Mechanisms of orbital adipose tissue-derived stromal cell subpopulations differing in CD90 expression in the development of graves ophthalmopathy

Cover Page


Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND: Graves ophthalmopathy (GO) is characterized by pathological expansion of the retrobulbar adipose tissue and fibrosis, which are based on the dysregulation of stromal cell differentiation. A key aspect of the pathogenesis is the competition between adipogenic and myofibroblastic differentiation. It was previously suggested that these pathways are associated with distinct stromal cell subpopulations expressing (CD90+) or not expressing (CD90–) the membrane protein CD90 (Thy-1). It was hypothesized that the secretome of CD90+ cells could inhibit adipogenesis in CD90– cells, but the specific mechanisms of this interaction, including the potential role of extracellular vesicles (EVs), remained unclear.

AIM: To clarify the mechanisms of paracrine interaction between CD90+ and CD90– stromal cell subpopulations isolated from the retrobulbar adipose tissue of patients with different forms of GO.

METHODS: Stromal cells were isolated from the orbital adipose tissue of patients with GO (lipogenic, myogenic, and mixed forms) and a control group (n = 12 cell lines). Cells were separated into CD90+ and CD90– subpopulations using fluorescence-activated cell sorting. Directed differentiation into myofibroblasts (using TGF-β) and adipocytes (using a commercial adipogenic cocktail) was performed. Differentiation was assessed using immunocytochemistry (markers: αSMA, vimentin, collagens, and Nile Red for lipids) and western blotting (αSMA and FAPα). To study paracrine effects, conditioned medium (CM) from CD90+ cells was used, along with fractions enriched for extracellular vesicles (EVs) and soluble factors (SFs).

RESULTS: Orbital stromal cells were successfully separated into CD90+ and CD90– subpopulations; the number of CD90– cells was significantly higher in patients with the lipogenic form of GO. Both subpopulations were capable of differentiating into both myofibroblasts (under the influence of TGF-β) and adipocytes. However, CD90– cells demonstrated significantly higher adipogenic potential, accumulating twice as many lipid droplets. Contrary to the initial hypothesis, the secretome of CD90+ cells (whole CM, EVs, or SFs) did not inhibit the adipogenic differentiation of CD90– cells. Conversely, the secretome of CD90+ cells, including its vesicular and extravesicular fractions, significantly stimulated adipogenic differentiation within the CD90+ subpopulation itself.

CONCLUSION: This study demonstrates that the CD90– subpopulation of orbital stromal cells has a higher adipogenic potential, which may be associated with the lipogenic form of GO. Paracrine interaction between the subpopulations is complex: the secretome of CD90+ cells does not suppress adipogenesis in CD90– cells but instead stimulates differentiation into adipocytes within CD90+ subpopulation. These findings are important for understanding the mechanisms that regulate the balance between fibrosis and adipogenesis in GO and highlight the need for further study of the secretory function of stromal cells to develop new therapeutic strategies.

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Процесс дифференцировки клеток регулируется множеством сигналов, как в ходе эмбриогенеза, так и в постнатальном развитии. Точная координация этого процесса необходима для формирования органов и поддержания их нормального функционирования в течение всей жизни организма. Однако при повреждениях или развитии патологий баланс обновления пула различных типов клеток может смещаться, что существенно изменяет структуру и функцию ткани. Важнейшую роль в данном процессе играют взаимодействия между тканеспецифичными клеточными популяциями, реализующиеся как при непосредственном контакте, так и через передачу паракринных сигналов.

Показано, что факторы, секретируемые некоторыми типами клеток, могут запускать в таргетных клетках процессы конкурентной дифференцировки, тем самым кардинально изменяя их программу поведения. Так, конкурентными считаются адипогенная и миофибробластная дифференцировка [1], адипогенная и остеогенная [2, 3], а также ряд других. Данный феномен хорошо продемонстрирован на примере липофибробластов лёгких. Эти клетки тесно взаимодействуют с альвеолоцитами II типа, формируя нишу стволовых клеток лёгких и снабжая их липидными компонентами, необходимыми для синтеза сурфактанта. Под действием профибротических стимулов, прежде всего трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), липофибробласты, как и множество других подтипов стромальных клеток, дифференцируются в миофибробласты, которые длительное время считались терминальной стадией дифференцировки. Однако под действием адипогенных сигналов, в том числе поступающих от альвеолоцитов, эти клетки могут восстанавливать свою исходную структуру и функции, вновь формируя нишу альвеолоцитов [4, 5].

Особый интерес в изучении регуляции клеточной судьбы представляют патологические процессы, при которых конкурирующие дифференцировки протекают параллельно. Одним из таких заболеваний является эндокринная офтальмопатия (ЭОП), или офтальмопатия (орбитопатия) Грэйвса. При развитии этой патологии в рамках одного микроокружения одновременно происходят пролиферация и дифференцировка стромальных клеток в адипоциты, что приводит к разрастанию ретробульбарной клетчатки, а также дифференцировка в миофибробласты, сопровождающаяся накоплением компонентов внеклеточного матрикса (прежде всего гиалуронана и коллагена IV типа) и развитием отёка ткани [6–8].

Точные механизмы, определяющие выбор направления дифференцировки клеток, неизвестны. Ранее было выдвинуто предположение, что популяции стромальных клеток различаются по уровню экспрессии мембранного белка CD90 (Thy-1) [9]. Более того, предполагается, что секретом CD90+ субпопуляции способен ингибировать адипогенную дифференцировку CD90− клеток. Однако фактор, ответственный за этот эффект, не был обнаружен среди основных белковых компонентов секретома CD90+ клеток, участвующих в регуляции адипогенной индукции [9]. Вместе с тем, в многочисленных работах, включая исследования нашего коллектива, показано, что основное влияние на дифференцировку стромальных клеток оказывают факторы секретома, переносимые внеклеточными везикулами (ВВ). Изучение реципрокного взаимодействия между субпопуляциями стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной ткани и различающихся по уровню экспрессии CD90, может способствовать выявлению факторов, переключающих направление дифференцировки клеток, и поиску механизмов управления течением профиброгенных или липогенных заболеваний.

Цель исследования — уточнить механизмы паракринного взаимодействия между субпопуляциями CD90+ и CD90− стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной жировой ткани пациентов с различными формами эндокринной офтальмопатии.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено контролируемое проспективное одноцентровое параллельное исследование.

Условия проведения исследования

Биоматериал был получен в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ в период с мая 2023 г. по сентябрь 2024 г. Экспериментальная работа проведена на базе Центра регенеративной медицины МНОИ МГУ имени М.В. Ломоносова.

Критерии соответствия

Биоматериал получен в ходе плановых операций по декомпрессии орбиты при ЭОП, выполняемых в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ. У всех пациентов, включённых в исследование, одной из основных жалоб являлся экзофтальм. Перед операцией все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Описание вмешательства

Выделение и культивирование клеток

Фрагменты жировой ткани пациентов с ЭОП обрабатывали ферментами: коллагеназой (200 ед./мл; Worthington, США) и диспазой (40 ед./мл; Corning, США), согласно стандартному протоколу по выделению стромальных клеток из жировой ткани. Выделенные клетки культивировали в полной среде роста aMEM (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ООО «Лакопа», Россия) и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Gibco, США). При достижении 80–90% конфлюэнтности культуры пассировали, используя раствор Версена (НПП «ПанЭко», Россия) и 0,05% раствор трипсина (Gibco, США). Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °С, содержании СО2 5% и относительной влажности 95%.

