PARTICIPATION OF TELOCYTES IN REGENERATIVE SKIN HISTOGENESIS

Full Text

Обоснование

Телоциты – клетки с особым строением и, вероятно, широким спектром функций, которые являются одним из клеточных дифферонов соединительных тканей [1]. Так, наряду с другими органами, телоциты были обнаружены в коже [2]. В современном представлении дермальные телоциты - клеточная популяция, обладающая специфическим ультраструктурным и иммуногистохимическим профилем. Известно, что в дерме телоциты формируют трехмерную сеть [3]. Важной характеристикой является происхождение этой клеточной популяции [4]. Ввиду морфологических особенностей исследователи приписывают им разнообразные функции в гомеостазе кожи и в патофизиологическом развитии заболеваний [5]. В литературе имеются данные о создании телоцитами клеточного каркаса, участии в передаче цитохимических сигналов, иммунной регуляции и восстановлении тканей [6-8].

При травмах, сопровождающихся нарушением целостности дермы ключевые события, запускающие процессы восстановления, включают изменения основных клеточных дифферонов соединительных тканей в том числе, предположительно, и телоцитов [9-11]. В первые часы после травмы запускается воспалительная клеточная инфильтрация (за счет миграции нейтрофилов), затем происходит миграция макрофагов, которые выполняют фагоцитарную функцию, привлекают фибробласты и стимулируют их к выработке межклеточного вещества. Важнейший этап заживления раны - образование грануляционной ткани [12]. Фаза грануляции характеризуется неоангиогенезом и восстановлением сосудистой сети [13]. Эти клеточные процессы регулируются химическими сигналами разного происхождения. Известно, что телоциты способны замедлять высвобождение воспалительных факторов, а также способствовать миграции эпителиальных клеток в поврежденные ткани. Такой эффект достигается за счет влияния телоцитов на тропизм клеток через сигнальный путь, связанный с LPS-белком [14, 15].

Основной сложностью для исследователей остается отсутствие сведений о наличии какого-либо универсального маркера для телоцитов [16]. Результаты исследований in vitro, основанные на первичных культурах интерстициальных клеток, обычно представляют собой совокупность различных клеточных типов, в том числе телоцитоподобных [17].  До настоящего времени иммуногистохимическими методами выявлялись по крайней мере две фенотипические подгруппы телоцитов сетчатого слоя дермы, обе положительные по виментину, но одна положительная по CD117 (cluster differentiation 117), а другая — по CD34 (cluster differentiation 34) [18]. Об успешном проведении двойного иммунофлуоресцентной реакции с антителами к CD117 и к CD34 ранее не сообщалось [19, 20]. Определение уровня интенсивности флуоресценции может служить дополнительным показателем реактивных изменений телоцитов в регенерационном гистогенезе.

Цель исследования – с помощью электронной микроскопии и иммунофлуоресцентного метода выявить и охарактеризовать телоцитоподобные клетки на этапах заживления механической кожной раны в эксперименте.

Методы

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое сплошное контролируемое рандомизированное неослепленное исследование. Объекты исследования – фрагменты кожи бедра крыс-самцов (Wistar) на этапах заживления после нанесения механического повреждения (глубокая резаная рана). Полученные после стандартной гистологической проводки парафиновые срезы использовали для постановки иммунофлуоресцентных реакций с антителами к CD34/CD117, а также изготовлены ультратонкие срезы для электронной микроскопии. Получившиеся в результате иммунофлуоресцентных реакций препараты были фотодокументированы для расчета уровней флуоресценции указанных маркеров на каждом этапе эксперимента (рассчитано количество условных единиц средней интенсивности яркости для 8-битных изображений) и их статистической обработки.

Условия проведения исследования

Экспериментальная часть работы выполнена в условиях сертифицированного вивария Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины Министерства обороны РФ (Соглашение о научном сотрудничестве № 15 между Военно-медицинской академией имени С.М. Кирова и ГНИИИ ВМ МО РФ от 13.09.2023 г.). Постановка иммуногистохимических реакций проводилась на базе ФГБНУ РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского. Морфометрическая и статистическая обработка выполнена на кафедре гистологии с курсом эмбриологии ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Критерии соответствия (отбора)

В исследование были включены 45 крыс-самцов с исходной массой 180 – 200 г, в возрасте 30-45 суток.

