ULTRASTRUCTURAL FEATURES OF PROGRAMMED CELL DEATH SPECIES: APOPTOSOME, INFLAMMASOME, AUTOPHAGOSOME

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Клеточная гибель представляет собой физиологичный и необходимый компонент развития и функционирования организма. Это явление не перестает привлекать внимания исследователей практически с возникновения клеточной теории, а названия процесса претепревали ряд изменений [1]. В разное время для описания гибели клеток использовались термины «абсорбция», «гистолиз», «цитолиз», «жировая дегенерация», «ишемическая гибель клетки», «перерождение». Так, в 1842 году Карл Фогт впервые описал гибель клеток хорды во время развития головастика как нормальный процесс, применяя термин абсорбция. В 1885 г. Вальтер Флемминг дал первое точное морфологическое описание гибели клеток в фолликулах яичника кролика. Он наблюдал фрагментацию ядра и назвал этот процесс «хроматолизис» (растворение хроматина). По сути, он описал апоптоз, но не дал ему отдельного концептуального названия. С конца XIX века для обозначения гибели клеток общеупотребляемым термином стал «некроз» [2].

В середине прошлого века сформировалось понимание того, что гибель клеток не только патология, но и неотъемлемая и важнейшая часть гистогенеза. В 1972 г. Дж.Керр, Э.Уилл и А Керри выделили апоптоз как отдельный от некроза, запрограммированный вид клеточной смерти, хотя необходимо заметить, что еще в 1964 г. Дж.Фокс предположил, что существует контролируемый механизм «самоубийства» клеток, и даже предложил для него термин «апоптоз» (от греч. Apo — от и ptosis— опадание, листопад), однако его работа осталась почти незамеченной. И уже в нашем веке были открыты и охарактеризованы новые, не-апоптотические формы запрограммированной клеточной смерти [3, 4].

Современная клеточная биология рассматривает гибель клетки не как хаотичный процесс некроза, а как строго регулируемую программу, необходимую для поддержания гомеостаза и защиты многоклеточного организма. Среди разнообразия программ клеточной гибели особое место занимают апоптоз, пироптоз и аутофагия — процессы, инициируемые и контролируемые специфическими макромолекулярными комплексами.

Ключевыми эффекторными комплексами этих программ являются апоптосома, инфламмасома и аутофагосома соответственно.

Несмотря на функциональные различия, объединяющей чертой этих структур является их ультраструктурная организация, которая напрямую определяет механизм их действия. Апоптосома, формирующая гептамерный комплекс «колесо с семью спицами», служит платформой для активации каспаз при реализации внутреннего пути апоптоза. Инфламмасома, представляющая собой мультибелковый олигомер, функционирует как сенсорный комплекс врождённого иммунитета, чья сборка в ответ на патогены или повреждение приводит к активации провоспалительных цитокинов и запуску пироптоза. В свою очередь, аутофагосома — уникальная двухмембранная везикула, опосредующая процесс аутофагии, обеспечивая деградацию внутриклеточных компонентов, что в определенных условиях также может привести к гибели клетки.

Детальное изучение ультраструктурной архитектуры этих комплексов — их морфологии, размеров, состава и динамики сборки — является весьма актуальной задачей, что позволяет не только понять молекулярные механизмы жизнедеятельности и гибели клетки, но и выявить узловые точки для потенциального терапевтического вмешательства. Нарушение нормального течения процессов, контролируемых апоптосомой, инфламмасомой и аутофагосомой, лежит в основе широкого спектра патологий, включая онкологические, нейродегенеративные, аутоиммунные и инфекционные заболевания [5-7].

Таким образом, цель данного обзора — систематизировать и проанализировать современные данные о ультраструктурных особенностях апоптосомы, инфламмасомы и аутофагосомы, проведя сравнительный анализ их строения в связи их специфической архитектуры с выполняемыми функциями в контексте программируемой клеточной гибели.

Апоптосома.

Апоптоз является фундаментальным биологическим процессом, необходимым для эмбриогенеза, поддержания гомеостаза тканей и устранения поврежденных или потенциально опасных клеток. В основе молекулярного механизма апоптоза лежит образование апоптосомы — крупного белкового комплекса, который служит молекулярной платформой для активации каспаз.. Это комплекс, функционирует как молекулярная платформа для активации каспаз. Нарушения в сборке и функционировании этого комплекса лежат в основе множества тяжелых заболеваний, включая злокачественные новообоазования, аутоиммунные и нейродегенеративные расстройства.