Всего получено 12 клеточных линий: 2 линии от пациентов с липогенной формой ЭОП, 3 — от пациентов с миогенной формой, 4 — от пациентов со смешанной формой, 3 линии — условная норма (контроль), от пациентов без подтверждённого диагноза «эндокринная офтальмопатия».

Разделение популяции стромальных клеток с помощью клеточного сортера

На 2–3 пассаже тотальную популяцию полученных стромальных клеток разделили с помощью проточного цитометра с функцией сортировки клеток (BD FACS Aria III, США). Для этого готовили суспензию клеток в буфере для проточной цитометрии [0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (НПП «ПанЭко», Россия) на фосфатно-солевом буфере (ФСБ; НПП «ПанЭко», Россия)], содержащем первичные антитела к CD90 (328110, BioLegend, США), меченые фикоэритрином (5 мкл антител на 100 мкл раствора, содержащего 1 млн клеток), или контрольные изотипические (IgG) антитела с тем же конъюгатом (400114, BioLegend, США). Полученную суспензию инкубировали в темноте при +4 °С 20 минут, каждые 5 минут суспензию перемешивали лёгким покачиванием. Для удаления несвязавшихся антител клетки дважды промывали путём центрифугирования в буфере для проточной цитометрии. Полученную суспензию использовали для разделения на две субпопуляции: CD90+ — клетки с высокой представленностью мембранного белка CD90 и CD90− — клетки с интенсивностью флуоресценции, неотличимой от изотипического контроля; популяцию с промежуточной экспрессией CD90 в исследование не включали. Отсортированные популяции высаживали в культуральную посуду в необходимой для дальнейших экспериментов плотности и культивировали в полной среде роста в течение 12 часов.

Направленная дифференцировка стромальных клеток в миофибробласты

Для оценки способности клеток дифференцироваться в миофибробласты в 96-луночный культуральный планшет (Corning, США) вносили по 3,5 тыс. клеток в каждую лунку в полной среде роста. Через сутки клетки промывали раствором Хэнкса (НПП «ПанЭко», Россия) и полностью заменяли среду: в контрольной группе — на среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (Gibco, США), в экспериментальных группах — на среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы и добавлением TGF-β в концентрации 5 нг/мл (Cell Signaling Technology, США). Через 4 дня культивирования клетки фиксировали в 4% формальдегиде (PanReac Applichem, Испания) для дальнейшего анализа.

Индукция дифференцировки стромальных клеток в адипогенном направлении

Для оценки дифференцировочного потенциала субпопуляций стромальных клеток жировой ткани орбиты в адипогенном направлении в 96-луночный культуральный планшет вносили по 7 тыс. клеток в каждую лунка в полной среде роста. Через сутки проводили смену питательной среды: в контрольной группе — на новую порцию полной среды роста, в экспериментальных — на индукционную коммерческую среду StemPro (Thermo Fisher Scientific, США), содержащую коктейль адипогенных факторов. Клетки культивировали в течение 8 дней с заменой соответствующей среды на свежую порцию каждые три дня, после чего фиксировали в 4% формальдегиде для дальнейшего анализа.

Получение кондиционированной среды CD90+ и CD90− субпопуляций стромальных клеток

Стромальные клетки, разделённые на две субпопуляции по уровню экспрессии CD90, высаживали в культуральную посуду (6 тыс. клеток на см2); через сутки трижды промывали раствором Хенкса и кондиционировали в течение трёх суток в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы без добавления сыворотки. Полученную кондиционированную среду очищали от клеточного дебриса путём центрифугирования (300 g, 10 мин), аликвотировали в пробирки типа Eppendorf и замораживали при −80 °С.

Для использования очищенную кондиционированную среду размораживали и концентрировали методом ультрафильтрации. Для отделения фракции, обогащённой внеклеточными везикулами, использовали ультрацентриконы с размером пор 300 кДа (Sartorius, Германия). Концентрирование полной кондиционированной среды и вневезикулярной фракции осуществляли на ультрацентриконах с размером пор 10 кДа (Jet Bio-Filtration, Китай). Полученные концентраты разводили в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы и добавляли к исследуемым культурам до конечной концентрации 1× по объёму.

Оценка паракринных взаимодействий CD90+ и CD90− субпопуляций стромальных клеток

В 96-луночные планшеты вносили стромальные клетки, разделённые на две субпопуляции — по 7 тыс. клеток в лунку в полной среде роста. Через сутки клетки промывали средой ДМЕМ без добавления сыворотки и проводили полную смену среды. При этом формировали следующие экспериментальные группы (рис. 1):

  1. ДМЕМ без сыворотки (контроль);
  2. полная кондиционированная среда (КС), полученная при культивировании CD90+ субпопуляции клеток (КС_CD90+);
  3. внеклеточные везикулы, выделенные из среды, кондиционированной CD90+ субпопуляцией клеток (ВВ_CD90+);
  4. вневезикулярная фракция (растворимые факторы, РФ), выделенная из среды, кондиционированной CD90+ субпопуляцией клеток (РФ_CD90+);
  5. полная кондиционированная среда, полученная при культивировании CD90− субпопуляции клеток (КС_CD90−).

 

Рис. 1. Схема эксперимента для оценки паракринных взаимодействий CD90+ и CD90− субпопуляций стромальных клеток: КС — кондиционированная среда, ВВ — внеклеточные везикулы, РФ — вневезикулярная фракция (растворимые факторы).

 

Для адипогенной дифференцировки через сутки в экспериментальных группах 2–5 среду заменяли на соответствующий вариант с добавлением коммерческой индукционной среды StemPro в соотношении 1:3 (КС/ ВВ/ РФ : индукционная среда). Первую группу разделили на две подгруппы: контроль 1 (использовали для нормировки) — среду заменяли на свежую порцию ДМЕМ; контроль 2 с индукцией дифференцировки — среду заменяли на ДМЕМ с низким содержанием глюкозы без сыворотки, но с добавлением среды StemPro в соотношении 1:3. На пятые сутки во всех группах среду повторно заменяли на свежую порцию аналогичной среды. На 8-й день эксперимента все клетки фиксировали в 4% формальдегиде.

Исходы исследования

Основной исход исследования

Основным исходом исследования является определение выраженности адипогенной дифференцировки в субпопуляциях стромальных клеток жировой ткани орбиты с различной экспрессией CD90, измеренной по связыванию красителя нильский красный с липидными каплями.