Описание критериев соответствия

Группы животных, указанные выше формировались случайным образом из особей, достигших необходимого возраста.

Подбор участников в группы

Использование крыс в качестве экспериментальных животных обусловлено схожестью гистологического строения кожи с кожей человека, коротким жизненным циклом и простотой ухода.

Описание вмешательства

Животным после введения наркоза (смесь препарата Золетил®; Vibrac, Франция, доза 10 мг/кг, в сочетании с ксилазином, 10 мг/кг; Pharmamagist Ltd., Венгрия), скальпелем наносили глубокий длинный (около 2 см) поперечный разрез кожи правого бедра (в области средней трети), на глубину до подкожной мышцы,  без проведения антисептической обработки. Обезболивание после травмы не применялось. Фрагменты травмированной кожи получали от животных на последовательных этапах заживления ран через 12 ч, 1 сутки, а также на 2-е, 3-е, 6-е, 10-е, 15-е, 25-е сутки с начала эксперимента. Для контроля брали кожу интактных крыс (средняя треть правого бедра).

Исходы исследования

Основной исход исследования.

С помощью метода иммунофлуоресценции с коктейлем антител к CD34/ CD117 удалось выявить солокализацию двух этих белков в клетке. Телоцитоподные клетки были выявлены вблизи волосяных фолликулов и кровеносных сосудов. Визуальная оценка фотодокументированных изображений позволяет судить о гетероморфности выявленной популяции клеток. При помощи программы для обработки снимков (Zen 2.3., Германия), определен уровень интенсивности флуоресцентного сигнала указанных маркеров обнаруженными клетками на разных этапах регенерации, выраженные в средней интенсивности единиц яркости изображения. Проведенное исследование позволяет сделать выводы о морфофункциональных особенностях дермальных телоцитоподобных клеток, а статистическая обработка полученных цифровых данных позволяет выдвинуть гипотезу об участии клеток этого типа на этапах регенерационного гистогенеза.

Методы регистрации исходов

Для трансмиссионной электронной микроскопии использованы участки кожи верхней трети правого бедра крыс на расстоянии 1,5 см от раневого канала размером 0,1×0,1×0,5 см. Фиксировали ткани в 2,5% глутаральдегиде на 0,1 М фосфатном буфере с pH 7,2-7,4 в течение 4 ч. Затем выполнялась постфиксация 1% тетраоксидом осмия в 0,1M фосфатном буфере с добавлением сахарозы (2,5 мг на 1 мл фиксирующего раствора), производилось окрашивание 2% тетраоксидом осмия в бидистиллированной воде в течение 48 часов. Далее образцы обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, окрашивали 2% уранилацетатом (Electron Microscopy Sciences, США) в 95% этаноле, обезвоживали 99,7% изопропанолом (BioVitrum, Россия) в течение 5 часов и ацетоном (Реахим, Россия) в течение 1 часа, пропитывали смесью ацетона с эпоксидной смолой Epon (Electron Microscopy Sciences, США) в соотношении 1:1 (6 часов), после чего переносили в свежую порцию эпоксидной смолы (на 24 часа) и далее проводили её полимеризацию в емкостях FixiForm (Electron Microscopy Sciences, США) при 60°С. После этого образцы в эпоксидных блоках подвергали ручной шлифовке и полировке. Для определения интересующего участка ткани готовили полутонкие срезы (400-600 мкм) и окрашивали их толуидиновым синим. После выбора области интереса получали ультратонкие (60 мкм) срезы с помощью одноразовых стеклянных ножей. Далее срезы монтировали на медные сеточки для электронной микроскопии. Контрастирование срезов осуществляли 2% водным раствором уранилацетата натрия 10 мин при 60°С, отмывали дистиллированной водой в трех емкостях по 20 с в каждой. Визуализацию структуры образцов производили при помощи трансмиссионной электронной микроскопии на электронном микроскопе HT7800 RuliTEM (Hitachi, Япония).