Открытие апоптосомы не было случайным событием, а стало результатом серии ключевых исследований, проведенных в 1990-х годах. Центральной фигурой, внесшей наибольший вклад в ее открытие и характеристику,  несомненно, является Сяодун Ван (Xiaodong Wang), работавший в то время в Медицинском институте Говарда Хьюза при Университете Эмори, а позже в Юго-западном медицинском центре Техасского университета.

Сначала исследователи очистили и клонировала белок Apaf-1 и показали, что для активации каспазы-9 необходимы три компонента: Apaf-1, цитохром c и dATP/ATP 1 [8].

В 1999 году ,было предположено, что это не просто комплекс, а огромная (~1,4 МДа) симметричная структура в форме "колеса с семью спицами". Именно тогда термин "апоптосома" был применен для описания этого функционального комплекса [9].

Первая трёхмерная структура апоптосомы человека была получена с помощью электронной микроскопии низкого разрешения, где комплекс был описан как колесообразная структура с семикратной симметрией [10, 11]. Именно визуализация подтвердила уникальную симметричную структуру комплекса и доказала, что это не случайный агрегат, а высокоорганизованная молекулярная машина.

При электронной микроскопии апоптосома выглядит как крупный, колесообразный олигомерный белковый комплекс диаметром около 1,0 – 1,5 мкм (до 2 мкм), распологающийся в цитоплазме клетки. Из-за формы, напоминающей колесо телеги с семью спицами, её называют «колесом смерти». Апоптосома состоит из семи субъединиц белка Apaf-1 (Apoptotic Protease-Activating Factor-1) (Рис.1).

 

Рис. 1. Апоптосома и мономеры Apaf-1. (Acehan D, Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW. Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol Cell. 2002;9(2):423-432. doi:10.1016/s1097-2765(02)00442-2_)

 

В свою очередь, одна молекула Apaf-1 состоит из нескольких доменов.

CARD-домен (Caspase Activation and Recruitment Domain) расположен на N-конце, отвечает за гомофильные взаимодействия с таким же CARD-доменом прокаспазы-9, что инициирует ее активацию.

Nucleotide-Binding Domain (NBD, или AAA+ ATPase domain) является центральным доменом, который связывает нуклеотиды (ATP/dATP). Это «молекулярный двигатель» апоптосомы.

HD-домен (Helical Domain) образует обод «колеса» и участвует в олигомеризации.

WD40-повторы располагаются на C-конце. Эти повторы выполняют репрессорную функцию в покоящейся клетке, удерживая Apaf-1 в неактивной, «закрытой» конформации. Они же являются сенсорами клеточного стресса, так как именно к ним связывается цитохром c.

Процесс сборки апоптосомы является ключевым событием в митохондриальном пути апоптоза и запускается в ответ на необратимые повреждения клетки.

Высвободившийся в цитоплазму цитохром с вследствие развития внутриклеточного стресса связывается с WD40-повторами Apaf-1 вызывает конформационные изменения в молекуле. Это снимает репрессию и открывает доступ к NBD-домену. В присутствии dATP (реже ATP) происходит его гидролиз и молекулы Apaf-1, связавшие цитохром c и dATP, начинают объединяться друг с другом. Семь молекул Apaf-1 образуют симметричное кольцо-образную структуру — собственно апоптосому, напоминающую цветок с семью лепестками, или колесо с семью спицами. CARD-домены при этом располагаются в центре этой платформы.

Центральные CARD-домены собранной апоптосомы служат платформой для рекрутирования прокаспазы-9. CARD-домен прокаспазы-9 взаимодействует с CARD-доменами Apaf-1. Это приводит к димеризации и последующей аутоактивации прокаспазы-9. Уже активированная каспаза-9 остается ассоциированной с апоптосомой, что значительно усиливает ее ферментативную активность. Далее она действует как «каспаза-каспаза», расщепляя и активируя нижестоящие эффекторные каспазы, главным образом, каспазу-3 и каспазу-7 – основных исполнителей апоптоза.

