Mechanisms of contribution of orbital adipose tissue-derived stromal cell subpopulations differed in CD90 expression in the development of endocrine ophthalmopathy

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Процесс дифференцировки клеток регулируется множеством сигналов, как в ходе эмбриогенеза, так и в постнатальном развитии. Точная координация данного процесса необходима для формирования органа и поддержания его нормального функционирования в течение всей жизни организма. Однако при повреждении или развитии патологий баланс в обновлении пула различных типов клеток может сдвигаться, существенно меняя структуру и функцию ткани. Важнейшую роль в данном процессе играют взаимодействия между тканеспецифичными клеточными популяциями, осуществляемые как при непосредственном контакте, так и через передачу паракринных сигналов.

Показано, что факторы, секретируемые некоторыми типами клеток, могут запускать в таргетных клетках процессы конкурентной дифференцировки, кардинально изменяя их программу поведения. Так, конкурентными по отношению к друг другу считаются адипогенная и миофибробластная дифференцировка [1], адипогенная и остеогенная [2, 3] и ряд других. Данный феномен хорошо показан для липофибробластов лёгких. Липофибробласты тесно взаимодействуют с альвеолоцитами II типа, формируя нишу стволовых клеток лёгких и снабжая их липидными компонентами для синтеза сурфактанта. Под воздействием профибротических стимулов, прежде всего, трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), эти клетки, как и множество других подтипов стромальных клеток, дифференцируются в миофибробласты, которые длительное время считались терминальной стадией дифференцировки клеток. Однако под воздействием адипогенных сигналов, в том числе поступающих от альвеолоцитов, клетки могут восстанавливать свою структуру и функцию, формируя исходную нишу альвеолоцитов [4, 5].

Особый интерес в изучении регуляции клеточной судьбы вызывают патологические процессы, в рамках которых конкурирующие дифференцировки протекают параллельно. Одним из таких заболеваний является эндокринная офтальмопатия (ЭОП), или офтальмопатия (орбитопатия) Грэйвса. При развитии этой патологии в рамках одного микроокружения параллельно происходят как процессы пролиферации и дифференцировки стромальных клеток в адипоциты, что приводит к разрастанию ретробульбарной клетчатки, так и дифференцировка в миофибробласты, сопровождающаяся накоплением компонентов внеклеточного матрикса (прежде всего гиалуронана и коллагена IV типа) и отеком ткани [6–8]. Точные механизмы столь разного поведения клеток неизвестны, однако ранее было предположено, что популяции стромальных клеток, различающиеся по направлению дифференцировки, отличаются и экспрессией мембранного белка CD90 (THY-1) [21]. Более того, было предположено, что секретом CD90+ субпопуляции стромальных клеток способен ингибировать адипогенную дифференцировку CD90- клеток. Однако фактор, ответственный за этот эффект, не был обнаружен среди основных белковых компонентов секретома CD90+ клеток, участвующих в регуляции адипогенной индукции [9]. Вместе с тем, в многочисленных работах, в том числе и работах нашего коллектива, уже было показано, что основным компонентом секретома, влияющим на дифференцировку стромальных клеток, могут быть факторы, переносимые в составе внеклеточных везикул (ВВ). Изучение реципрокного взаимодействия субпопуляций стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной ткани и различающихся по экспрессии CD90, может помочь в поиске ключевых факторов, переключающих дифференцировку клеток в нужном направлении и тем самым помогающих управлять течением профиброгенных или липогенных заболеваний.

Цель исследования

 

Уточнение механизмов взаимодействия между субпопуляциями CD90 разных форм течения заболевания.

Методы

Дизайн исследования

Проведено контролируемое, проспективное, одноцентровое, параллельное исследование.

Условия проведения исследования

Биоматериалы были получены в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ. Экспериментальная работа проведена на базе Центра регенеративной медицины МНОИ МГУ имени М.В. Ломоносова.

Критерии соответствия (отбора)

Биоматериалы были получены в ходе плановых операций по декомпрессии орбиты при ЭОП, выполняемых в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ. Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие перед операцией. Всего было получено 12 клеточных линий, 2 – от пациентов с липогенной формой, 3 - от пациентов с миогенной формой, 4 - от пациентов со смешанной формой, 3 - с условной нормой без подтвержденного диагноза эндокринной офтальмопатии, клетки которых использовали в качестве контрольных.