Методы регистрации исходов
Иммуноцитохимический анализ

Для иммуноцитохимического анализа использовали фиксированные клетки. В случае окрашивания внутриклеточных антигенов клетки пермеабилизировали в растворе ФСБ с добавлением 0,2% Тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре (Sigma-Aldrich, США); блокировали неспецифическое связывание антител в 10% растворе сыворотки животных того же вида, что и вторичные антитела (1 час при комнатной температуре; Sigma-Aldrich, США). Затем клетки промывали в ФСБ и проводили реакцию с первичными антителами (в течение ночи при температуре +4 °С): к α-гладкомышечному актину (αГМА, 1:300; ab5694, Abcam, Великобритания), виментину (1:250; 904501, BioLegend, США), коллагену I типа (1:300; ab34710, Abcam, Великобритания) и III типа (1:400; ab7778, Abcam, Великобритания), CD90 (1:500; cp28, Calbiochem, Германия), CD45 (1:200; 103102, BioLegend, США), панцитокератину (1:200; ab9277, Abcam, Великобритания); в качестве отрицательного контроля образцы инкубировали с изотипическими IgG (1:1000; 401402, BioLegend, США). После повторного промывания клеток в ФСБ добавляли вторичные антитела, меченные флуорохромами Alexa Fluor 488 (1:1000; A21206, Invitrogen, США) или Alexa Fluor 594 (1:1000; A11032, A11007, Invitrogen, США), инкубировали в темноте в течение 2 часов при комнатной температуре. Для окрашивания липидных капель к фиксированным клеткам добавляли рабочий раствор нильского красного (Nile Red, 1:1000; Sigma-Aldrich, США). Дополнительно контрастировали ядра флуоресцентным красителем DAPI (1:10 000; Sigma-Aldrich, США).

Окрашенные препараты анализировали с помощью инвертированного микроскопа Leica DM600Β, снабжённого камерой Leica DFC 420Х (Leica Microsystems GmbH, Германия). Обработку и анализ изображений проводили с помощью программ LAS X (Leica Microsystems GmbH, Германия) и Fiji (ImageJ, National Institutes of Health, США).

Для количественной оценки влияния паракринных факторов на эффективность дифференцировки CD90+ и CD90− клеток с помощью программы Fiji измеряли относительный уровень флуоресценции красителя нильский красный. Полученные значения нормировали на количество клеток (подсчитывали по количеству ядер) и среднее значение относительного уровня флуоресценции в контрольной группе (контроль 1) .

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали в 2% растворе SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Количество белка в лизате определяли с помощью метода микро BCA (Bicinchoninic Acid assay; Thermo Fisher Scientific, США). После электрофореза в геле SDS-PAGE белки переносили на мембрану PVDF. Мембраны блокировали в 5% растворе сухого обезжиренного молока на трис-буферном солевом растворе с добавлением Tween 20 (TBST) и инкубировали с первичными антителами к αГМА (1:300; ab32575, Abcam, Великобритания), белку активации фибробластов альфа (Fibroblast Activation Protein alpha, FAPα, 1:1000; 66562S, Cell Signaling Technology, США), GAPDH (1:1000; 2118L, Cell Signaling Technology, США) в течение ночи при +4 °C. После промывания в TBST мембраны инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой (P-RAM Iss, P-RAQ Iss; ООО «Имтек», Россия), в течение 1 часа при комнатной температуре. Меченые белки детектировали с помощью системы визуализации ChemiDocTM Touch (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием набора для усиленной хемилюминесценции (ECL; Pierce, США).

Статистический анализ данных

Статистический анализ количественных данных (количество дифференцированных в адипогенном направлении клеток и количество CD90+ клеток) и построение графиков осуществляли в программе GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США). Анализ нормальности распределения количественных данных проводили с использованием W критерия Шапиро–Уилка, оптимального для малых выборок. Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала. Попарные сравнения результатов цитометрии и образцов сортированных клеток (CD90+ и CD90−) при их дифференцировке в адипогенном и миофибробластном направлениях, а также в присутствии РФ проводили с помощью теста Манна–Уитни. Для сравнения большого количества групп при дифференцировке в адипогенном направлении под действием КС и ВВ — критерий Краскела–Уоллиса или критерий Фридмана с поправкой Данна. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки

Простая случайная репрезентативная выборка сформирована из линий стромальных клеток, выделенных из биоматериала пациентов с ЭОП, полученного в ходе плановых операций.

Характеристики выборки

Клетки стромы, выделенные из ретробульбарной жировой ткани орбиты контрольных пациентов и пациентов с различными формами эндокринной офтальмопатии (липогенной, миогенной и смешанной), разделили на CD90+ и CD90− субпопуляции. Всего выделено и охарактеризовано 12 линий клеток: 9 линий от пациентов с различными формами ЭОП и 3 линии контрольных клеток от пациентов без подтверждённого диагноза «эндокринная офтальмопатия».

Основные результаты исследования

Характеристика стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной жировой ткани пациентов

Для выделения культур стромальных клеток использовали образцы жировой ткани, удалённой в ходе плановых операций из поражённой орбиты пациентов (рис. 2). В общей выделенной популяции антитела к виментину связались с белками цитоскелета всех клеток, что указывает на их мезенхимальное происхождение (рис. 3). В культуре детектировались такие маркеры, как CD90, αГМА, коллагены I и III типов, но не определялись CD45+ клетки, что свидетельствует об отсутствии примеси лейкоцитов; визуализированы единичные клетки, меченные антителами к цитокератину — маркеру эпителиальных клеток. Таким образом, по совокупности маркеров можно заключить, что все выделенные первичные культуры преимущественно состояли из стромальных клеток. При этом экспрессия исследованных маркеров в культурах существенно не различалась между донорами независимо от типа офтальмопатии.

 

Рис. 2. Клинические проявления разных форм эндокринной офтальмопатии Грэйвса: a — компьютерная томограмма; b — фотографии периорбитальной области пациентов.

 

Рис. 3. Репрезентативные фотографии культур стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани пациентов с различными формами эндокринной офтальмопатии: αГМА — α-гладкомышечный актин; иммуноцитохимическое окрашивание, увеличение ×200, масштабный отрезок 100 мкм.

 

Разделение стромальных клеток по уровню экспрессии CD90 и характеристика отсортированных субпопуляций

Для изучения характера взаимодействия СD90+ и СD90− субпопуляций стромальных клеток тотальную выделенную популяцию разделили по уровню экспрессии СD90 методом сортировки с активацией флуоресценции (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS). Установлено, что через 24 часа после сортировки в СD90− популяции встречаются только единичные СD90+ клетки. При этом в СD90+ культуре все клетки экспрессировали мембранный белок СD90, что свидетельствует об успешности разделения на субпопуляции. Несмотря на описанные в литературе данные о том, что CD90+ клетки в большей степени обладает свойствами миофибробластов, мы не обнаружили принципиальных различий между субпопуляциями по уровню экспрессии и локализации белков-маркеров как стромальных клеток (виментина), так и миофибробластов (коллагена I и αГМА; рис. 4).

 

Рис. 4. Репрезентативные фотографии культур стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани пациентов с эндокринной офтальмопатией, после разделения по уровню экспрессии CD90 методом сортировки клеток с активацией флуоресценции: αГМА — α-гладкомышечный актин; иммуноцитохимическое окрашивание, увеличение ×200, масштабный отрезок 100 мкм.

 

В ходе дальнейшего исследования была проверена гипотеза о наличии взаимосвязи между количеством CD90− клеток и диагностированной формой ЭОП. У пациентов с липогенной формой офтальмопатии в тотальной популяции выделенных стромальных клеток доля CD90− клеток значительно превышала таковую в культурах пациентов с другими формами ЭОП (рис. 5, d, e). При миогенной форме ЭОП представленность субпопуляций не отличалась от других форм (см. рис. 5, e), при этом количество CD90− клеток составляло 1–15% (рис. 5, a, b).

