Age-Related Dynamics of Cardiomyocyte Width in First-Year Infants: A Morphometric Analysis of Forensic Medical Archive Material.

Full Text

Обоснование

Ранний постнатальный период является критической фазой в развитии сердечно-сосудистой системы, характеризующейся глубокими структурными и функциональными преобразованиями, направленными на адаптацию к условиям внеутробного кровообращения [1, 2]. Одним из наиболее значимых феноменов этого этапа является выраженный регенеративный потенциал миокарда. У новорожденных млекопитающих, что убедительно продемонстрировано на модели мышей, кардиомиоциты сохраняют способность к пролиферации, обеспечивая существенное восстановление ткани после повреждения [3, 4]. Важно отметить, что эта уникальная способность к регенерации носит транзиторный характер и резко ограничивается в течение первой постнатальной недели у грызунов, что совпадает с изменением уровня оксигенации тканей и метаболического профиля [3, 5].

Ключевым направлением современных исследований является расшифровка молекулярных механизмов, лежащих в основе остановки клеточного цикла кардиомиоцитов. Установлено, что этот процесс регулируется сложным взаимодействием эпигенетических факторов, сигнальных путей и специфических факторов транскрипции, которые направляют дифференцировку кардиальной линии от пролиферативного состояния к терминально дифференцированному [6, 7, 8]. В ряде фундаментальных работ было показано, что гомеодоменный фактор транскрипции Meis1 выступает в роли критического негативного регулятора пролиферации кардиомиоцитов в постнатальном периоде [9]. Параллельно изучается роль других ключевых регуляторов, таких как сигнальный путь Hippo-YAP/TAZ и микро-РНК, включая семейство miR-15, которые также вносят существенный вклад в контроль пролиферативной активности кардиомиоцитов [4, 10].

В контексте изучения развития сердца особое значение приобретают точные количественные методы анализа. Традиционные описательные подходы в морфологии в настоящее время дополняются и часто заменяются методами морфометрии и стереологии, позволяющими получать объективные и воспроизводимые данные о структурных изменениях тканей [11, 12].

Рост миокарда в онтогенезе представляет собой результат двух основных сопряженных процессов: гиперплазии (увеличения количества кардиомиоцитов) и гипертрофии (увеличения размеров и объема отдельных клеток) [13]. В раннем постнатальном периоде у грызунов рост сердца обеспечивается как активной пролиферацией, так и увеличением размеров кардиомиоцитов, что подтверждено классическими морфометрическими исследованиями [14]. С течением времени пролиферативный потенциал кардиомиоцитов значительно снижается, и дальнейший рост сердца происходит преимущественно за счет их гипертрофии [15, 16]. Необходимо подчеркнуть выраженную видоспецифичность этих процессов. Потенциал к гиперплазии кардиомиоцитов в постнатальном периоде, а также временные рамки «пролиферативного окна» существенно различаются у мелких лабораторных грызунов и крупных млекопитающих, включая человека, что крайне важно учитывать при экстраполяции экспериментальных данных [17, 18, 19].

Структурная организация кардиомиоцитов новорожденных принципиально отличается от таковой у взрослых особей. Данные, полученные на различных животных моделях, указывают на то, что у новорожденных объемная плотность сократительного аппарата (миофибрилл) в цитоплазме кардиомиоцитов значительно ниже, а их пространственная организация менее упорядочена по сравнению со зрелыми клетками [20, 21]. Последующий постнатальный период характеризуется интенсивным синтезом и строгой пространственной укладкой миофибрилл, увеличением количества и размеров митохондрий, что в совокупности обеспечивает резкое возрастание сократительной способности миокарда [22, 23].

Таким образом, постнатальное развитие и возрастное ремоделирование сердца представляют собой динамичный, многоэтапный процесс, регулируемый сложным каскадом клеточных и молекулярных событий. Несмотря на значительный прогресс в понимании этих механизмов, достигнутый в экспериментальных исследованиях, сохраняется серьезный дефицит систематических количественных данных, непосредственно относящихся к морфометрии сердца человека в раннем постнатальном периоде [24, 25]. Имеющиеся единичные работы, посвященные морфометрическому анализу сердца у детей первого года жизни, носят фрагментарный характер и зачастую не позволяют выстроить целостную картину возрастной динамики ключевых параметров, таких как размеры кардиомиоцитов [26, 27]. Учет видоспецифических особенностей делает задачу получения таких данных для человека особенно актуальной

Провести количественный морфометрический анализ динамики изменения поперечного размера (ширины) кардиомиоцитов человека в течение первого года жизни для оценки ключевых аспектов структурной перестройки миокарда в ходе его постнатальной адаптации к гемодинамической нагрузке.

Основной показатель исследования

Ширина (поперечный размер) кардиомиоцита в микрометрах (мкм), измеренная на гистологическом срезе в продольной плоскости, проходящей через ядро клетки.

Дополнительные показатели исследования

Не изучали.