Описание критериев соответствия

не применимо

Подбор участников в группы

не применимо

Описание вмешательства

Фрагменты жировой ткани подвергали ферментативной обработке коллагеназой (200 ед/мл, Worthington, США) и диспазой (40 ед/мл, Corning, США), согласно стандартному протоколу по выделению стромальных клеток из жировой ткани (Zuk, 2004). Культивирование выделенных стромальных клеток осуществляли в среде роста aMEM (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Lacopa, Россия) и 1% антибиотиком пенициллин-стрептомицин (Gibco, США). При достижении 80-90% конфлюэнта культуру пассировали, используя раствор Версена (ПанЭко, Россия) и 0,05% раствор трипсина (Gibco, США). Клетки культивировали в инкубаторе в стандартных условиях при 37ᴼС и 5%-ной концентрации СО2.

Исходы исследования

Основной исход исследования.

Не применимо

Дополнительные исходы исследования

Не применимо

Методы регистрации исходов

Не применимо

Анализ в подгруппах

Не применимо

Разделение популяции стромальных клеток с помощью клеточного сортера

Разделение популяции стромальных клеток, полученных из жировой ткани орбиты пациентов, осуществляли на 2-3 пассаже с помощью проточного цитометра с функцией сортировки клеток (BD FACS Aria III). Для этого суспензию клеток готовили в буфере для проточной цитометрии (0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА, Панэко, Россия) на фосфатно-солевом буфере (ФСБ, ПанЭко, Россия)), содержащем первично меченые фикоэритирном антитела против CD90 (5 мкл антител на 100 мкл раствора, содержащего 1 млн клеток, 328110, BioLegend, США) или контрольные изотипические (IgG) антитела с тем же конъюгатом (400114, BioLegend, США). Полученную суспензию инкубировали с антителами в темноте при +4°С 20 минут, каждые 5 минут перемешивали ее содержимое легким покачиванием. После чего для удаления не связавшихся антител клетки отмывали дважды центрифугированием в растворе 0,5% БСА. Полученные суспензии использовали для разделения клеток с помощью клеточного сортера (BD FACS Aria III, США). В результате выделяли две субпопуляции клеток: CD90⁺ – клетки с высокой представленностью CD90 на поверхности и CD90^– – клетки с интенсивностью флуоресценции неотличимой от изотипического контроля, популяцию с промежуточной экспрессией CD90 в исследование не брали. Для проведения последующих экспериментов отсортированные популяции высаживали в необходимых для дальнейших экспериментов плотности на культуральную посуду в полной среде роста и использовали через 12 часов после сортировки.

Направленная дифференцировка стромальных клеток орбиты в миофибробласты

Для оценки способности клеток дифференцироваться в миофибробласты в 96- луночный культуральный планшет (Corning, США) вносили 3,5 тыс. кл/лунка в полной среде роста. Через сутки клетки отмывали от среды роста раствором Хэнкса (Панэко, Россия) и осуществляли смену среды: в контрольной группе - на ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (Gibco, США), в экспериментальных – на среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы с добавлением TGF-β в концентрации 5 нг/мл (Cell Signaling Technology, США). Через 4 дня инкубации клетки фиксировали 4% формальдегидом (PanReac Applichem, Испания) для дальнейшего анализа.

Индукция дифференцировки стромальных клеток орбиты в адипогенном направлении

Для оценки дифференцировочного потенциала субпопуляций стромальных клеток орбиты в адипогенном направлении в 96-луночный культуральный планшет вносили 7 тыс. кл/лунка в полной среде роста. Через сутки осуществляли смену питательной среды: в контрольной группе - на новую порцию полной среды роста, в экспериментальных – на специальную индукционную коммерческую среду, содержащую коктейль адипогенных факторов StemPro (Thermo Fisher Scientific, США). Клетки культивировали в течение 8 дней, заменяя среду на соответствующую каждые три дня, после чего фиксировали 4% формальдегидом для дальнейшего анализа.