Процессы сборки и активность апоптосомы находятся под строгим контролем множества про- и антиапоптотических факторов, что позволяет клетке избежать случайной гибели. Среди них ведущими являются семейство белков Bcl-2 (как проапоптичеких, так и антиапоптических) и ингибиторы апоптосомы (IAPs). К другим критическим факторам можно отнести доступность dATP/ATP, оптимальную концентрацию К⁺, температуру и pH.

Визуализация апоптосом даже с помощью электронной микроскопии сопряжено с рядом технических и методологических с трудностей. Даже при использовании крио-ЭМ высокого разрешения (3,8–4 Å) центральная часть апоптосомы визуализируется хорошо, но периферические домены, такие как WD40-пропеллеры и цитохром c, часто отображаются с низким разрешением из-за их гибкости и подвижности Разрешение неравномерно по всей структуре: центральный хаб апоптосомы виден детально, а периферические области — размыто. Для получения стабильных и функциональных комплексов апоптосомы требуется точный контроль условий сборки (концентрация белков, наличие dATP/цитохрома c, буферные условия). Часто наблюдается образование гетерогенных форм и "лестниц" на гелях, что затрудняет выделение однородных частиц для ЭМ. Кроме того, продолжительность существования самого комплекса не превышает нескольких десятков минут [12-15].

Основными ультраструктурными характеристиками апоптоза, индуцированного апоптосомой, являются:

1. Конденсация хроматина по периферии ядра с последующей фрагментацией ядра.
2. Конденсация и сморщивание цитоплазмыпри сохранении целостности органелл.
3. Образование апоптотических телец — ограниченных мембраной фрагментов клетки.
4. Полное отсутствие признаков воспаления на ультраструктурном уровне.

На поздних стадиях оба пути апоптоза (внешний и внутренний) похожи — активируются эффекторные каспазы, которые и вызывают описанные выше морфологические изменения. Поэтому ультраструктурная картина в конечном счете очень похожа.

Ключевое отличие на ранних этапах заключается в различных способах инициации. При апоптосомном пути инициация каспазного каскада происходит через образование апоптосомы, и митохондрии изначально не затронуты. При митохондриальном пути первым признаком часто является набухание митохондрий и выход цитохрома c в цитоплазму, что уже можно увидеть под ЭМ до начала явной конденсации хроматина [16 - 19].

Инфламмасома.

Перед открытием инфламмасомы ее ключевые компоненты были уже хорошо известны. Интерлейкин-1β (IL-1β) был открыт в 1970-х годах как "эндогенный пироген" — ключевой белок, вызывающий лихорадку и воспаление. Caspase-1 (ранее IL-1-конвертирующий фермент, ICE) — был открыт в 1989-1992 годах. Ученые выяснили, что биологически неактивный предшественник pro-IL-1β должен быть расщеплен этим специфическим ферментом, чтобы превратиться в активный цитокин. NOD-подобные рецепторы (NLRs) - внутриклеточные сенсоры патогеновб были открыты в начале этого века.

В 2002 году команда Юрга Чоппа (Jürg Tschopp) из Университета Лозанны (Швейцария) совершила прорыв. Они изучали белки, участвующие в апоптозе и воспалении. Они идентифицировали в цитоплазме макрофагов большой мультибелковый комплекс (размером около 700 кДа), который образовывался в ответ на провоспалительные стимулы [20, 21].

В состав этого комплекса входили: белок NLRP1 (на тот момент известный как NALP1) — сенсорный компонент; адапторный белок ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), который играл роль "молекулярного клея"; каспаза-1— эффекторный фермент.

Авторы объединили термины "воспаление" (inflammation) и "сома" (soma, тело), создав новый термин — инфламмасома (inflammasome).

Инфламмасома — это, по сути, молекулярная машина, которая собирается внутри клетки при обнаружении опасности. Активированная каспаза-1 в составе этого комплекса затем обрабатывает не только pro-IL-1β, но и pro-IL-18.