Методы измерения целевых показателей

Гистологические срезы толщиной 6 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, анализировали с помощью светового микроскопа «Микмед-3» (ЛОМО, Россия) с микроскопической камерой «МС 3.1» (ЛОМО, Россия). Цифровые изображения получали при объективном увеличении ×400. Измерения проводили в программе ToupView (версия 4.1, Hangzhou ToupTek Photonics Co., Ltd., Китай) после калибровки по объект-микрометру (1 пиксель = 0,25 мкм). Для каждого случая измеряли ширину 30 кардиомиоцитов, сеченных через ядро. Все измерения выполнялись одним исследователем.

Анализ чувствительности

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

Размер выборки предварительно не рассчитывался, обусловлен ретроспективным характером исследования и строгими критериями отбора.

Статистические методы

• Статистическую обработку данных проводили в среде R (версия 4.3.3). Использовались пакеты: tidyverse (включая dplyr, tidyr и ggplot2) для манипуляции с данными и визуализации, rstatix и ggpubr для статистических тестов и оформления графиков, car для проверки допущений, broom для извлечения результатов моделей, ggcorrplot для построения корреляционных матриц и patchwork для компоновки графиков.
• Первичные данные в пикселях были конвертированы в микрометры с использованием калибровочного коэффициента (1 px = 0,25 мкм). Всего проанализировано 420 измерений от 14 индивидуальных случаев в возрасте от 1 дня до 15 месяцев, данные получены до применения критериев исключения, для проверки стабильности получившихся результатов.
• Для оценки связи между возрастом и шириной кардиомиоцитов использовали коэффициент корреляции Пирсона и линейный регрессионный анализ. Применение параметрических методов было обосновано нормальным распределением средних значений ширины кардиомиоцитов по случаям рис.2 (тест Шапиро-Уилка, p = 0,940). Для сравнения четырех возрастных групп (0–1, 1–3, 3–6 и 6–15 месяцев) использовали критерий Краскела-Уоллиса с последующими попарными сравнениями по методу Данна с поправкой Бонферрони, поскольку распределение всех измерений (n = 300) отклонялось от нормального (тест Шапиро-Уилка, p = 0,003) и дисперсии в группах были неоднородны (тест Левена, p = 0,029). Уровень статистической значимости устанавливали при p < 0,05."
• Связь между возрастом и шириной кардиомиоцитов оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона и линейного регрессионного анализа. Для сравнения четырех возрастных групп (0–1, 1–3, 3–6 и 6–15 месяцев) использовали критерий Краскела-Уоллиса с последующими попарными сравнениями по методу Данна с поправкой Бонферрони. Уровень статистической значимости устанавливали при p < 0,05.

Результаты

Формирование выборки

Из архива 3044 гистологических препаратов миокарда за 2019 год по критериям включения было отобрано 14 случаев. После применения критериев исключения для формирования группы «условной нормы» в окончательный анализ вошли 10 случаев (n=10). Для каждого случая выполнено по 30 измерений ширины кардиомиоцитов, итого 300 измерений, последовательность формирования выборки представлена на рис. 1.

Рис. 1. Последовательность формирования выборки исследования.

Характеристики выборки

Выборка включала 10 детей в возрасте от 1 дня (0,33 мес.) до 15 месяцев. В связи с малым размером выборки и ретроспективным характером исследования подробная демографическая (пол) и клиническая характеристика лиц, не включенных в исследование, недоступна. Сравнение включенных и не включенных случаев провести невозможно.

Основные результаты исследования

Средняя ширина кардиомиоцитов по всей выборке составила 14,3 ± 1,89 мкм (медиана: 14,0 мкм). Результаты измерения для каждого случая представлены в таблице 1. Обнаружена статистически значимая сильная отрицательная корреляция между возрастом (в месяцах) и средней шириной кардиомиоцитов (r = -0,75; p = 0,013; 95% ДИ: от -0,94 до -0,23). Базовая характеристика исследуемых случаев и дескриптивная статистика ширины кардиомиоцитов представлены в таблице 2. Линейная регрессионная модель показала рис.3, что с увеличением возраста на 1 месяц ширина кардиомиоцитов в среднем уменьшается на 0,183 мкм (95% ДИ: от -0,315 до -0,052). Модель объясняет 56,25% вариабельности данных (скорректированный R² = 0,508).

Тест Краскела–Уоллиса выявил статистически значимые различия между возрастными группами (χ²(3) = 50,72; p < 0,001). Попарные сравнения с поправкой Бонферрони таблица 3 показали:

Ширина в группе новорожденных (0–1 мес.) достоверно больше, чем во всех остальных группах (p < 0,001 по сравнению с группами 1–3 и 6–15 мес.; p = 0,001 по сравнению с группой 3–6 мес.).

Ширина в группе 6–15 мес. достоверно меньше, чем в группах 1–3 мес. (p = 0,005) и 3–6 мес. (p = 0,007), графическое изображение результатов представлено на рис. 4.

Дополнительные результаты исследования

Не изучали.

Анализ чувствительности

Не проводили, однако без применения критериев исключения тенденция к уменьшению кардиомицитов сохранялась, но не была статистически достоверной рис. 5.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Настоящее исследование выявило устойчивую тенденцию к уменьшению поперечного размера кардиомиоцитов у детей в течение первого года жизни. Наиболее выраженное уменьшение ширины клеток наблюдалось в первые месяцы после рождения, с последующей стабилизацией и дальнейшим снижением к концу первого года.