Иммуноцитохимический анализ

Для иммуноцитохимического анализа использовали фиксированные ранее клетки. В случае изучения внутриклеточных антигенов клетки дополнительно пермеабилизовали в растворе ФСБ с добавлением 0,2% ТритонХ100 (Sigma-Aldrich, США). Далее блокировали неспецифическое связывание антител в растворе 10% сыворотки животных (Sigma, США), из которых получены вторичные антитела, в течение одного часа при комнатной температуре. Клетки вновь отмывали с помощью ФСБ, после чего осуществляли мечение клеток первичными антителами - против α-гладкомышечного актина (αГМА) (1:300, Abcam, ab5694), виментина (1:250, Biolegend, 904501), коллагена I (1:300, Abcam, ab34710) и III типа (1:400, Abcam, ab7778), CD90 (1:500, Colbiochem, cp28), CD45 (1:200, Biolegend, 103102), пан-цитокератина (1:200, Abcam, ab9277) и иммуноглобулина G (IgG) (1:1000, Biolegend, 401402) в течение ночи при температуре +4°С. После повторного промывания клеток с помощью ФСБ инкубировали со вторичными антителами, меченными флуорохромами Alexa Fluor 488 и 594, в течение 2 часов в темноте при комнатной температуре (1:1000, Invitrogen, A21206, A11032, A11007). Для окрашивания липидных капель к фиксированным клеткам добавляли рабочий раствор нильского красного (Nile Red) (1:1000, (Sigma-Aldrich, США). Дополнительно производили окрашивание ядер флуоресцентным красителем DAPI (1:10 000, Sigma-Aldrich, США). Анализировали результаты с помощью инвертированного микроскопа Leica DM600Β, снабженного камерой Leica DFC 420Х (Leica Microsystems GmbH). Обработку и анализ изображений проводили с помощью программ LasX (Leica Microsystems GmbH) и FiJi (GitHub Inc., США).

Получение кондиционированной среды CD90+ и CD90- субпопуляций стромальных клеток орбиты

Стромальные клетки, предварительно разделенные на две субпопуляции по экспрессии CD90, высаживали в плотности 6 тыс кл/см². Через сутки трижды отмывали с использованием раствора Хенкса (ПанЭко, Россия) и кондиционировали в среде ДМЕМ с низкой глюкозой без добавления сыворотки в течение 3х суток. Полученную кондиционированную среду очищали от клеточного дебриса с помощью центрифугирования при 300g 10 мин, далее среду помещали в эппендорфы и замораживали (-80°С) для дальнейшего использования.

Полученную очищенную кондиционированную среду размораживали и использовали для концентрирования методом ультрафильтрации. Для отделения фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, от вневезикулярных факторов использовали ультрацентриконы с размером пор 300 кДа (Sartotius, Германия). Концентрирование полной кондиционированной среды и вневезикулярной фракции осуществляли на ультрацентриконах с размером пор 10 кДа (Jet Bio-Filtration, Китай). Полученные концентраты разводили в среде ДМЕМ с низкой глюкозой и добавляли к исследуемым культурам в концентрации 1х по объему.

Оценка паракринных взаимодействий CD90+ и CD90- субпопуляций стромальных клеток жировой ткани орбиты

Субпопуляции стромальных клеток, различающиеся по экспрессии CD90, высаживали в 96-луночный планшет в количестве 7 тыс. кл/лунка в полной среде роста. Через сутки клетки промывали средой ДМЕМ без сыворотки и производили смену среды. При этом формировали следующие экспериментальные группы:

• ДМЕМ без сыворотки;
• полная кондиционированная среда (КС), полученная при культивировании CD90⁺ субпопуляции клеток (КС_CD90+);
• внеклеточные везикулы (ВВ), выделенные из кондиционированной среды, полученной при культивировании CD90⁺ субпопуляции клеток (ВВ_CD90+);
• вневезикулярная фракция (т.к. растворимые факторы, РФ), выделенные из кондиционированной среды, полученной при культивировании CD90⁺ субпопуляции клеток (РФ_CD90+);
• полная кондиционированная среда, полученная при культивировании CD90^- субпопуляции клеток (КС_CD90-).

 

Через сутки в экспериментальных группах №№2-5 осуществляли замену среды на варианты, аналогичные вышеописанным, с добавлением коммерческой индукционной среды для адипогенной дифференцировки StemPro в соотношении 1:3 (КС/ВВ/РФ: индукционная среда). В первой контрольной группе среду меняли на полную среду ДМЕМ (контроль 1, использовали для нормировки), а в контрольной группе с индукцией дифференцировки (контроль 2) – на среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы без сыворотки со StemPro в соотношении 1:3. На пятые сутки во всех группах производили повторную смену среды на аналогичную. На 8ой день эксперимента клетки фиксировали с помощью 4% формальдегида и окрашивали с использованием красителя Nile Red (1:1000). Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Для количественной оценки влияния паракринных факторов на эффективность дифференцировки CD90⁺ и CD90^- клеток измеряли относительный уровень флуоресценции красителя нильский красный с помощью программы Fiji. Полученные значения нормировали на количество клеток (оценивали по количеству ядер) и среднее значение относительного уровня флуоресценции контрольной группы.