После 2002 года были открыты и другие сенсорные белки, формирующие инфламмасомы. Так, NLRP3 инфламмасома стала самой известной и широко изучаемой. Она активируется не одним, а множеством различных стимулов (кристаллы мочевой кислоты, амилоидные бляшки при болезни Альцгеймера, асбест). Это сделало ее ключевым игроком в стерильном воспалении при многих хронических заболеваниях. NLRC4 инфламмасома — специализируется на распознавании компонентов бактериальных жгутиков (флагеллин) и систем секреции. AIM2 инфламмасома— была открыта позже и распознает не белки, а чужеродную двуспиральную ДНК в цитозоле (например, при вирусной инфекции) [22-26].

Открытие инфламмасом объяснило механизм целого класса заболеваний, таких как семейная холодовая аутовоспалительная болезнь (FCAS, Familial Cold Auto-inflammatory Syndrome) и синдром Макла-Уэллса (MWS, Muckle–Wells syndrome). Оказалось, что они вызваны"gain-of-function" мутациями в гене NLRP3, которые приводят к спонтанной, неконтролируемой активации инфламмасомы и, как следствие, к избыточной выработке IL-1β [27, 28].

Исследования инфламмасомы привели к переоткрытию и детальному описанию пироптоза — формы программируемой клеточной смерти, зависимой от каспазы-1 [29].

Инфламмасомы — это мультибелковые комплексы, участвующие в обеспечении врожденного иммунитета, обнаружении патогенов и запуске воспалительных реакций. Их активация приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов и пироптозу — особой форме клеточной гибели, что важно для защиты организма, но при дисрегуляции может вызывать болезни.

Инфламмасома состоит из трех частей: сенсорного белка (например, NLRP3, NLRC4, AIM2), адаптера (ASC) и эффектора (каспаза-1).

Сенсорный белок, как явствует из названия, выполняет функцию распознавания опасности. Описано несколько типов сенсоров, названных в честь самих инфламмасом. NLRP1, как компонент NLRP1-инфламмасомы активирует провоспалительныю каспазы 1 и 5, что приводит к внутриклеточному процессингу и образованию зрелой активной формы и высвобождению интерлейкинов 1 бета и 18. NLRP3 наиболее изученный и универсальный, реагирует на огромный спектр стимулов (кристаллы мочевой кислоты, амилоидные бляшки при болезни Альцгеймера, АТФ, токсины бактерий). NLRC4 реагирует на компоненты бактерий (например, флагеллин), AIM2 распознает цитозольную двуцепочечную ДНК (вирусную или бактериальную), пиридин реагирует на нарушение целостности цитоскелета, вызванное бактериальными токсинами.

Адаптерный белок ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), является второй частью молекулы. После активации сенсора ASC собирается в крупную структуру ("пятно" или "speck"), которая привлекает следующий компонент. Привлекаемая к комплексу ASC, каспаза-1 (третья часть) активируется (расщепляется, превращаясь в зрелую форму) и начинает свою работу [30-32].

Активация инфламмасом происходит в ответ на патогены (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs), повреждения (Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs) или стрессовые сигналы. Существуют канонические (через каспазу-1) и неканонические (через каспазы-4/5/11) пути активации. Тонкая регуляция необходима для предотвращения чрезмерного воспаления, а нарушения могут приводить к аутоиммунным, метаболическим, сердечно-сосудистым и нейродегенеративным заболеваниям.

Процесс активации протекает в два этапа. На первом этапе клетка сталкивается с молекулами патогена (PAMPs) или сигналами повреждения (DAMPs), которые распознаются другими рецепторами (например, Toll-подобными рецепторами, TLR). Распознавание приводит к активации транскрипционного фактора NF-κB, который включает гены, кодирующие пропро-интерлейкин-1β и саму пропро-каспазу-1, а также сам сенсор NLRP3. По сути, цель первого этапа – создание запаса неактивных предшественников.

На втором этапе происходит активация сенсора. Активация вызывается: притоком ионов K⁺ из клетки (вызванным, например, бактериальными токсинами, образующими поры); поступление в цитозоль митохондриальной ДНКили активных форм кислорода (АФК); разрушением лизосом (лизосомальная дестабилизация), когда такие частицы, как кристаллы мочевой кислоты, повреждают их мембрану. В результате сенсор олигомеризуется и привлекает белок ASC.