 

Рис. 5. Цитометрия стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани пациентов с разными формами эндокринной офтальмопатии: a — миогенная форма, b — неустановленная форма, c — липогенная форма, d — стратегия гейтирования для последовательного исключения дублей клеток, e — гистограмма с обозначением четырёх гейтов, проанализированных методом проточной цитометрии, f — результаты сравнительного анализа распределения субпопуляций по уровню экспрессии CD90 в зависимости от формы офтальмопатии; FSC — размер клеток, SSC — гранулярность клеток; гистограммы с красной заливкой — интенсивность флуоресценции фикоэритрина (реакция со специфическими антителами к CD90), с голубой заливкой — изотипический IgG контроль.

 

Оценка дифференцировочного потенциала субпопуляций стромальных клеток

Согласно ряду исследований, стромальные клетки жировой ткани орбиты, различающиеся по уровню экспрессии CD90, отличаются и по дифференцировочному потенциалу. Показано, что CD90+ клетки более склонны к миофибробластной дифференцировке, тогда как CD90− — к адипогенной [10]. Для проверки этой гипотезы мы исследовали направленную дифференцировку разделённых субпопуляций in vitro.

Для индукции дифференцировки в миофибробласты использовали основной профиброгенный фактор — TGF-β. Его добавление к культуре тотальной популяции стромальных клеток приводило к увеличению числа клеток с выраженными αГМА+ стресс-фибриллами, что является одним из ключевых признаков дифференцированных миофибробластов (рис. 6, a). Кроме того, в культуре возрастало содержание как белка αГМА, так и FAPα, играющего важную роль в активации фибробластов на ранних этапах их дифференцировки в миофибробласты (рис. 6, b, c). Как и ожидалось, CD90+ клетки также активно дифференцировались в миофибробласты; при этом в CD90− популяции уровень дифференцировки сравним с CD90+ субпопуляцией (см. рис. 6, a).

 

Рис. 6. Оценка индуцированной адипогенной и миофибробластной дифференцировки стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани пациентов с эндокринной офтальмопатией, после разделения по уровню экспрессии CD90 методом сортировки с активацией флуоресценции: a — репрезентативные фотографии клеточных культур при индукции дифференцировки в миофибробласты под действием TGF-β, иммуноцитохимическое окрашивание, увеличение ×200; b — содержание белков αГМА (α-гладкомышечный актин) и FAPα (белок активации фибробластов альфа) в клеточных культурах при индукции дифференцировки добавлением TGF-β или адипогенного коктейля; c — репрезентативные фотографии мембран после вестерн-блот анализа; d — репрезентативные фотографии клеточных культур при индукции дифференцировки в адипогенном направлении, окрашивание нильским красным, увеличение ×200; e — количество накопленных липидных капель в стромальных клетках орбиты, различающихся по уровню экспрессии CD90, при индукции дифференцировки в адипогенном направлении.

 

Для индукции дифференцировки культур в адипогенном направлении использовали коммерческую индукционную среду. Установлено, что в исходных субпопуляциях (до индукции) клетки не содержат оформленных липидных капель. В то же время как в тотальной популяции, так и в выделенных субпопуляциях CD90− и CD90+ клеток при индукции адипогенной дифференцировки наблюдалось накопление липидных капель (см. рис. 6, d), а также подавление экспрессии белковых маркеров миофибробластной дифференцировки, что свидетельствует о способности к адипогенной дифференцировке (см. рис. 6, b, c). При анализе накопления липидных капель выявлено, что клетки CD90− субпопуляции содержат почти в два раза больше липидных капель, чем CD90+ (p = 0,006; см. рис. 6, d). Таким образом, можно предположить, что CD90− субпопуляция стромальных клеток орбиты обладает бóльшим адипогенным потенциалом в условиях индукции, чем CD90+.

Оценка паракринного взаимодействия субпопуляций стромальных клеток, различающихся по уровню экспрессии CD90

Для уточнения механизмов паракринного взаимодействия между субпопуляциями стромальных клеток орбиты, различающимися по уровню экспрессии CD90, из секретома CD90+ субпопуляции выделили обогащённую везикулярную и вневезикулярную фракции. При добавлении КС_CD90+ или выделенных из неё ВВ_CD90+ к клеткам CD90− субпопуляции не наблюдали уменьшения количества липидных капель, что может свидетельствовать об отсутствии ингибирующего эффекта на адипогенную дифференцировку. Интересно, что тенденцию к уменьшению способности CD90− клеток к адипогенной дифференцировке наблюдали и при добавлении КС_CD90− (рис. 7, a).

 

Рис. 7. Оценка степени индуцированной адипогенной дифференцировки в культурах стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани пациентов с эндокринной офтальмопатией под влиянием паракринных факторов — количество накопленных липидных капель: a — СD90− субпопуляция клеток, b — СD90+ субпопуляция; КС — кондиционированная среда, ВВ — внеклеточные везикулы, РФ — вневезикулярная фракция (растворимые факторы).

 

Однако при добавлении КС_CD90+ к субпопуляции CD90+, напротив, отмечено значимое увеличение способности клеток к дифференцировке в адипогенном направлении, тогда как КС_CD90− не оказывала выраженного регулирующего эффекта; ВВ_CD90+ также стимулировали адипогенную дифференцировку. Существенный стимулирующий адипогенный эффект оказывала и вневезикулярная фракция секретома CD90+ клеток (РФ_CD90+, рис. 7, b, c, рис. 8).

 

Рис. 8. Оценка степени индуцированной адипогенной дифференцировки в культуре СD90+ стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани под влиянием паракринных факторов, содержащихся в секретоме CD90+ субпопуляции: КС — кондиционированная среда, ВВ — внеклеточные везикулы, РФ — вневезикулярная фракция (растворимые факторы).

 

Таким образом, установлено, что секретом CD90+ субпопуляции значимо не влияет на адипогенную дифференцировку CD90− клеток. Вместе с тем, секретом CD90+, а также его отдельные компоненты стимулируют адипогенную дифференцировку в самой субпопуляции CD90+ стромальных клеток при индукции.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме результатов исследования

Показано, что субпопуляции стромальных клеток ретробульбарной клетчатки, различающиеся по уровню экспрессии CD90, способны к дифференцировке в адипоциты и миофибробласты. Однако CD90− клетки демонстрируют более выраженный адипогенный потенциал. Вопреки ожиданиям, ни одна из фракций секретома CD90+ клеток не ингибировала адипогенную дифференцировку CD90− субпопуляции. Наоборот, как полный секретом CD90+ клеток, так и его везикулярная и вневезикулярная фракции, статистически значимо стимулировали адипогенную дифференцировку в самой CD90+ субпопуляции.

Интерпретация результатов исследования

Различные субпопуляции клеток в многоклеточных организмах обладают своими уникальными свойствами, включая потенциал к дифференцировке. При смене регуляторных сигналов нормальный фенотип и функции клеток могут претерпевать существенные изменения. Важнейшее значение в данном процессе имеют не только системные сигналы, но и сигналы микроокружения. Изучение регуляторных взаимодействий между субпопуляциями клеток, локализованными в одной нише, может помочь лучше разобраться в патогенезе многих мультифакторных заболеваний и способствовать поиску новых путей терапии.