Вестерн блот

Клетки лизировали в 2% SDS. Количество белка в лизате определяли с помощью метода анализа белка микро BCA, подвергали электрофорезу в геле SDS-PAGE и переносили на мембрану PVDF. Мембрану блокировали 5% сухим молоком на TBST и инкубировали с первичными антителами к αГМА (ab32575, Abcam, Великобритания), белку активации фибробластов альфа (FAPα) (66562S, Cell Signaling Technology, США), GAPDH (2118L, Cell Signaling Technology, США) в течение ночи при 4°C. После промывания в TBST мембраны инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой (HRP) (P-RAM Iss, P-RAQ Iss, Имтэк, Россия), в течение 1 часа. Меченые белки визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDocTM Touch (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием набора для усиленной хемилюминесценции (ECL) (Pierce, США).

Статистический анализ данных

Статистический анализ и построение графиков осуществляли в программе GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США). Результаты представляли в виде медианы и межквартильного интервала. Попарные сравнения производили с помощью теста Манна- Уитни, для сравнения большего количества групп - критерий Краскела — Уоллиса или Фридмана с поправкой Данна. Различия считали достоверными при 5% уровне значимости (p<0.05).

Результаты

Формирование выборки

Не применимо

Характеристики выборки

Не применимо

Основные результаты исследования

Характеристика стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной жировой ткани пациентов

Для выделения культуры стромальных клеток использовали жировую ткань из пораженной орбиты пациентов, удалённую в ходе плановых операций (прил. 1). Всего выделено и охарактеризовано 12 линий клеток - 9 линий от пациентов с различными формами эндокринной офтальмопатии (липогенной, миогенной и смешанной) и 3 линии контрольных клеток. Было показано, что антитела к виментину связываются с белками цитоскелета всех клеток в тотальной популяции, что указывает на их мезенхимальное происхождение (рис. 2). Кроме того, в культуре клеток детектируются такие маркеры, как CD90, αГМА, коллагены I и III типов. В культурах отсутствуют CD45+ клетки, что может говорить об отсутствии примеси лейкоцитов. Однако можно найти единичные клетки, меченные антителами к цитокератину, являющемуся маркером эпителиальных клеток. Таким образом, по совокупности маркеров можно сказать, что выделенные культуры клеток от всех пациентов преимущественно состоят из стромальных клеток. При этом экспрессия исследованных маркеров в культурах существенно не отличается между донорами вне зависимости от типа офтальмопатии.

Разделение культуры стромальных клеток орбиты по экспрессии CD90 и характеристика отсортированных субпопуляций

Для того, чтобы изучить характер взаимодействия СD90+ и СD90- субпопуляций стромальных клеток орбиты, мы использовали первично меченные антитела против CD90 и разделили культуру клеток по данному маркеру методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). Мы показали, что через 24 часа после сортировки в популяции СD90- клеток встречаются только единичные СD90+ клетки. В то же время в культуре СD90+ все клетки экспрессируют на мембране СD90, что говорит об успешности разделения культуры на субпопуляции. Несмотря на описываемые в литературе различия, которые говорят о том, что CD90+ популяция должна в большей степени обладать свойствами миофибробластов, между субпопуляциями не обнаружено принципиальной разницы в экспрессии и локализации белков-маркеров как стромальных клеток (виментин), так и маркеров миофибробластов (коллаген I типа и αГМА) (рис. 3).

В ходе дальнейшего исследования была проверена гипотеза о наличии корреляции между количеством CD90– клеток и диагностированной формой офтальмопатии пациентов. Так, продемонстрировано, что у пациентов, имеющих липогенную форму офтальмопатии, количество CD90– клеток в тотальной популяции значительно превышает их среднее количество у пациентов с другими формами ЭОП (Рис. 4 B,E). Представленность субпопуляций между миогенной и другими формами не различалась (Рис. 4 E), количество CD90^– составляло от 1 до 15% (Рис.4 А, Б).

Оценка дифференцировочного потенциала субпопуляций стромальных клеток орбиты, различающихся по экспрессии CD90

Согласно ряду исследований, различающиеся по экспрессии CD90 стромальные клетки жировой ткани орбиты также различаются и по своему дифференцировочному потенциалу. Так, ранее было показано, что CD90+ клетки более склонны к миофибробластной дифференцировке, в то время как CD90^– - к адипогенной [10]. Для того, чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали направленную дифференцировку разделенных субпопуляций in vitro.

Для индукции дифференцировки в миофибробласты использовали основной профиброгенный фактор – TGF-β. Мы показали, что при добавлении TGF-β в культуре клеток тотальной популяции стромальных клеток орбиты увеличивается число клеток с выраженными αГМА+ стресс-фибриллами, что является одним из ключевых признаков дифференцированных миофибробластов (рис. 5А). Кроме того, в культуре возрастает количество как белка αГМА, так и белка, играющую важную роль в активации фибробластов на их ранних этапах дифференцировки в миофибробласты - FAPα (рис. 5Б1, Б2). Как и ожидалось, CD90⁺ клетки также активно дифференцируются в миофибробласты. Вместе с тем, и клетки CD90^– субпопуляции дифференцируются в миофибробласты на уровне, сравнимом с CD90⁺ субпопуляцией (рис. 5А).