В дальнейшем ASC образует "speck" (пятно), привлекая прокаспазу-1, прокаспаза-1 активируется в каспазу-1, которая, в свою очередь, расщепляет пропро-IL-1β и пропро-IL-18 до их зрелых, биологически активных форм, или же активирует белок Gasdermin D, который образует поры в клеточной мембране, что приводит к пироптозу - воспалительной гибели клетки. Через эти поры зрелые цитокины выходят наружу [33, 34].

При классической электронной микроскопии инфламмасома выглядит как бесформенное электронно-плотное скопление в цитоплазме. Она значительно темнее окружающей цитоплазмы из-за высокой концентрации белков. Крио-электронная томография позволяет увидеть не просто "пятно", а филаментозную, нитевидную структуру инфламмасомы. Было показано, что белок ASC образует длинные фибриллы ("перья"), которые, собираясь вместе, формируют то самое "пятно". Каспаза-1 располагается на этих фибриллах [35-37] (Рис. 2).

 

Рис. 2 Электронные микрофотографии инфламмасомы NAIP5-NLRC4. A–C и E, изображения в электронном микроскопе негативно окрашенных образцов очищенной hNLRC4 (A), mNAIP5 (B), hNLRC4, хранящейся при высокой концентрации (C), и D0L-индуцированной mNAIP5-mNLRC4 инфламмасомы, свежеочищенной из клеток HEK293E (E). D, F и G, виртуальные срезы через электронные томограммы концентрированного образца hNLRC4 (D) и свежеочищенного образца инфламмасомы в виде сверху (F) и виде сбоку (G). Масштабные линейки соответствуют 50 нм. Halff EF, Diebolder CA, Versteeg M, Schouten A, Brondijk TH, Huizinga EG. Formation and structure of a NAIP5-NLRC4 inflammasome induced by direct interactions with conserved N- and C-terminal regions of flagellin. J Biol Chem. 2012;287(46):38460-38472. doi:10.1074/jbc.M112.393512

Основные ультраструктурные характеристики пироптоза, индуцированного инфламасомой отличаются от классического апоптоза.

Триггером запуска пироптоза на является образование не всегда видимой при микроскопии инфламмасомы, которая активирует каспазу -1. Одним из наиболее ранних признаков гибели клетки на начальном этапе является расширение пространства между мембранами ядерной оболочки. Это видно как "ободок" или "гало" вокруг ядра. В самом ядре хроматин конденсируется и смещается к периферии, прижимаясь к ядерной мембране. Однако в отличие от апоптоза, ядро не подвергается фрагментации с образованием отдельных телец, а обычно сохраняет свою общую сферическую форму до поздних стадий процесса.

Затем активированная каспаза-1 расщепляет белок Gasdermin D. Его N-фрагменты олигомеризуются и встраиваются в плазматическую мембрану изнутри, формируя крупные, неселективные поры диаметром 10-20 нанометров. При электронной микроскопии эти поры видны как четкие, круглые или овальные отверстия в плазматической мембране.

Наличие пор в мембране обуславливает нарушение ионный градиент. Вода и ионы по осмотическому градиенту устремляются в клетку, вызывая ее сильное набухание. Клетка и ее органеллы (митохондрии, эндоплазматический ретикулум) заметно набухают. Митохондрии могут увеличиваться в размерах, но их кристы обычно остаются интактными (в отличие от некоторых форм некроза), и не наблюдается высвобождения цитохрома с через наружную мембрану, как в апоптозе.

По мере накопления повреждений и осмотического давления, плазматическая мембрана окончательно разрывается, выпуская внутриклеточное содержимое во внеклеточное пространство.

После разрыва мембраны клетка быстро опорожняется. Высвобождаются провоспалительные цитокины (интерлейкин-1β и интерлейкин-18), которые уже были обработаны каспазой-1, а также другие "сигналы опасности" (DAMPs - damage-associated molecular patterns). При микроскопии наблюдаются лишь клеточные "обломки" и пустая или частично разрушенная цитоплазматическая мембрана [38, 39].

Аутофагосома.