Для иммунофлуоресцентных реакций использован коктейль из мышиных моноклональных анитител к CD34 (134M-14, Cell Marque, США, разведение 1:200) и кроличьих поликлональных антител к CD117 (ab5634, Abcam, Великобритания, разведение 1:250). Готовые парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Помещали препараты в буфер PRIME HIER TRIO (3 в 1) pH 6.0 (ПраймБиомед, кат. № 12-310075-500). Тепловую демаскировку антигенов проводили в течение 12 ч в термостате при 60°. После этого промывали срезы в дистиллированной воде в течение 5 минут и помещали в раствор фосфатно-солевого буфера PBS pH 7.4 собственного изготовления на 5 минут [21]. Для блокировки неспецифического связывания вторичных антител на препараты наносили необходимое количество блокировочного раствора (Background block) и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Излишки блокировочного раствора удаляли, после чего наносили смесь первичных антител в соотношении 1:1 (для двойной иммунофлуоресценции). Препараты помещали во влажные камеры и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации в первичных антителах и промывки на срезы наносили вторичные антитела Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 555) (ab150078, Abcam, Великобритания, разведение 1:500) и Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 488) (ab150105, Abcam, Великобритания, разведение 1:500). Инкубацию проводили во влажных камерах при комнатной температуре в течение 1 ч. Далее препараты дважды промывали в течение 5 минут и наносили синий ядерный флуоресцентный краситель DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндол, SB-G1012-10ML, Servicebio) на 10 минут при комнатной температуре.  После промывки препараты просушивали при комнатной температуре и заключали в глицерогель по Кайзеру собственного изготовления [21].

Препараты, полученные в результате постановки иммунофлуоресцентной реакции, исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX43 (Olympus Corporation, Япония), оснащенного системой фильтров флуоресценции от 340 до 560 нм. Использовали объектив Olympus M Plan Oil (масляная иммерсия, увеличение х1000). При регистрации результатов реакций антитела к CD117 имели красную флуоресценцию, к CD34 — зеленую, двойное (одновременное) окрашивание антителами — оранжево-желтую флуоресценцию. Ядра клеток характеризовались синей флуоресценцией. Изображения, полученные в ходе фотодокументирования, анализировали с помощью лицензионного программного обеспечения Zen 2.3. (Zeiss, Германия) и программы OLYMPUS CELLSENS DIMENSION (Olympus, Япония). Иммунопозитивные клетки подсчитывали на каждом препарате в автоматизированном режиме в 10 непересекающихся полях при увеличении х1000 с использованием масляной иммерсии. Визуально оценивали форму клеток и количество отростков. По методике, аналогичной описанной Shihan M.H. и соавторами (2021 г.) [40] в программе Zen 2.3. вычисляли среднюю интенсивность флуоресценции красного и зеленого каналов на каждом изображении. Данные представляли в виде условных единиц интенсивности яркости пикселей для 8-битных изображений (от 0 до 255).

Анализ в подгруппах

Животных разделили на 9 групп: контрольная группа — интактные особи (n=5); остальные группы соответствуют срокам после нанесения механической травмы кожи — 12 ч, 24 ч, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток (n=5 в каждой группе).

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистические методы

Полученные количественные данные обрабатывали с помощью программы Excel (Microsoft, США).

Результаты

Характеристики выборки

Фрагменты кожи бедра самцов крыс линии Wistar на разных этапах заживления после нанесения механического повреждения — глубокой резаной раны. Образцы размером 1,5–2,0 см включали раневой канал, перинекротическую область и окружающие её неповреждённые ткани кожи.

результаты исследования

В дерме кожи в норме и в перинекротической области раны в процессе заживления после механической травмы при помощи трансмиссионной электронной микроскопии на всех этапах раневого процесса были обнаружены телоцитоподобные клетки (рис.1).

Рис.1. Телоцитоподобная клетка в дерме кожи в перинекротической области раны. 12 часов после травмы. A) Ядросодержащая часть (тело) телоцитоподобной клетки; B) отросток телоцитоподобной клетки. Электронограмма.  Ув. ×12000.
Ввиду особенности строения всю клетку невозможно визуализировать в одном поле зрения, поэтому для подтверждения принадлежности выявленных клеток к дифферону телоцитов было проведено двойное маркирование иммунофлуоресцентным методом. В дерме интактных крыс были обнаружены CD34+ и CD117+ иммуноположительные клетки, а также клетки, в которых определялись эти два маркера (рис.2). 

