Age-dependent changes of cholinergic neurons of the rat small and large intestine

Full Text

Обоснование

Наибольшая популяция нейронов в метасимпатических узлах пищеварительной системы в качестве медиатора использует ацетилхолин (АХ). Ключевым ферментом синтеза ацетилхолина является холинацетилтрансфераза (ХАТ), катализирующая синтез медиатора из холина и ацетилкоэнзима А [1]. Во взрослой кишке несколько подтипов нейронов являются холинергическими, включая возбуждающие двигательные нейроны, несколько типов интернейронов и внутренние сенсорные нейроны [2, 3]. У млекопитающих орально проецирующиеся нейроны в основном являются холинергическими, анально – nNOS-ергическими. К основным возбуждающим нейротрансмиттерам относят АХ и тахикинины, к тормозящим – АТФ, NO, PACAP (пептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза), ВИП [4, 5].

Каждый из холинергических нейронов энтеральной части метасимпатической нервной системы может содержать более чем один пептид. Так, в ПС у морской свинки большую часть нейронов составляют клетки, в которых наряду с ХАТ содержатся НПY, холецистокинин и СОМ; в части клеток вместе с ХАТ обнаружена субстанция Р. В МС сочетания нейропептидов, содержащихся в одном и том же нейроне, являются еще более разнообразными [6, 7].

В пре- и постнатальном онтогенезе нейротрансмиттерный состав нейронов автономной нервной системы подвергается изменениям [8-10]. В энтеральных нейронах у мыши ацетилхолин выявляется на стадии Е10-Е12, а ХАТ – на стадии Е10.5. Тем не менее, данные об особенностях развития ХАТ-ИР нейронов в онтогенезе являются противоречивыми. По одним данным, у мыши процентное содержание ХАТ-иммунореактивных нейронов эквивалентно уровням взрослых в тонкой кишке на стадии E13.5 и проксимальном отделе толстой кишки – к моменту рождения. После этих стадий проценты остаются относительно постоянными на протяжении всего развития, несмотря на резкие изменения в плотности нейронов [11]. По другим сведениям, при рождении холинергические нейроны МС тонкой кишки мыши составляли менее половины от их взрослых пропорций (25% нейронов к моменту рождения по сравнению с 62% у взрослых) [12]. При этом отсутствуют количественные данные о количестве и морфометрических характеристиках ХАТ-иммунопозитивных нейронов у крысы в постнатальном онтогенезе

Цель

Целью исследования послужило определение процентного соотношения и площади сечения перикарионов ХАТ-иммунопозитивных нейронов межмышечного (МС) и подслизистого (ПС) сплетений тонкой и толстой кишки у крысы в постнатальном онтогенезе

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное одноцентровое сплошное неконтролируемое неослеплённое исследование.

Работа осуществлена на самцах крыс Wistar различных возрастных групп: новорожденных, 10-, 20-, 30-, 60-суточных, 12- и 24-месячных крысах (по 5 в каждой возрастной группе). Опыты выполнялись в согласии с отечественным и международным законодательством о гуманном обращении с животными. Для эвтаназии животных применялся уретан (в летальной дозировке 3 г/кг, внутрибрюшинно). На выполнение исследования дано разрешение Этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (№ 60 от 16.02.2023 г.).

Для проведения иммуногистохимического исследования крысы вначале перфузировались раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфера (PBS), затем 4% раствором паpафоpмальдегида на PBS. После перфузии участки тонкой и толстой кишки длиной 0,5 см иссекались и дофиксировались в той же смеси в течение 1-2 часов. Полученный материал разрезался вдоль оси кишки и расправлялся. На криостате изготавливались серийные продольные срезы толщиной 12 мкм.

Для выявления ХАТ в тонкой и толстой кишке использовались антитела к ее периферической изоформе. Одними из наиболее широко применяемых с этой целью антител являются антитела козы AB144p (Millipore, США, разведение 1:200) [13]. С целью выявления всей популяции нейронов интрамуральных узлов, применялись антитела морской свинки к паннейрональному маркеру - протеиновому генному продукту 9,5 (PGP 9.5, ab10410, Abcam, США, разведение 1:200) [14]. Вторичные антитела против морской свинки были конъюгированы с флюорохромом –флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC, разведение 1:100, Jackson Immunoresearch, США) с зеленой флуоресценцией, а против козы – с индокарбоцианином (Cy3, разведение 1:100, Jackson Immunoresearch, США), с красной флюоресценцией.