Одним из примеров патологии, в развитии которой важную роль играют взаимодействия между субпопуляциями стромальных клеток, является избыточное разрастание тканей ретробульбарной области на фоне эндокринной офтальмопатии (орбитопатии) Грэйвса — наиболее частого экстратиреоидного проявления болезни Грейвса (диффузного токсического зоба) [11]. Ранними симптомами эндокринной офтальмопатии принято считать синдром «сухого глаза», отёки век и непостоянную диплопию. По мере прогрессирования заболевания у пациентов могут появляться экзофтальм (выпячивание глазного яблока) и постоянное двоение, обусловленные развивающимся косоглазием. Такие симптомы чаще всего связаны с избыточным отёком тканей и увеличением объёма жировой ткани орбиты. При тяжёлом течении ЭОП в отсутствие своевременной диагностики и лечения возможна необратимая потеря зрения [12–14]. В зависимости от локализации патологического очага, по данным компьютерной томографии, различают три формы течения ЭОП: липогенную — увеличение объёма жировой клетчатки орбиты без изменения размеров и плотности экстраокулярных мышц; миогенную — увеличение объёма и плотности экстраокулярных мышц без изменения параметров жировой клетчатки; смешанную — имеет место изменение КТ-характеристик ретробульбарной клетчатки и экстраокулярных мышц. Ранее показано, что в основе патогенеза данного заболевания лежит дисрегуляция дифференцировки стромальных клеток. При этом во многом сходные по локализации, морфологии и экспрессируемым маркерам субпопуляции стромальных клеток могут по-разному отвечать на поступающие стимулы. Вместе с тем недавно полученные данные указывают на различия в выборе направления дифференцировки стромальных клеток в зависимости от уровня экспрессии CD90: СD90+ клетки преимущественно дифференцируются в миофибробласты, тогда как СD90− субпопуляция — в адипоциты [15, 16].

CD90 (Thy-1) — белок клеточной поверхности массой 25–37 кДа, который был открыт в 1964 году [17, 18]. Известно, что он экспрессируется на поверхности многих типов клеток [19, 20] и обладает свойствами, характерными для белков внеклеточного матрикса — содержит сайты связывания интегринов (RLD — RGD-like tripeptide и RGD — arginyl-glycyl-aspartic acid) и гепарин-связывающий домен (HBD, Heparin binding domain) [17, 21]. CD90 участвует в таких важных для морфогенеза и ремоделирования тканей процессах, как миграционная и инвазивная активность, пролиферация, хемотаксис и синтез компонентов внеклеточного матрикса [17, 21– 24].

Важно отметить, что, согласно последним данным, гликопротеин CD90 является одним из ключевых регуляторов фиброгенеза и адипогенеза. Интересно, что для клеток с различным уровнем экспрессии CD90 описаны как случаи конкурентного переключения между адипо- и фиброгенезом (например, при фиброзе лёгких [25–27]), так и случаи, в которых эти процессы, вероятнее всего, протекают параллельно (например, эндокринная офтальмопатия и фиброзно-жировая дегенерация скелетных мышц при сахарном диабете II типа [28–30]).

На культуре стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной клетчатки пациентов с ЭОП, мы продемонстрировали, что тотальная популяция способна дифференцироваться как в адипогенном направлении, так и в миофибробласты. При этом индукция адипогенеза существенно снижает представленность в культуре активированных фибробластов и миофибробластов, что согласуется с литературными данными о конкурентном характере взаимодействия между этими типами дифференцировки [31–33].

Проведено разделение субпопуляций клеток с высоким уровнем экспрессии СD90 и клеток, не содержащих этот белок. Установлено, что после разделения они не различаются по морфологии и экспрессии маркеров липо- и миофибробластов. В то же время соотношение этих субпопуляций различается в образцах пациентов с разными формами офтальмопатии. Полученные результаты указывают на вероятную связь между количеством CD90− и CD90+ клеток в тотальной популяции и ключевыми механизмами патогенеза офтальмопатии, а также клиническими проявлениями у пациентов. Для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных исследований с увеличением объёма выборки и включением пациентов с дифференцированными формами заболевания.

Под действием одного из ключевых индукторов миофибробластной дифференцировки — TGF-β — клетки обеих субпопуляций с одинаковой эффективностью дифференцировались в миофибробласты. Стоит упомянуть, что, согласно литературным данным, у пациентов с ЭОП стромальные клетки, не экспрессирующие СD90, не способны приобретать миофибробластный фенотип [9, 16]. Возможной причиной такого противоречия может быть достаточно быстрое восстановление экспрессия CD90 при культивировании СD90− субпопуляции (рис. 9): не позднее, чем через четыре дня после сортировки в культуре появлялись СD90+ клетки, которые могут давать начало миофибробластам.

 

Рис. 9. Изменение экспрессии маркера CD90 в CD90− субпопуляции стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани пациентов с эндокринной офтальмопатией при длительном культивировании: иммуноцитохимическое окрашивание, масштабный отрезок 100 мкм.

 

При индукции адипогенной дифференцировки субпопуляция CD90− клеток статистически значимо более склонна к накоплению липидных капель, чем CD90+ клетки. Наши наблюдения согласуются с результатами, полученными при стимуляции адипогенеза с использованием 15-дезокси- ∆12,14-простагландина J2 (15d-PGJ2) [9, 15, 16]. Следует отметить, что в нашем исследовании дифференцировка CD90+ клеток в адипоциты была более выраженной, что может быть связано с использованием иного индуцирующего агента. В работе G.M. Lehmann и соавт. [9] показано, что секретом CD90+ субпопуляции стромальных клеток ингибирует индуцированную 15d-PGJ2 адипогенную дифференцировку CD90− клеток. При добавлении такого секретома происходит подавление активации основного сигнального пути адипогенеза — PPARγ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma). Однако среди критически важных для адипогенеза белковых факторов, потенциально присутствующих в секретоме стромальных клеток жировой ткани орбиты, не удалось идентифицировать фактор, ответственный за данный процесс.

Можно предположить, что важную роль в индукции адипогенеза играют не белковые факторы, присутствующие в секретоме в свободной форме, а факторы, переносимые в составе внеклеточных везикул. Известно, что во внеклеточных везикулах содержатся компоненты, оказывающие значительное влияние на процессы дифференцировки; наиболее важными из них считаются некодирующие РНК и прежде всего микроРНК. В ряде работ, в том числе выполненных нашим коллективом, показана способность микроРНК влиять как на адипогенез [34–36], так и на дифференцировку фибробластов в миофибробласты [37–39].

Для проверки данной гипотезы мы выделили ВВ из кондиционированной среды субпопуляции стромальных клеток с высоким уровнем экспрессии CD90. Вопреки ожиданиям, ни полная кондиционированная среда, ни изолированные из неё ВВ не оказали значимого влияния на адипогенную дифференцировку CD90− субпопуляции (рис. 10). Следует отметить, что при использовании кондиционированной среды в образцах половины доноров секретом оказывал стимулирующее действие, тогда как у другой половины наблюдали подавление адипогенной дифференцировки. Нам не удалось обнаружить зависимость между данным эффектом и клинической картиной заболевания, что подчёркивает необходимость дальнейшего изучения патогенеза офтальмопатии и лежащих в его основе взаимодействий между клеточными субпопуляциями. Интересно, что при добавлении секретома CD90+ клеток или выделенных из него ВВ к одноимённой субпопуляции наблюдали не ингибирующий, а, наоборот, стимулирующий адипогенный эффект. Аналогичным действием обладала и вневезикулярная часть секретома. Согласно литературным данным, низкая экспрессия CD90 или её подавление ассоциированы со способностью стромальных клеток к выраженной адипогенной дифференцировке [40–43]; при этом сведения о составе и функциональной активности секретома CD90− субпопуляции отсутствуют. Вместе с тем ранее нами была выдвинута гипотеза о том, что при фиброзе клетки с высоким уровнем экспрессии CD90 могут играть роль в его разрешении, возможно, за счёт секреции проадипогенных факторов и переключения дифференцировки с миофибробластной на адипогенную [44].