Рис. 2. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к CD34 (зеленый спектр) и CD117 (красный спектр), солокализация двух маркеров (желтый цвет). CD34⁺/CD117⁺ телоцитоподобная клетка в дерме кожи вблизи волосяного фолликула (обозначен ↑). В составе волосяного фолликула также определяется CD34⁺/CD117^- клетки. Докраска ядер DAPI. Ув.: ×1000

Эти клетки имеют овальное, веретеновидное или треугольное тело и чаще 1-2 визуально определяемых длинных отростка. У животных контрольной группы они экспрессируют оба маркера с равной интенсивностью. Для маркера CD34 средняя интенсивность флуоресценции определена на уровне 29,98±0,3 условных единиц яркости, для CD117 – 29,32±1,1 условных единиц яркости (рис. 3).

Рис. 3. Измерение средней интенсивности флуоресценции (MFI) телоцитоподобных клеткок в коже интактных крыс с использованием автоматизированного выделения интересующей области на основе порогового значения сигнала. CD34 (A) и CD117 (B). Левая панель: вид, на котором показан канал флуоресценции, подлежащий количественному анализу. Правая панель: Исходное флуоресцентное изображение среза кожи интактной крысы

В перинекротической зоне раны (фазе некроза) обнаруживается большее количество отростков телоцитов, чем на препаратах контроля (рис.4). Через 12 часов после травмы средняя интенсивность единиц яркости обнаруженных клеток для маркера CD34 определена на уровне 42,01±0,8 условных единиц яркости, для CD117 – 50,40±0,6 условных единиц яркости.

Рис. 4. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к CD34 (зеленый спектр) и CD117 (красный спектр), солокализация двух маркеров (желтый цвет). Отросток CD34⁺/CD117⁺ телоцитоподобной клетки (участок прикрепления отростка обозначен ↑) в перинекротической области раны на 3 сутки эксперимента. Докраска ядер DAPI. Ув.: A - ×400; B - ×1000

В фазе воспаления в перинекротической области раны телоцитоподобные клетки, как правило, обнаруживаются в сетчатом слое дермы, с формированием трехмерной структуры. В гиподермисе определяются единичные тела клеток, но повсеместно визуализируется более выраженная межклеточная сеть отростков. Клетки имеют не четкие контуры, вследствие этого их сложно отнести к какой-либо конкретной морфологической форме. Отростки визуально утолщены. Через 24 часа после травмы средняя интенсивность единиц яркости обнаруженных клеток для маркера CD34 определена на уровне 17,25±0,6 условных единиц, для CD117 – 9,40±0,9 условных единиц (рис. 5).

Рис.5. Динамика величины интенсивности единиц яркости иммунофлуоресценции телоцитоподобных клеток на разных сроках эксперимента

Второй пик усиления сигнала флуоресценции использованных маркеров приходится на фазу пролиферации в рамках раневого процесса (3 сутки после травмы). Средняя интенсивность единиц яркости маркера CD34 равна 40,71±0,3 условных единиц, для CD117 – 53,56±0,7 условных единиц (рис.6).

Рис. 6. Измерение средней интенсивности флуоресценции (MFI) с использованием автоматизированного выделения интересующей области на основе порогового значения сигнала на 3 сутки эксперимента: A) CD34 (Alexa Fluor 488 — зелёный); B) CD117 (b, Cy3 — красный). Левая панель. Вид, на котором показан канал флуоресценции, подлежащий количественному анализу. Левая панель. Исходное флуоресцентное изображение среза кожи крысы на 3 сутки эксперимента 

В этот период выявляются телоцитоподобные клетки всех фенотипов (рис. 7). Определяются овальные, веретенообразные или треугольные клеточные тела, как правило от них отходят две длинных телоподии.

Рис.7. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к CD34 (зеленый спектр) и CD117 (красный спектр), солокализация двух маркеров (желтый цвет). Гетероморфия дермальных телоцитоподобных клеток: A) овоидное тело; B) треугольное тело; C) веретеновидное. Докраска ядер DAPI. Ув.: ×1000