Для индукции дифференцировки культур в адипогенном направлении использовали коммерческую индукционную среду. Было показано, что в исходных субпопуляциях до индукции дифференцировки отсутствуют оформленные липидные капли. В то же время как в тотальной популяции, так и в субпопуляциях CD90^– и CD90⁺ клеток мы наблюдали накопление липидных капель в условиях индукции адипогенной дифференцировки (рис. 5В), а также подавление накопления белков-маркёров миофибробластной дифференцировки, что говорит об их способности дифференцироваться в адипогенном направлении (рис. 5Б1, Б2). При анализе накопления липидных капель показано, что клетки CD90- субпопуляции накапливают практически в 2 раза больше липидных капель, чем CD90⁺ (p=0.006) (рис. 5Г). Таким образом, можно предположить, что CD90^– субпопуляция стромальных клеток орбиты обладает большим адипогенным потенциалом в условиях индукции, чем CD90⁺.

 

Оценка паракринного взаимодействия субпопуляций стромальных клеток орбиты, различающихся по экспрессии CD90

Чтобы уточнить механизмы паракринного взаимодействия субпопуляций стромальных клеток орбиты, различающихся по экспрессии CD90, мы выделили из секретома CD90⁺ субпопуляций фракцию, обогащенную ВВ, и вневезикулярную фракцию («растворимые факторы», РФ). Мы показали, что при добавлении как КС CD90+, так и выделенных из неё ВВ к CD90- субпопуляции не наблюдается уменьшения количества липидных капель, что может говорить об отсутствии эффекта ингибирования адипогенной дифференцировки. Интересно, что тенденция к уменьшению способности CD90- клеток к адипогенной дифференцировке наблюдается при добавлении КС от этой же самой субпопуляции (рис 6А).

Однако при добавлении КС CD90+ к одноименной субпопуляции мы наблюдали, напротив, значимое увеличение способности клеток к дифференцировке в адипогенном направлении, в то время как среда от CD90- субпопуляции не оказывала выраженного регулирующего эффекта. ВВ CD90+ клеток также стимулировали адипогенную дифференцировку. Выраженный стимулирующий адипогенный эффект оказывала и вневезикулярная фракция секретома CD90+ (рис 6Б,В; прил. 2 ).

Таким образом, мы показали, что секретом CD90+ клеток не оказывает значимого влияния на адипогенную дифференцировку CD90- клеток. Вместе с тем, секретом CD90+, а также его отдельные компоненты, способствуют стимуляции адипогенной дифференцировки самой субпопуляции CD90+ стромальных клеток при её индукции.

Дополнительные результаты исследования

Не применимо

Нежелательные явления

Не применимо

Обсуждение

Резюме результатов исследования

Показано, что субпопуляции стромальных клеток ретробульбарной клетчатки, отличающиеся по экспрессии CD90, обладают способностью к дифференцировке в адипоциты и миофибробласты. Однако CD90- клетки показали более выраженный адипогенный потенциал. Вопреки ожиданиям, ни одна из фракций секретома CD90+ клеток не ингибировала адипогенную дифференцировку CD90- клеток. Наоборот, как полный секретом CD90+ клеток, так и его везикулярная и вневезикулярная фракции, статистически достоверно стимулировали адипогенную дифференцировку в самой CD90+ субпопуляции.

Интерпретация результатов исследования

Различные субпопуляции клеток в многоклеточных организмах обладают своими уникальными свойствами, в том числе потенциалом к дифференцировке. При смене регуляторных сигналов нормальный фенотип и функция клеток могут претерпевать существенные изменения. Важнейшее значение в данном процессе имеют не только системные сигналы, но и сигналы, приходящие из микроокружения клеток. Изучение регуляторных процессов, происходящих между локализованными в одной нише субпопуляциями клеток, может помочь лучше разобраться в патогенезе многих мультифакторных заболеваний и поиске новых путей к терапии.