Для получения изображений использовали флуоресцентный микроскоп Olympus BX43 с набором светофильтров (Япония) и цифровую охлаждаемую камеру Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай).

 

Статистический анализ

При определении размера выборки использовали «уравнение ресурсов» [15], при котором число животных в каждом возрасте принимали равным 5. Применялся метод многоэтапной гнездной выборки, согласно которому подсчет совершался на 5-ти ганглиях в каждом из 5-ти срезов каждого из 5-ти животного для каждого сплетения, отдела кишки и возраста [16].

При отборе полей зрения для микрофотографирования применялся метод наименьших квадратов [16]. Суммарное количество ИР нейронов, содержащих только красную, только зеленую, и колокализующих обе метки (желтый цвет при наложении изображений) принимали за 100%. Подсчет иммунореактивных нейронов осуществляли в случайно выбранных полях зрения (площадь изображения равнялась 0,12 мм²) при 200-кратном увеличении. Анализу подлежали только нервные клетки, срез которых прошел через ядро.

Для определения процентного соотношения и площадей сечения иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Статистический анализ данных и построение графиков проводился с использованием программ Sigma Plot (Systat Software, США). Проверка выборки на нормальность выполнялась с использованием теста Шапиро-Уилка. Для нормального распределения величины представлены как средняя арифметическая ± стандартное отклонение, М±SD (n), где n - число значений, использовавшихся для подсчета среднего. Для оценки различий между разными группами использовали непарный параметрический one-way ANOVA тест. За уровень статистической значимости был взят p<0,05.

 

Результаты

Подавляющее большинство нейронов МС и ПС тонкой и толстой кишки было иммунореактивным (ИР) к ХАТ во всех исследованных возрастных группах (Рисунки 1-4). В клетках ХАТ выявлялась в ядре и цитоплазме.

В МС процент ХАТ-ИР нейронов достоверно увеличивался в тонкой кишке от периода новорожденности до 20 суток жизни (p<0,05) и уменьшался от 20 суток до старости (p<0,05). В толстой кишке в МС процент ХАТ-ИР нейронов достоверно возрастал от периода новорожденности до 10 суток жизни (p<0,05) и уменьшался от 20 суток до старости  (p<0,05) (Рисунок 5).

В ПС тонкой кошки процент ХАТ-ИР нейронов был достоверно выше у новорожденных по сравнению с 10-суточными крысами и у новорожденных и 20-суточных по сравнению со старыми животными (p<0,05). В ПС толстой кошки процент ХАТ-ИР нейронов достоверно увеличивался в первые 10 суток жизни, снижался между 10 и 20 сутками (p<0,05) и далее не изменялся (p>0,05) (Рисунок 5).

У новорожденных и старых крыс наибольший процент ХАТ-ИР нейронов выявлялся в ПС тонкой кишки. В МС тонкой кишки процент ХАТ-ИР нейронов был достоверно больше по сравнению с толстой у 12- и 24-месячных крыс (p<0,05). В ПС тонкой кишки процент ХАТ-ИР нейронов был достоверно больше по сравнению с толстой во всех возрастных группах кроме 10-суточных (p<0,01).

Средняя площадь сечения ХАТ-ИР нейронов увеличивается с момента рождения до 60-ти суток жизни животных как в МС, так и ПС тонкой и толстой кишки (Рисунок 6). В тонкой и толстой кишке не было выявлено различий между средней площадью сечения ХАТ-ИР и ХАТ-негативных нейронов. При этом средняя площадь сечения ХАТ-ИР нейронов МС по сравнению с ПС становится достоверно выше начиная с 10-ти суточного возраста крыс (p<0,01), а в толстой - с 10-ти суточного возраста крыс до 60-ти суток жизни животных (p<0,05).

 

Обсуждение

Результаты работы свидетельствуют, что ХАТ выявляется в большом количестве нейронов МС и ПС тонкой и толстой кишки с момента рождения и на протяжении всего постнатального онтогенеза. Литературные данные также свидетельствуют, что нейроны, экспрессирующие ХАТ обнаруживаются у грызунов уже в эмбриональном периоде [11, 12]. Тем не менее, сведения о проценте ХАТ-ИР нейронов к моменту рождения в литературе являются противоречивыми. Вероятно, различия в литературных данных связаны с особенностями получения трансгенных животных и разными типами антител к ХАТ.