В данном исследовании в качестве основного морфометрического параметра была выбрана ширина кардиомиоцита в поперечном сечении через ядро. Этот параметр является наиболее надежным и воспроизводимым при анализе стандартных гистологических срезов, так как в меньшей степени зависит от ориентации клетки в ткани и артефактов срезки по сравнению с измерением длины или площади. Определение объема клеток требует применения стереологических методов на серийных срезах, что выходило за рамки настоящей работы.

Полученные данные вносят вклад в создание количественных морфологических референсов для миокарда человека в критический период постнатального развития. Установленная закономерность уменьшения ширины кардиомиоцитов в течение первого года жизни согласуется с общебиологической моделью перехода от гиперпластического к гипертрофическому росту сердца и подтверждает, что ключевые этапы клеточного ремоделирования миокарда у человека, как и у экспериментальных животных, приходятся на ранний постнатальный период.

Результаты работы имеют прикладное значение для судебно-медицинской экспертизы и патологической анатомии, предоставляя ориентиры для дифференциальной оценки морфологии миокарда у детей первого года жизни. Полученные возрастные нормативы могут быть использованы при анализе случаев внезапной детской смерти (СВДС) для более точного разграничения возрастной нормы и патологических изменений. Кроме того, понимание нормальной динамики роста кардиомиоцитов является необходимой основой для изучения патологических процессов, таких как врожденные кардиомиопатии или последствия гипоксии

Ограничения исследования

Ограничения, связанные с выборкой: Маленький размер выборки (n=10) обусловлен ретроспективным дизайном и строгими критериями отбора, направленными на формирование группы «условной нормы». Это ограничивает статистическую мощность и обобщаемость (генерализуемость) результатов. Непропорциональное распределение по полу и недоступность подробных клинических данных могут вносить смещение.

Ограничения, связанные с показателями: Исследован единственный морфометрический параметр — ширина кардиомиоцита. Измерение объема клеток с помощью стереологических методов на серийных срезах не проводилось, что дает неполную картину структурного ремоделирования.

Ограничения, связанные с методами измерения: использовались стандартные гистологические методы (окраска г/э) и световая микроскопия. Хотя измерения были стандартизированы, метод зависит от качества фиксации и приготовления срезов. Все измерения выполнены одним исследователем, что исключает межнаблюдательную вариабельность, но не позволяет оценить ее потенциальное влияние.

Интерпретация результатов исследования

Полученные результаты согласуются с фундаментальными представлениями о переходе от гиперпластического к гипертрофическому росту сердца в постнатальном периоде, установленными на экспериментальных моделях [13, 15, 16]. Уменьшение ширины кардиомиоцитов может отражать процесс их удлинения и специализации, сопровождающийся перестройкой цитоскелета и сократительного аппарата [20, 22]. Данные вносят вклад в формирование морфологических референсов для миокарда человека в младенческом возрасте, дефицит которых отмечался ранее [24, 25]. Результаты имеют прикладное значение для судебно-медицинской экспертизы, предоставляя количественные ориентиры для дифференциальной оценки возрастной нормы и патологии миокарда, например, при расследовании случаев синдрома внезапной детской смерти.

Заключение

Проведенное исследование выявило достоверную негативную возрастную динамику ширины кардиомиоцитов в течение первого года жизни. Полученные данные, наряду с известными фактами о приросте массы сердца в этот период, позволяют предположить, что постнатальный рост миокарда происходит преимущественно не за счет классической гипертрофии кардиомиоцитов [28], определяемой как увеличение размера клеток, а посредством иных механизмов, вероятно, включающих гиперплазию и удлинение мышечных волокон. Эти наблюдения формируют морфометрическую основу для разработки объективных критериев оценки сердца в педиатрической патологии и судебной медицине. Для уточнения и валидации выявленных закономерностей необходимы дальнейшие проспективные исследования на более крупных когортах с применением стереологических методов, позволяющих оценить объемные параметры кардиомиоцитов

Вклад авторов

• Комаров А.А. — определение концепции, работа с данными, написание, пересмотр и редактирование рукописи;
• Комарова Е.В. — проверка и редактирование рукописи

Этическая экспертиза

Исследование проведено на полностью анонимизированном архивном материале. В соответствии с Хельсинкской декларацией (п. 32, ред. 2013) и национальными нормами для ретроспективных исследований такого типа, где получение информированного согласия невозможно, а риск для субъектов отсутствует, одобрение локального этического комитета не требовалось. Исследование не было зарегистрировано.

About the authors

Alexander Komarov

Author for correspondence.
Email: a1ek.89@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0289-6205
SPIN-code: 4215-8061
Scopus Author ID: 55321990200
ResearcherId: AAH-2058-2019

PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Department of Morphology, Penza State University

Ekaterina V Komarova

Email: ekaterinalog@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-1333-0151
SPIN-code: 4470-8042

Associate Professor, Department of Morphology, Penza State University

References

Supplementary files