 

Рис. 10. Схема, иллюстрирующая взаимодействия субпопуляций стромальных клеток ретробульбарной жировой ткани, различающихся по уровню экспрессии CD90.

 

Ограничения исследования

К ограничениям исследования можно отнести небольшой размер выборки, включающей пациентов с различными формами эндокринной офтальмопатии: 2 — с липогенной формой ЭОП, 3 — с миогенной и 4 — со смешанной формой; это не позволяет однозначно подтвердить гипотезу о различной представленности CD90− и CD90+ стромальных клеток в популяции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в работе выявлены значимые различия в способности CD90+ и CD90− субпопуляций стромальных клеток, выделенных из ретробульбарной жировой ткани пациентов с установленным диагнозом «эндокринная офтальмопатия», дифференцироваться в адипогенном направлении. Кроме того, проведённое исследование позволило уточнить возможные механизмы паракринного взаимодействия между двумя субпопуляциями. Дальнейшее изучение роли стромальных клеток, различающихся по уровню экспрессии CD90, представляется необходимым для более ясного понимания развития заболеваний, связанных с адипогенезом и фиброзом. Особое внимание, на наш взгляд, в будущих исследованиях следует уделить изучению секреторной функции данных клеток и их способности регулировать баланс между различными направлениями клеточной дифференцировки в тканях.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Н.А. Басалова — определение концепции, разработка методологии, анализ данных, проведение исследования, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи, визуализация; О.Г. Пантелеева — определение концепции, разработка методологии, проведение исследования, пересмотр и редактирование рукописи, визуализация; М.А. Виговский — разработка методологии, валидация, проведение исследования, визуализация, пересмотр и редактирование рукописи; Л.Р. Гринчевская — разработка методологии, валидация, проведение исследования, написание черновика рукописи, визуализация, пересмотр и редактирование рукописи; А.Ю. Цыганков — анализ данных, проведение исследования; А.Е. Толстолужинская — проведение исследования, визуализация, пересмотр и редактирование рукописи; С.В. Саакян — определение концепции, работа с данными, пересмотр и редактирование рукописи, визуализация, руководство исследованием, администрирование проекта; А.Ю. Ефименко — определение концепции, работа с данными, пересмотр и редактирование рукописи, руководство исследованием, администрирование проекта, привлечение финансирования. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Биоматериал получен в ходе плановых операций по декомпрессии орбиты при эндокринной офтальмопатии, выполненных в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ. До хирургического вмешательства все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании, одобренное локальным этическим комитетом (протокол № 4, дата заседания 04.06.2018).

Согласие на публикацию. Авторы получили письменное добровольное согласие пациентов на анонимную публикацию персональных фотографий в научном журнале, включая его электронную версию. Объём публикуемых данных с пациентами согласован. Все согласия хранятся в соответствующих историях болезни в ФГБУ НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ.

Источники финансирования. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 23-15-001981.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Рукопись направлена в редакцию журнала в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: N.A. Basalova: conceptualization, methodology, formal analysis, investigation, writing — original draft, writing — review & editing, visualization; O.G. Panteleeva: conceptualization, methodology, investigation, writing — review & editing, visualization; M.A. Vigovsky: methodology, validation, investigation, visualization, writing — review & editing; L.R. Grinchevskaya: methodology, validation, investigation, writing — original draft, visualization, writing — review & editing; A.Yu. Tsygankov: formal analysis, investigation; A.E. Tolstoluzhinskaya: investigation, visualization, writing — review & editing; S.V. Saakyan: conceptualization, data curation, writing — review & editing, visualization, supervision, project administration; A.Yu. Efimenko: conceptualization, data curation, writing — review & editing, supervision, project administration, funding acquisition. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: Biological material was obtained during planned orbital decompression surgeries for Graves ophthalmopathy performed at the Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases, Ministry of Health of the Russian Federation. Prior to surgery, all patients signed written informed consent forms to participate in the study, which was approved by the Local Ethics Committee (Minutes No. 4, dated June 4, 2018).

Consent for publication: Written informed consent was obtained from the patients for anonymous publication of personal images in a scientific journal, including its online version. The scope of the published data was approved by the patients. All consent forms are stored in the corresponding medical records at the Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases, Ministry of Health of the Russian Federation.

Funding sources: The study was supported by the Russian Science Foundation Grant No. 23-15-00198.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in the article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This article was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer-review process involved two external reviewers, a member of the Editorial Board, and the in-house science editor.

1 Карточка проекта «Управление фиброзом тканей через регуляцию активации стромальных клеток-предшественников миофибробластов». Режим доступа: https://rscf.ru/project/23-15-00198/. Дата обращения: 28.04.2026.

×

About the authors

Natalia A. Basalova

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: basalovana@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2597-8879
SPIN-code: 2448-4671

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

Olga G. Panteleeva

National Medical Research Center for Eye Diseases named after Helmholtz

Email: olgpanteleeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6616-656X
SPIN-code: 6274-5824

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

Maksim A. Vigovsky

Lomonosov Moscow State University

Email: vigovskiy_m.a@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2103-8158
SPIN-code: 7084-3521
Russian Federation, Moscow

Lidia R. Grinchevskaya

Lomonosov Moscow State University

Email: lidia.khaerdinova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0008-5850-8460
SPIN-code: 1510-7130
Russian Federation, Moscow

Alexander Yu. Tsygankov

National Medical Research Center for Eye Diseases named after Helmholtz

Email: alextsygankov1986@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9475-3545
SPIN-code: 6476-4740

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

Anastasia E. Tolstoluzhinskaya

Lomonosov Moscow State University

Email: tolstoluzhinskayaae@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8362-2902
SPIN-code: 6592-9889
Russian Federation, Moscow

Svetlana V. Saakyan

National Medical Research Center for Eye Diseases named after Helmholtz

Email: svsaakyan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8591-428X
SPIN-code: 4783-9193

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow

Anastasia Yu. Efimenko

Lomonosov Moscow State University

Email: efimenkoay@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0696-1369
SPIN-code: 5110-5998

