля клеток, особенно выраженное в светлых пинеалоцитах I группы, коррелирует с их вакуолизацией и общим снижением синтетической активности. Меньшая степень изменений во II группе подтверждает сделанный ранее вывод о несколько ином характере повреждения.

Увеличение доли митохондрий подтверждает наблюдение об их гиперплазии, даже если эта гиперплазия некогерентна. Резкое снижение доли комплекса Гольджи – прямое свидетельство угнетения процессов посттрансляционной модификации и упаковки секреторных продуктов. Снижение площади липидных капель более чем в 2 раза указывает на их усиленную утилизацию в условиях энергетического дефицита и/или на интенсификацию ПОЛ, а удвоение площади профиля лизосом– количественное подтверждение активации процессов внутриклеточной деградации.

На этом фоне отмечается функциональное истощение митохондрий: уменьшение площади и периметра отдельных митохондрий говорит об их фрагментации и набухании, а уменьшение количества крист – о потере их основной энергогенерирующей функции.

Проведенное исследование позволяет предположить следующую последовательность событии, приводящую к описанным изменениям в пинеальной железе. Постоянный или хаотичный световой сигнал подавляет активность супрахиазматического ядра и норадренергическую иннервацию эпифиза, что вызывает снижение экспрессия и активность фермента AA-NAT, ключевого для синтеза мелатонина. уменьшение уровня мелатонина, мощного антиоксиданта, приводит к накоплению АФК и активации ПОЛ, вызывая повреждение мембраны всех органелл (ЭПС, Гольджи, митохондрий, лизосом), и, соответственно, нарушая их функции. Повреждение митохондрий приводит к снижению выработки АТФ, окислительный стресс вызывает репрессию генома, замыкая порочный круг.

В итоге пинеалоцит пытается справиться с повреждением через аутофагию, но при невозможности компенсации запускаются механизмы некроза и апоптоза.

Заключение

Таким образом, как постоянное освещение, так и сменный режим "сутки-двое" вызывают выраженные ультраструктурные перестройки в пинеалоцитах крыс, однако характер этих перестроек различен. Постоянное освещение вызывает глубокую дезинтеграцию ультраструктуры пинеалоцитов, характеризующуюся оксидативным стрессом, подавлением транскрипционной и метаболической активности, митохондриальной дисфункцией и массовой гибелью клеток. Эти изменения являются морфологической основой для резкого угнетения синтеза мелатонина. Сменный режим освещения приводит к глубоким нарушениям в ядерном и митохондриальном аппарате пинеалоцитов, что, вероятно, связано с десинхронизацией циркадных ритмов и нарушением регуляции апоптоза. Функционально это состояние также должно сопровождаться снижением синтеза мелатонина, но, возможно, по иным, чем при постоянном свете, молекулярным механизмам. Полученные данные углубляют понимание механизмов повреждения эпифиза при нарушении светового режима и подчеркивают критическую важность сохранения стабильного циркадного цикла "свет-темнота" для поддержания структурной и функциональной целостности "биологических часов" организма.

 

 

Дополнительная информация

Вклад авторов

Д.А. Арешидзе — определение концепции; анализ данных, написание рукописи, пересмотр и редактирование рукописи; А.И. Ануркина, М.А. Козлова, В.П. Черников — сбор материала, проведение исследования; Д.А. Арешидзе, А.И. Ануркина, М.А. Козлова – анализ данных; Д.А. Арешидзе, А.И. Ануркина, М.А. Козлова, В.П. Черников – написание рукописи, пересмотр и редактирование рукописи.

Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза

Работу с животными проводили в соответствии с требованиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», и приказом Минздрава России No 267 от 19 июня 2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование одобрено биоэтическим комитетом ФГБНУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровскогого», протокол №8 от 28.09.2023 г.

Согласие на публикацию

неприменимо

Источники финансирования

Исследование выполнено в рамках государственного задания Научно-исследовательского института морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» No 122030200535-1.

Раскрытие интересов

Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние 36 месяцев с третьими лицами (физическими и юридическими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Заявление об оригинальности

Данные, представленные в рукописи, использованы впервые.

Доступ к данным

Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект

Авторы не использовали генеративный ИИ с целью создания рукописи (или значимой модификации), ее частей (включая, иллюстрации) или иных материалов, представленных на рассмотрение в журнал.

Рассмотрение и рецензирование

Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

Дисклеймер*

About the authors

Anna I. Anurkina

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Federal state budgetary scientific institution "Petrovsky National Research Centre of Surgery"

Author for correspondence.
Email: anyaaai1925@gmail.com
ORCID iD: 0009-0003-0011-1114
Scopus Author ID: 59151032800

Researcher of laboratory of Cell Pathology, Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Federal state budgetary scientific institution "Petrovsky National Research Centre of Surgery"

Russian Federation, Moscow

Maria A. Kozlova

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: ma.kozlova2021@outlook.com
ORCID iD: 0000-0001-6251-2560
SPIN-code: 5647-1372
Scopus Author ID: 55976515700

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher of Laboratory of Cell Pathology Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Federal State Budgetary Scientific Institution “Petrovsky National Research Centre of Surgery”

Russian Federation, Moscow

Valery P. Chernikov

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: 1200555@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3253-6729
SPIN-code: 3125-7837
Scopus Author ID: 7006092016

Cand. Sci. (Medicine), Leading Researcher of laboratory of Cell Pathology, Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Federal state budgetary scientific institution "Petrovsky National Research Centre of Surgery"

Russian Federation, Moscow

David A. Areshidze

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: labcelpat@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3006-6281
SPIN-code: 4348-6781
Scopus Author ID: 55929152900

Cand. Sci. (Biology), head of laboratory of Cell Pathology,  Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Federal state budgetary scientific institution "Petrovsky National Research Centre of Surgery"

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files