Одним из примеров такой патологии, при которой важную роль могут играть взаимодействия между клеточными субпопуляциями стромальных клеток, является избыточное разрастание ткани в ретробульбарной области, происходящее на фоне развивающейся офтальмопатии (орбитопатии) Грэйвса. Офтальмопатия (орбитопатия) Грейвса, или эндокринная офтальмопатия (ЭОП), является основным и наиболее часто встречающимся экстратиреоидным проявлением болезни Грейвса (диффузный токсический зоб) [11]. Ранними симптомами эндокринной офтальмопатии принято считать синдром «сухого глаза», отеки век, непостоянную диплопию. При дальнейшем прогрессировании заболевания у пациентов может появляться экзофтальм (выпячивание глазного яблока), постоянное двоение из-за развившегося косоглазия. Это чаще всего связано с избыточным отеком тканей и увеличением объема жировой ткани орбиты. При тяжелом течении эндокринной офтальмопатии, отсутствии своевременной диагностики и лечения возможна безвозвратная потеря зрения [12–14]. В зависимости от локализации патологического очага, по данным рентгеновской томографии, различают три формы течения ЭОП: липогенная (увеличение объема орбитальной клетчатки без изменения размеров и плотности экстраокулярных мышц (ЭОМ)), миогенная (увеличение объема и плотности ЭОМ без изменения параметров орбитальной клетчатки) и смешанная (когда имеет место изменение КТ-характеристик ретробульбарной клетчатки и ЭОМ). Как ранее было показано, в основе патогенеза данного заболевания лежит дисрегуляция дифференцировки стромальных клеток. При этом во многом похожие друг на друга по локализации, морфологии и маркерам субпопуляции стромальных клеток могут давать различный ответ на поступающие стимулы. Вместе с тем, недавно полученные данные указывают на возможные различия в выборе направления дифференцировки стромальных клеток в зависимости от экспрессии маркера CD90: так, СD90+ стромальные клетки преимущественно дифференцируются в направлении миофибробластов, в то время как СD90– субпопуляция – в адипоциты [15, 16].

CD90 (Thy-1) представляет собой белок клеточной поверхности массой 25–37 кДа, который был открыт в 1964 году [17, 18]. Известно, что данный белок экспрессируется на поверхности многих типов клеток [19, 20] и обладает некоторыми особенностями, характерными для белков внеклеточного матрикса – имеет сайт связывания интегрина (RLD - RGD-like tripeptide; RGD – arginyl-glycyl-aspartic acid) и гепарин-связывающий домен (HBD, heparin binding domain) [17, 21]. CD90 принимает участие в таких важных для морфогенеза и ремоделирования тканей процессах, как миграционная и инвазивная активность, пролиферация, хемотаксис, синтез компонентов внеклеточного матрикса [17, 21–24].

Важно отметить, что, согласно последним данным, гликопротеин CD90 является одним из ключевых регуляторов таких процессов, как фиброгенез и адипогенез. Интересно, что для клеток с различным уровнем экспрессии CD90 известны случаи как конкурентного переключения между адипо- и фиброгенезом (например, при фиброзе легких [25–27] так и случаи, в которых эти процессы могут протекать, по-видимому, параллельно друг другу (эндокринная офтальмопатия, фиброзно-жировая дегенерация скелетных мышц при сахарном диабете II типа) [28–30].

В нашей работе с использованием стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной клетчатки пациентов с диагностированной ЭОП, мы продемонстрировали, что тотальная субпопуляция способна дифференцироваться как в адипогенном направлении, так и в направлении миофибробластов. При этом индукция адипогенеза существенно снижает представленность как активированных фибробластов, так и миофибробластов в культуре, что коррелирует с общемировыми данными о конкурентном взаимодействии между данными типами дифференцировок [31–33].

Разделение субпопуляций клеток, негативных по СD90 и с высоким уровнем экспрессии данного белка, было проведено с помощью клеточного сортера. Мы показали, что после разделения клетки принципиально не отличаются по морфологии или экспрессии маркеров липо- и миофибробластов. Однако нами выявлены различия в содержании этих субпопуляций в жировой ткани орбиты, полученной от пациентов с разными формами офтальмопатии. Полученные результаты указывают на то, что, вероятно, количество CD90- и CD90+ клеток в тотальной популяции может коррелировать с ключевым механизмом патогенеза офтальмопатии и клинической картиной у разных пациентов. Однако для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных исследований и увеличение выборки пациентов с четко дифференцированными формами заболевания.

Под действием одного из ключевых индукторов миофибробластной дифференцировки TGF-β клетки обеих субпопуляций с одинаковой эффективностью дифференцируются в миофибробласты. Интересно, что группой исследователей было показано, что стромальные клетки, не экспрессирующие СD90, у таких пациентов не способны приобретать миофибробластный фенотип [9, 16]. Возможная причина

наблюдаемого нами эффекта может быть в том, что при культивировании в субпопуляции СD90- клеток достаточно быстро восстанавливалась экспрессия CD90 (прил. 3). Не позднее чем через четыре дня после сортировки в культуре можно наблюдать появление СD90+ клеток, которые могут давать начало миофибробластам.