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

References

  1. Ferguson HE, Kulkarni A, Lehmann GM, et al. Electrophilic peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands have potent antifibrotic effects in human lung fibroblasts. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(6):722–730. doi: 10.1165/rcmb.2009-0006OC
  2. Chen Q, Shou P, Zheng C, et al. Fate decision of mesenchymal stem cells: adipocytes or osteoblasts? Cell Death Differ. 2016;23(7):1128–1139. doi: 10.1038/cdd.2015.168 EDN: WUGLPZ
  3. Xu X, Zhao L, Terry PD, Chen J. Reciprocal effect of environmental stimuli to regulate the adipogenesis and osteogenesis fate decision in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs). Cells 2023;12(10):1400. doi: 10.3390/cells12101400 EDN: UIWUVW
  4. El Agha E, Moiseenko A, Kheirollahi V, et al. Two-way conversion between lipogenic and myogenic fibroblastic phenotypes marks the progression and resolution of lung fibrosis. Cell Stem Cell. 2017;20(2):261–273.e3. doi: 10.1016/j.stem.2016.10.004
  5. Tontonoz P, Spiegelman BM. Fat and beyond: the diverse biology of PPARgamma. Annu Rev Biochem. 2008;77:289–312. doi: 10.1146/annurev.biochem.77.061307.091829
  6. Hai YP, Lee ACH, Frommer L, et al. Immunohistochemical analysis of human orbital tissue in Graves’ orbitopathy. J Endocrinol Invest. 2020;43(2):123–137. doi: 10.1007/s40618-019-01116-4 EDN: VZDANJ
  7. Khong JJ, McNab AA, Ebeling PR, et al. Pathogenesis of thyroid eye disease: review and update on molecular mechanisms. Br J Ophthalmol. 2016;100(1):142–150. doi: 10.1136/bjophthalmol-2015-307399
  8. Wu Y, Zhang J, Deng W, et al. Comparison of orbital fibroblasts from Graves’ ophthalmopathy and healthy control. Heliyon. 2024;10(7):e28397. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e28397 EDN: FYALTR
  9. Lehmann GM, Woeller CF, Pollock SJ, et al. Novel anti-adipogenic activity produced by human fibroblasts. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299(3):C672–681. doi: 10.1152/ajpcell.00451.2009 EDN: NYXNLP
  10. Koumas L, Smith TJ, Phipps RP. Fibroblast subsets in the human orbit: Thy-1+ and Thy-1-subpopulations exhibit distinct phenotypes. Eur J Immunol. 2002;32(2):477–485. doi: 10.1002/1521-4141(200202)32:2 < 477::AID-IMMU477 > 3.0.CO;2-U
  11. Concepción R, Marte N, Escalante D. Thyroid disease and associated ophthalmopathy. Rev Med Hosp Gen Méx. 2022;85(2):81–85. doi: 10.24875/HGMX.21000040 EDN: XHUDIK
  12. Mühl-Benninghaus R. Endokrine orbitopathie [Endocrine orbitopathy]. Radiologie (Heidelb). 2024;64(3):215–218. doi: 10.1007/s00117-024-01268-2
  13. Panagiotou G, Perros P. Asymmetric Graves’ orbitopathy. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:611845. doi: 10.3389/fendo.2020.611845 EDN: QCKDRU
  14. Toropova OS, Brovkina AF, Sychev DA. Endocrine ophthalmopathy: pharmacogenetic markers of efficiency of glucocorticoid therapy. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2020;75(3):250–255. doi: 10.15690/vramn1176 EDN: FFHWXY
  15. Baglole CJ, Smith TJ, Foster D, et al. Functional assessment of fibroblast heterogeneity by the cell-surface glycoprotein Thy-1. In: Tissue repair, contraction and the myofibroblast. Boston: Springer; 2006. P:32–39. doi: 10.1007/0-387-33650-8_4 ISBN: 978-0-387-33650-3
  16. Koumas L, Smith TJ, Feldon S, et al. Thy-1 expression in human fibroblast subsets defines myofibroblastic or lipofibroblastic phenotypes. Am J Pathology. 2003;163(4):1291–1300. doi: 10.1016/S0002-9440(10)63488-8 EDN: LSLCJD
  17. Leyton L, Díaz J, Martínez S, et al. Thy-1/CD90 a bidirectional and lateral signaling scaffold. Front Cell Dev Biol. 2019;7:132. doi: 10.3389/fcell.2019.00132
  18. Herrera-Molina R, Valdivia A, Kong M, et al. Thy-1-interacting molecules and cellular signaling in cis and trans. Int Rev Cell Mol Biol. 2013;305:163–216. doi: 10.1016/B978-0-12-407695-2.00004-4
  19. Kumar A, Bhanja A, Bhattacharyya J, Jaganathan BG. Multiple roles of CD90 in cancer. Tumor Biol. 2016;37(9):11611–11622. doi: 10.1007/s13277-016-5112-0 EDN: WNGOHW
  20. Leyton L, Hagood JS. Thy-1 modulates neurological cell-cell and cell-matrix interactions through multiple molecular interactions. Adv Neurobiol. 2014;8:3–20. doi: 10.1007/978-1-4614-8090-7_1
  21. Valdivia A, Avalos AM, Leyton L. Thy-1 (CD90)-regulated cell adhesion and migration of mesenchymal cells: insights into adhesomes, mechanical forces, and signaling pathways. Front Cell Dev Biol. 2023;11:1221306. doi: 10.3389/fcell.2023.1221306 EDN: QNRQCU
  22. Barker TH, Grenett HE, MacEwen MW, et al. Thy-1 regulates fibroblast focal adhesions, cytoskeletal organization and migration through modulation of p190 RhoGAP and Rho GTPase activity. Exp Cell Res. 2004;295(2):488–496. doi: 10.1016/j.yexcr.2004.01.026
  23. Brenet M, Martínez S, Pérez-Nuñez R, et al. Thy-1 (CD90)-induced metastatic cancer cell migration and invasion are β3 integrin-dependent and involve a Ca2+/P2X7 receptor signaling axis. Front Cell Dev Biol. 2021;8:592442. doi: 10.3389/fcell.2020.592442 EDN: THOIEW
  24. Schmidt M, Gutknecht D, Simon JC, et al. Controlling the balance of fibroblast proliferation and differentiation: impact of Thy-1. J Invest Dermatol. 2015;135(7):1893–1902. doi: 10.1038/jid.2015.86
  25. Shalaby SM, Mackawy AMH, Atef DM, et al. Promoter methylation and expression of intercellular adhesion molecule 1 gene in blood of autoimmune thyroiditis patients. Mol Biol Rep. 2019;46(5):5345–5353. doi: 10.1007/s11033-019-04990-6 EDN: LPDEEH
  26. Zeng F, Gao M, Liao S, et al. Role and mechanism of CD90+ fibroblasts in inflammatory diseases and malignant tumors. Mol Med. 2023;29(1):20. doi: 10.1186/s10020-023-00616-7 EDN: BKRNCG
  27. Zhang Y, Wu KM, Yang L, et al. Tauopathies: new perspectives and challenges. Mol Neurodegener. 2022;17(1):28. doi: 10.1186/s13024-022-00533-z EDN: UFRRVE
  28. Chazaud B, Mounier R. Diabetes-induced skeletal muscle fibrosis: Fibro-adipogenic precursors at work. Cell Metab. 2021;33(11):2095–2096. doi: 10.1016/j.cmet.2021.10.009 EDN: DILMKM
  29. Farup J, Just J, de Paoli F, et al. Human skeletal muscle CD90+ fibro-adipogenic progenitors are associated with muscle degeneration in type 2 diabetic patients. Cell Metab. 2021;33(11):2201–2214.e11. doi: 10.1016/j.cmet.2021.10.001 EDN: EVLXJX
  30. Zheng J, Duan H, You S, et al. Research progress on the pathogenesis of Graves’ ophthalmopathy: Based on immunity, noncoding RNA and exosomes. Front Immunol. 2022;13:952954. doi: 10.3389/fimmu.2022.952954 EDN: MCXLKV
  31. Kheirollahi V, Wasnick RM, Biasin V, et al. Metformin induces lipogenic differentiation in myofibroblasts to reverse lung fibrosis. Nat Commun. 2019;10(1):2987. doi: 10.1038/s41467-019-10839-0 EDN: MGPVXK
  32. Shook BA, Wasko RR, Mano O, et al. Dermal adipocyte lipolysis and myofibroblast conversion are required for efficient skin repair. Cell Stem Cell. 2020;26(6):880–895.e6. doi: 10.1016/j.stem.2020.03.013 EDN: XRUXPS
  33. Torti FM, Torti SV, Larrick JW, Ringold GM. Modulation of adipocyte differentiation by tumor necrosis factor and transforming growth factor beta. J Cell Biol. 1989;108(3):1105–1113. doi: 10.1083/jcb.108.3.1105
  34. McGregor RA, Choi MS. microRNAs in the regulation of adipogenesis and obesity. Curr Mol Med. 2011;11(4):304–316. doi: 10.2174/156652411795677990
  35. Voynova E, Kulebyakin K, Grigorieva O, et al. Corrigendum: Declined adipogenic potential of senescent MSCs due to shift in insulin signaling and altered exosome cargo. Front Cell Dev Biol. 2023;11:1146895. doi: 10.3389/fcell.2023.1146895 EDN: GAMISB
  36. Yu Y, Du H, Wei S, et al. Adipocyte-derived exosomal MiR-27a induces insulin resistance in skeletal muscle through repression of PPARγ. Theranostics. 2018;8(8):2171–2188. doi: 10.7150/thno.22565
  37. Basalova N, Sagaradze G, Arbatskiy M, et al. Secretome of mesenchymal stromal cells prevents myofibroblasts differentiation by transferring fibrosis-associated microRNAs within extracellular vesicles. Cells. 2020;9(5):1272. doi: 10.3390/cells9051272 EDN: ESMODC
  38. Borges FT, Melo SA, Özdemir BC, et al. TGF-β1-containing exosomes from injured epithelial cells activate fibroblasts to initiate tissue regenerative responses and fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2013;24(3):385–392. doi: 10.1681/ASN.2012101031
  39. Fang S, Xu C, Zhang Y, et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomal microRNAs suppress myofibroblast differentiation by inhibiting the Transforming Growth Factor-β/SMAD2 pathway during wound healing. Stem Cells Transl Med. 2016;5(10):1425–1439. doi: 10.5966/sctm.2015-0367
  40. Campioni D, Lanza F, Moretti S, et al. Loss of Thy-1 (CD90) antigen expression on mesenchymal stromal cells from hematologic malignancies is induced by in vitro angiogenic stimuli and is associated with peculiar functional and phenotypic characteristics. Cytotherapy. 2008;10(1):69–82. doi: 10.1080/14653240701762364
  41. Flores EM, Woeller CF, Falsetta ML, et al. Thy1 (CD90) expression is regulated by DNA methylation during adipogenesis. FASEB J. 2019;33(3):3353–3363. doi: 10.1096/fj.201801481R EDN: PPOUBW
  42. Moraes DA, Sibov TT, Pavon LF, et al. A reduction in CD90 (THY-1) expression results in increased differentiation of mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 2016;7(1):97. doi: 10.1186/s13287-016-0359-3 EDN: CTMQAQ
  43. Song X, Hong C, Zheng Q, et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53(1):77–82. doi: 10.1007/s11626-016-0081-6
  44. Basalova NA, Vigovskiy MA, Popov VS, et al. The role of activated stromal cells in fibrotic foci formation and reversion. Cells. 2024;13(24):2064. doi: 10.3390/cells13242064 EDN: OFFTZB