В данной работе мы установили, что в онтогенезе процент ХАТ-ИР нейронов изменяется, в частности увеличивается в раннем онтогенезе и снижается в старости. Это подтверждается литературными данными, согласно которым в раннем постнатальном онтогенезе у юных мышей, после отсаживания от матери и начала самостоятельного питания, в ПС увеличивается процент ХАТ-позитивных секретомоторных нейронов, колокализующих ВИП [17]. При этом у старых крыс наблюдается снижение процента нейронов, колокализующих ХАТ и соматостатин [18], а также ХАТ и NPY [19], но увеличивается доля нейронов, колокализующих ХАТ и нейрональную синтазу оксида азота [20].

Дисфункция нейронов энтеральной нервной системы может приводить к заболеваниям желудочно-кишечного-тракта, проявляющимися нарушениями моторики и секреции [21]. Медленно-транзитный запор – одно из наиболее распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), характеризующееся длительным транзитом по толстой кишке с такими симптомами, как затруднение и снижение частоты дефекации, сухой и твердый стул, сопровождающийся вздутием живота и болью [22]. При этом отмечается снижение выделения ацетилхолина нейронами энтеральной метасимпатической системы [23, 24]. Вероятно, наклонность к запорам в пожилом возрасте можно частично объяснить уменьшением доли ХАТ-содержащих нейронов МС.

Заключение

У крысы на протяжении постнатального онтогенеза наибольшее количество нейронов МС и ПС тонкой и толстой кишки являются ХАТ-ИР. У старых крыс процент ХАТ-ИР нейронов снижается по сравнению с животными первых 20 суток жизни.

Рисунки

Рис. 1. ХАТ-ИР и PGP9.5-ИР нейроны ганглиев межмышечного сплетения тонкой кишки 10-суточных (а), 20-суточных (б) и 24-месячных крыс (в). Флуоресценция Cy3 (ХАТ, красный канал, левый ряд) и FITC (PGP9.5, зеленый канал, средний ряд). Правый ряд – комбинированное изображение (ХАТ+PGP9.5). ХАТ-иммунонегативные нейроны указаны стрелками. Масштаб – 50 мкм.

Рис. 2. ХАТ-ИР и PGP9.5-ИР нейроны ганглиев подслизистого сплетения тонкой кишки 10-суточных (а), 20-суточных (б) и 24-месячных крыс (в). Флуоресценция Cy3 (ХАТ, красный канал, левый ряд) и FITC (PGP9.5, зеленый канал, средний ряд). Правый ряд – комбинированное изображение (ХАТ+PGP9.5). ХАТ-иммунонегативные нейроны указаны стрелками. Масштаб – 50 мкм.

Рис. 3. ХАТ-ИР и PGP9.5-ИР нейроны ганглиев межмышечного сплетения толстой кишки 10-суточных (а), 20-суточных (б) и 24-месячных крыс (в). Флуоресценция Cy3 (ХАТ, красный канал, левый ряд) и FITC (PGP9.5, зеленый канал, средний ряд). Правый ряд – комбинированное изображение (ХАТ+PGP9.5). ХАТ-иммунонегативные нейроны указаны стрелками. Масштаб – 50 мкм.

Рис. 4. ХАТ-ИР и PGP9.5-ИР нейроны ганглиев подслизистого сплетения толстой кишки 10-суточных (а), 20-суточных (б) и 24-месячных крыс (в). Флуоресценция Cy3 (ХАТ, красный канал, левый ряд) и FITC (PGP9.5, зеленый канал, средний ряд). Правый ряд – комбинированное изображение (ХАТ+PGP9.5). ХАТ-иммунонегативные нейроны указаны стрелками. Масштаб – 50 мкм.

Рис. 5. Диаграмма изменения процента ХАТ-ИР нейронов в ганглии МС и ПС тонкой и толстой кишки крыс в постнатальном онтогенезе.

*p<0,05 по сравнению с 20-суточными крысами

# p<0,05 по сравнению с толстой кишкой

Рис. 6. Диаграмма изменения средней площади сечения ХАТ-иммунореактивных (ХАТ+) и ХАТ-негативных нейронов межмышечного (МС) и подслизистого (ПС) тонкой (а) и толстой (б) кишки крыс в постнатальном онтогенезе.

*p<0,05 по сравнению с МС

About the authors

Antonina F. Budnik

Kabardino-Balkarian State University

Email: budnik74@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3333-5865
SPIN-code: 3691-4817

Cand. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, Nalchik

Petr M. Masliukov

Yaroslavl State Medical University

Author for correspondence.
Email: mpm@ysmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-6230-5024
SPIN-code: 7676-0849

Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Yaroslavl

References

Supplementary files