При индукции адипогенной дифференцировки субпопуляция CD90- клеток достоверно более склонна к накоплению липидных капель, чем CD90+ субпопуляция. В работах научной группы под руководством Phipps [9, 15, 16] при стимулировании адипогенеза 15-дезокси-△12,14-простагландином-J2 (15d-PGJ2) получили схожие результаты. Следует отметить, что в нашей работе наблюдалась более выраженная дифференцировка и CD90+ клеток в адипоциты, что может быть связано с использованием иного индуцирующего агента. В этой же работе показано, что секретом CD90+ субпопуляции стромальных клеток ингибирует индуцированную 15d- PGJ2 адипогенную дифференцировку CD90- субпопуляции [9]. При добавлении такого секретома подавляется активация основного для адипогенной дифференцировки сигнального пути - PPARγ. Однако среди круциальных для адипогенеза белковых факторов, которые могут находиться в секретоме стромальных клеток жировой ткани орбиты, не удалось найти фактор, ответственный за данный процесс.

Мы предположили, что важную роль в данном процессе могут принимать не белковые факторы, находящиеся в «свободной» форме в секретоме, а вещества, переносимые в составе внеклеточных везикул (ВВ). Известно, что внутри ВВ находятся факторы, оказывающие принципиальное влияние на процессы дифференцировки. Ключевыми среди данных факторов считаются некодирующие РНК, и прежде всего микроРНК. В ряде работ, в том числе нашего коллектива показана способность микроРНК влиять как на адипогенез [34–36], так и на дифференцировку фибробластов в миофибробласты [37–39].

Для того, чтобы проверить данную гипотезу, мы выделили ВВ из кондиционированной среды субпопуляции стромальных клеток с высокой экспрессией CD90. Вопреки ожиданиям, мы показали, что ни полная кондиционированная среда, ни изолированные из неё ВВ не оказывают достоверного влияния на адипогенную дифференцировку CD90- субпопуляции (прил. 4). Следует отметить, что в случае с использованием кондиционированной среды секретом клеток, полученных от одной половины доноров, оказывал стимулирующий эффект, в то время как для другой половины наблюдали подавление адипогенной дифференцировки. Нам не удалось обнаружить зависимость между данным эффектом и клинической картиной заболевания у пациентов, что подчеркивает необходимость дальнейшего изучения патогенеза офтальмопатии и взаимодействия между клеточными субпопуляциями, лежащими в его основе. Интересно, что при добавлении секретома или выделенных из него ВВ CD90+ клеток на одноименную субпопуляцию наблюдается не ингибирующий, а наоборот, стимулирующий адипогенез эффект. Аналогичным эффектом обладает и вневезикулярная часть секретома. Согласно литературным данным, низкая экспрессия CD90 или его подавление в стромальных клетках коррелирует с их способностью к выраженной адипогенной дифференцировке [40–43] при этом данные о составе и функциональной активности секретома данной субпопуляции отсутствуют. Вместе с тем ранее нами была выдвинута гипотеза, что при фиброзе клетки с высоким уровнем экспрессии CD90 могут играть роль в разрешении фиброза, возможно, за счёт секреции про-адипогенных факторов и переключении дифференцировки с миофибробластной на адипогенную [44].

Ограничения исследования

К ограничениям исследования можно отнести небольшую выборку пациентов с различными формами офтальмопатии (2 – от пациентов с липогенной формой, 3 - от пациентов с миогенной формой, 4 – от пациентов со смешанной формой), что не позволило достоверно доказать гипотезу о различной представленности CD90- и CD90+ субпопуляций.

Заключение

Таким образом, в нашей работе мы выявили значимые различия в способности CD90+ и CD90- субпопуляций стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной жировой ткани пациентов с установленным диагнозом ЭОП, дифференцироваться в адипогенном направлении, а также уточнили возможные механизмы паракринного взаимодействия между этими субпопуляциями. Дальнейшее изучение роли субпопуляций стромальных клеток, различающихся по экспрессии CD90, представляется необходимым для чёткого понимания развития заболеваний, связанных как с адипогенезом, так и фиброзом. Особое внимание, на наш взгляд, в будущих исследованиях следует уделить изучению секреторной функции данных клеток и их способности регулировать баланс между различными направлениями клеточной дифференцировки в тканях.