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Experimental setup for assessing paracrine interactions between CD90+ and CD90− subpopulations of stromal cells: КС — conditioned medium, ВВ — extracellular vesicles, РФ — non-vesicular fraction (soluble factors).

Download (157KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Clinical manifestations of different forms of Graves' endocrine ophthalmopathy: a — CT scan; b — photographs of the periorbital region in patients.

Download (294KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Representative photographs of stromal cell cultures from retrobulbar adipose tissue in patients with various forms of endocrine ophthalmopathy: αГМА — α-smooth muscle actin; immunocytochemical staining, magnification ×200, scale bar 100 µm.

Download (644KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Representative photographs of cultures of stromal cells from retrobulbar adipose tissue in patients with endocrine ophthalmopathy, after separation by CD90 expression level using fluorescence-activated cell sorting: αГМА — α-smooth muscle actin; immunocytochemical staining, magnification ×200, scale bar 100 µm.

Download (475KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Flow cytometry of stromal cells from retrobulbar adipose tissue in patients with different forms of endocrine ophthalmopathy: a — myogenic form, b — unclassified form, c — lipogenic form, d — gating strategy for the sequential exclusion of duplicate cells, e — histogram showing the four gates analysed by flow cytometry, f — results of a comparative analysis of the distribution of subpopulations according to CD90 expression levels depending on the form of ophthalmopathy; FSC — cell size, SSC — cell granularity; histograms shaded in red show the fluorescence intensity of phycoerythrin (reaction with specific antibodies against CD90), whilst those shaded in blue show the isotypic IgG control.

Download (495KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. Assessment of induced adipogenic and myofibroblastic differentiation of stromal cells from retrobulbar adipose tissue in patients with endocrine ophthalmopathy, following separation by CD90 expression level using fluorescence-activated cell sorting: a — representative images of cell cultures following induction of myofibroblast differentiation by TGF-β, immunocytochemical staining, ×200 magnification; b — levels of α-SMA (α-smooth muscle actin) and FAPα (fibroblast activation protein alpha) proteins in cell cultures following differentiation induction by the addition of TGF-β or an adipogenic cocktail; c — representative images of membranes following Western blot analysis; d — representative images of cell cultures following induction of adipogenic differentiation, stained with Nile red, magnification ×200; e — number of lipid droplets accumulated in orbital stromal cells, differing in their level of CD90 expression, upon induction of adipogenic differentiation.

Download (510KB)
Indexing metadata
8. Fig. 7. Assessment of the extent of induced adipogenic differentiation in cultures of stromal cells from retrobulbar adipose tissue of patients with endocrine ophthalmopathy under the influence of paracrine factors — number of accumulated lipid droplets: a — CD90− cell subpopulation, b — CD90+ subpopulation; КС — conditioned medium, ВВ — extracellular vesicles, РФ — non-vesicular fraction (soluble factors).

Download (142KB)
Indexing metadata
9. Fig. 8. Assessment of the extent of induced adipogenic differentiation in a culture of CD90+ stromal cells from retrobulbar adipose tissue under the influence of paracrine factors contained in the secretome of the CD90+ subpopulation: КС — conditioned medium, ВВ — extracellular vesicles, РФ — non-vesicular fraction (soluble factors).

Download (71KB)
Indexing metadata
10. Fig. 9. Changes in CD90 expression in the CD90− subpopulation of stromal cells from the retrobulbar adipose tissue of patients with endocrine ophthalmopathy following prolonged culture: immunocytochemical staining, scale bar 100 µm.

Download (232KB)
Indexing metadata
11. Fig. 10. A diagram illustrating the interactions between subpopulations of stromal cells in retrobulbar adipose tissue that differ in their levels of CD90 expression.

Download (199KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2026 Eco-Vector

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.