Фаза дифференцировки характеризуется относительно низкими показателями интенсивности флуоресценции обоих маркеров по сравнению с предыдущими периодами. Так, через 6 суток после травмы средняя интенсивность единиц яркости маркера CD34 равна 22,20±0,6 условных единицы, для CD117 – 31,96±0,1 условная единица. Через 10 суток после травмы средняя интенсивность единиц яркости маркера CD34 равна 30,86±0,2 условных единиц, для CD117 – 35,64±0,2 условных единиц. Однако в следующую фазу – адаптации тканевых структур - значения интенсивности единиц яркости маркера CD34 значительно превышают показатели маркера CD117 (56,50±0,5 условных единиц для маркера CD34 и 38,13±0,2 для маркера CD117).  В этот период вновь выявляются телоциты различных морфологических групп. Визуализируются тонкие отростки с локальными расширениями. Совместная детекция маркеров CD34/CD117 в завершении раневого процесса равномерная (33,98±0,2 условных единиц для маркера CD34 и 34,35±0,6 условных единиц для маркеров CD34 и CD117 соответственно через 25 суток после травмы).

На протяжении всего раневого процесса наблюдается отчетливая динамика количества телоцитоподобных клеток относительно его фаз. Так, наибольшее количество телоцитов выявлено в фазах некроза и пролиферации (рис. 8).

Рис. 8. Динамика количества CD34/ CD117 – иммуноположительных телоцитоподобных клеток на этапах эксперимента

Нежелательные явления

Нежелательные явления отсутствуют.

Обсуждение

Резюме результатов исследования

В результате проведения двойной иммунофлуоресцентной реакции на срезах кожи интактных крыс, а также кожи после механической травмы, показано, что в составе дермы всегда присутствуют клетки, имеющие иммунофенотип CD34+/CD117+ и по морфологическим признакам являющиеся телоцитами. Получены значения уровней интенсивности флуоресценции указанных маркеров телоцитоподобными клетками в составе дермы в норме и в процессе заживления раны (рис. 9). В качестве критерия оценки уровня интенсивности флуоресценции использована условная интенсивность единиц яркости, вычисленная в программе Zen 2.3. (определение условных единиц яркости при обработке цифровых изображений с флуоресцентного микроскопа). Анализ данных по двум маркерам показал динамику, которая, вероятно, коррелирует с функциональной направленностью телоцитов в дерме на этапах регенерационного гистогенеза (возможная регуляция пула стволовых клеток различного происхождения, усиление сигналов к пролиферации кератиноцитов и соединительнотканных клеток, блокирование дифференцировки, усиление адгезии гемопоэтических клеток во время воспалительной реакции и т.д.). При этом, все перечисленные возможные функции дермальных телоцитов имеют первичный, гипотетический характер. Их подтверждение или опровержение требует проведения дополнительных исследований, возможно, с применением дополнительных специфичных к телоцитоподобным клеткам маркеров.

Рис. 9. Динамика экспрессии маркеров CD34 и CD117 в период нулевой регенерации и на этапах раневого процесса

 

Интерпретация результатов исследования

Телоциты кожи, в связи с их особенной ультраструктурой, вероятно влияют на физиологическое и патологическое состояние органа. Неравномерное распределение дермальных телоцитов, в основном в нишах стволовых клеток (волосяные фолликулы, кровеносные сосуды), указывает на их участие в гомеостазе кожи и дерматологических заболеваниях. С другой стороны, установленные в данной работе морфометрические особенности и данные литературы говорят о том, что при различных кожных заболеваниях структура и ультраструктура телоцитов имеют различный характер реактивности [22]. Клеточное взаимодействие телоцитов с другими элементами кожи, их иммунологический профиль и изменения, происходящие с ними во время регенерации, указывают на весьма обширный функционал этого дифферона, однако подобные предположения требуют конкретизации. При исследовании уровней экспрессии маркеров CD34 и СD117 мы видим, что в коже интактных животных, а также на этапе завершения процесса регенерационного гистогенеза (фаза адаптации тканевых структур), когда микроскопическая картина в зоне регенерата близка по морфологическим показателям к норме, значения экспрессии по маркерам равномерна, тогда как в ходе регенерационного гистогенеза наблюдается отчетливая динамика. Так, в течение фазы некроза интенсивность флуоресценции используемых маркеров телоцитоподобными клетками меняется и через 12 часов после травмы обнаруживаются пиковые значения средней интенсивности единиц яркости флуоресценции. На данном этапе раневого процесса интенсивность флуоресценции СD117 превалирует над интенсивностью флуоресценции CD34. Сигнальный путь, ассоциированный с СD117, признан регулятором выживания тканевых клеток и их миграции, поэтому функция телоцитов, как «хранителей гомеостаза», нарушенного при механической травме, вполне подтверждается усиленной интенсивностью флуоресценции данного маркера в период воспаления [23].