 

 

Дополнительная информация

Вклад авторов

Н.А. Басалова - концептуализация, методология, формальный анализ, проведение исследования, создание черновика рукописи, создание рукописи и её редактирование, визуализация

О.Г. Пантелеева - концептуализация, методология, проведение исследования, предоставление материала для анализа, создание рукописи и её редактирование, визуализация

М.А. Виговский – методология, верификация данных, проведение исследования, визуализация, создание рукописи и её редактирование

Л.Р. Гринчевская - методология, верификация данных, проведение исследования, создание черновика рукописи, визуализация, создание рукописи и её редактирование

А.Ю. Цыганков - формальный анализ, предоставление материала для анализа, проведение исследования

А.Е. Толстолужинская - проведение исследования, визуализация, создание рукописи и её редактирование

С.В. Саакян - концептуализация, предоставление материала для анализа, администрирование данных, создание рукописи и её редактирование, визуализация, руководство исследованием, администрирование проекта,

А.Ю. Ефименко - концептуализация, администрирование данных, создание рукописи и её редактирование, руководство исследованием, администрирование проекта, получение финансирования

 

Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности*

Этическая экспертиза

Биоматериалы были получены в ходе плановых операций по декомпрессии орбиты при ЭОП, выполняемых в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ (при получении одобрения на проведение операции в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ). Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие перед операцией, одобренное локальным этическим комитетом (протокол №4, дата заседания 04.06.2018).

Согласие на публикацию

Все пациенты выразили письменное добровольное согласие на анонимную публикацию персональных фотографий. Все согласия хранятся в соответствующих историях болезни в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ

Источники финансирования

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-15- 00198, https://rscf.ru/project/23-15-00198.

Раскрытие интересов

Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Заявление об оригинальности

При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным

Данные, полученные в ходе выполнения исследования, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект

При оформлении данной статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовались.

Рассмотрение и рецензирование

Рукопись направлена в редакцию журнала в инициативном порядке.

Дисклеймер*

About the authors

Basalova A. Basalova

Lomonosov Moscow State University

Email: basalovana@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2597-8879
SPIN-code: 2448-4671

PhD

Junior Research Fellow of the Laboratory of Tissue Repair and Regeneration, Centre for Regenerative Medicine, Medical Research and Education Institution

Russian Federation, 119234, Lomonosovsky ave. 27/10, Moscow, Russian Federation

Olga G. Panteleeva

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: olgpanteleeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6616-656X
SPIN-code: 6274-5824

 MD, Dr. Sci. (Medicine)

Leading Research Fellow, Ophthalmologist, Ophthalmic Oncology and Radiology Department

Russian Federation, 105062, 14/19, Sadovaya-Chernogryazskaya Street, Moscow, Russia

Maksim A. Vigovsky

Lomonosov Moscow State University

Email: vigovskiyma@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2103-8158
SPIN-code: 7084-3521

Laboratory research assistant of the Laboratory of Tissue Repair and Regeneration, Centre for Regenerative Medicine, Medical Research and Education Institution

Russian Federation, 119234, Lomonosovsky ave. 27/10, Moscow, Russian Federation

Lidia R. Grinchevskaya (Khaerdinova)

Email: lidia.khaerdinova@gmail.com
Russian Federation

Alexander Yu. Tsygankov

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: alextsygankov1986@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9475-3545
SPIN-code: 6476-4740

MD, PhD

Research Fellow, Ophthalmologist, Medical Geneticist, Ophthalmic Oncology and Radiology Department

Russian Federation, 105062, 14/19, Sadovaya-Chernogryazskaya Street, Moscow, Russia

Anastasia Ye. Tolstoluzhinskaya

Lomonosov Moscow State University

Email: tolstoluzhinskayaae@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8362-2902
SPIN-code: 6592-9889

Laboratory research assistant of the Laboratory of Tissue Repair and Regeneration, Centre for Regenerative Medicine, Medical Research and Education Institution

Russian Federation, 119234, Lomonosovsky ave. 27/10, Moscow, Russian Federation

Svetlana V. Saakyan

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: svsaakyan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8591-428X
SPIN-code: 4783-9193

 MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Head of Department, Ophthalmic Oncology and Radiology Department

Russian Federation, 105062, 14/19, Sadovaya-Chernogryazskaya Street, Moscow, Russia

Anastasia Yu. Efimenko

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: efimenkoay@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0696-1369
SPIN-code: 5110-5998
https://istina.msu.ru/profile/efimenkoan/

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Head of the Laboratory of Tissue Repair and Regeneration, Centre for Regenerative Medicine, Medical Research and Education Institution

Russian Federation, 119234, Lomonosovsky ave. 27/10, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files