 Фаза воспаления характеризуется усилением интенсивности флуоресценции маркера CD34. Недавно стало известно, что CD34⁺ клетки усиливают ангиогенез. С точки зрения механизма действия, CD34⁺ клетки, вероятно, участвуют в прямом встраивании в растущую сосудистую сеть и задействованы в паракринной активности посредством противовоспалительного, иммуномодулирующего, антиапоптотического и антифиброзного действия [24]. Т.е. уже на этапе воспалительной реакции телоциты, по всей видимости, организуют генерализованную регуляцию других тканевых элементов для нивелирования травмирующего действия. В фазе воспаления обнаруживаются единичные тела искомых клеток. В основном визуализируются слабо окрашенные отростки, без четких межклеточных соединений, которые не образуют упорядоченную трехмерную сеть, по аналогии с клетками в коже интактных животных, а демонстрируют хаотично расположенные отдельные отрезки телоподий. Чаще всего отростки обнаруживаются по ходу расположения коллагеновых волокон дермы, имеющих яркую аутофлуоресценцию, т.е.  включаются в трехмерную конфигурацию с межклеточным веществом. Видимые телоподии демонстрируют более низкие показатели иммунофлуоресценции. Интересен тот факт, что через 3 суток после травмы тела обнаруженных телоцитов чаще имели веретенообразную форму. На протяжении всего периода фазы воспаления (2-3 сутки с начала эксперимента) величины условной интенсивности единиц яркости CD117 превалируют над аналогичными показателями маркера CD34. Обращает на себя внимание, что в фазах пролиферации и дифференцировки в ходе раневого процесса телоподии визуализируются лучше, чем в другие периоды эксперимента.  Обнаруживаются контакты с другими телоцитами, определяется сетчатая структура. При этом наблюдаются практически равные значения интенсивности единиц яркости маркера CD117 на 6 и 10 сутки, при значительной разнице величин по маркеру CD34. Данный факт говорит о большой вероятности участия телоцитоподобных клеток в неоангиогенезе и формировании грануляционной ткани.

Ограничения исследования

Полученные в результате исследования данные подтверждают сведения из литературы относительно функциональной направленности клеток, имеющих иммуноположительный к CD34 и CD117 профиль. Однако, следует констатировать, что при данной экспериментальной выборке с использованием указанного метода исследования обнаружено не достаточное количество клеток для объемной статистической обработки. Ввиду этого обстоятельства в дальнейших исследованиях следует, вероятно, применить дополнительные маркеры для выявления большего количества клеток.

Заключение

В процессе регенерации кожи после механической травмы дифферон телоцитоподобных клеток демонстрирует разнообразные реактивные изменения, выражающиеся как в численности функционально активных клеток, так и в меняющихся морфологических характеристиках. Необходимы дальнейшие исследования для уточнения значения и цитофизиологии телоцитов при заживлении ран различной этиологии.

Этическая экспертиза

Условия содержания экспериментальных животных соответствовали принципам биоэтики и «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Хельсинкская декларация, 2000 г.), закону «О защите животных от жестокого обращения» (глава V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.), приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г., а также приказу МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Протокол проведения исследований одобрен комиссией независимого локального этического комитета ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ. Выписка из протокола заседания Локального этического комитета от 17.10.2023 г. (протокол № 283).

Источники финансирования

Отсустсвуют.

Раскрытие интересов

Отношения с третьими лицами отсутствуют.

Заявление об оригинальности

При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным

Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект

При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

 

Рассмотрение и рецензирование

Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

 

 

About the authors

Roman V. Deev

Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: romdey@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8389-3841
SPIN-code: 2957-1687

MD, Cand. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, 2 Abrikosovskiy aly, 119991, Moscow

Irina A. Odintsova

Kirov Military Medical Academy

Email: odintsova-irina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0143-7402
SPIN-code: 1523-8394

Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Tatiana Berezovskaia

S.M.Kirov Military Medical Academy of the Ministry of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: lapi2@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-1591-9152

Преподаватель кафедры гистологии с курсом эмбриологии

Russian Federation

Aleksey M. Emelin

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: eamar40rn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4109-0105
SPIN-code: 5605-1140
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files