В 1962 году Кит Р. Портер (Keith R. Porter) и его аспирант Томас Эшфорд (Thomas Ashford) наблюдали, как гепатоциты в ответ на введение глюкагона образуют вакуоли (полости), которые захватывают и переваривают митохондрии и другие клеточные компоненты.К.Р. Портер и Т. Эшфорд назвали этот процесс "клеточной деградацией", но еще не использовали термин "аутофагия" [40]. Важный вклад в открытие аутофагосомы принадлежит бельгийскому биохимику Кристиану де Дюву (Christian de Duve), который ранее открыл лизосомы — клеточные "органы-мусорщики", содержащие ферменты для переваривания. Именно де Дюв в 1963 году ввел термин "аутофагия" (от греч. "auto" — сам, "phagein" — есть). Он предположил, что лизосомы могут разрушать не только внешние материалы, но и собственные компоненты клетки. Де Дюв также предсказал существование органеллы, которая доставляет материал в лизосому, и назвал ее аутофагосомой [41]. До 90-х годов прошлого столетии было установлено, аутофагия существует у всех эукариот, однако ключевые гены и молекулярные механизмы оставались полной загадкой.

Перелом наступил благодаря работам японского ученого Ёсинори Осуми (Yoshinori Ohsumi). В конце 1980-х годов Ё. Осуми начал изучать аутофагию в пекарских дрожжах (Saccharomyces cerevisiae). Дрожжи — идеальная модель для генетических исследований, однако в дрожжах плохо идентифицируются маленькие аутофагосомы. Осуми создал мутантный штамм дрожжей, у которого были нарушены основные протеолитические (разрушающие белки) ферменты в вакуоли (аналог лизосомы у дрожжей). Когда в такой клетке запускалась аутофагия, аутофагосомы доставляли свое содержимое в вакуоль, но оно не могло быть переварено и накапливалось там. При микроскопии было видно, как в вакуоли накапливаются пузырьки-аутофагосомы. Это было прямое и наглядное доказательство процесса. Используя эту модель, Осуми в 1993 году провел ключевой эксперимент: он подверг эти дрожжи действию мутагена и стал искать мутанты, у которых аутофагия была нарушена. Так он идентифицировал первые 15 генов (autophagy-related genes, APG), необходимых для аутофагии. Позже эти гены были переименованы в ATG (Autophagy-related genes). В дальнейшем возглавляемым им коллективом были описаны образование фагофора, удлинение мембраны и образование аутофагосомы, слияние с лизосомойи деградация содержимого [42, 43].

В дальнейшем были обнаружены гомологи генов ATG у млекопитающих, стало ясно, что аутофагия — это не просто механизм выживания при голоде, а ключевой процесс поддержания нормального гомеостаза [44-46].

Аутофагосома — это специализированная двухмембранная везикула, формирующаяся в процессе аутофагии для захвата и доставки клеточного материала к лизосомам с целью его деградации. Этот процесс необходим для  поддержания клеточного гомеостаза, особенно при стрессах, голодании и различных заболеваниях [47, 48].

Процесс образования аутофагосомы запускается в ответ на различные сигналы: голодание, стресс, повреждение органелл или накопление белковых агрегатов. Ключевым белковым комплексом, запускающим образование аутофагосомы является комплекс ULK1 (Unc-51-like kinase 1) [48, 49].

В норме активность этого комплекса подавляется белком mTORC1, а при сигнале, вызывающем аутофагию mTORC1 инактивируется, комплекс ULK1 фосфорилирует и активирует следующий ключевой комплекс —Beclin-1-Vps34. Белок Vps34 является липидной киназой, которая фосфорилирует фосфатидилинозитол, производя фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI3P). PI3P служит якорем на мембранах, привлекающим другие белки, необходимые для формирования аутофагосомы.

Вследствие этих процессов в цитоплазме начинает формироваться небольшая, уплощенная мембранная структура, называемая изоляционной мембраной или, чаще - фагофором. Источником мембраны для фагофора служат различные органеллы, в основном эндоплазматический ретикулум (ЭПР), а также мембраны комплекса Гольджи, реже - митохондрий и сама плазматическая мембрана. В дальнейшем фагофор расширяется и окружает часть цитоплазмы или органоид [50-53]. За это отвечают две системы конъюгации, похожие на убиквитин-подобные системы]:

Первая система ATG12-ATG5-ATG16L1. В ней белок ATG12 ковалентно связывается с белком ATG5, затем этот комплекс ATG12-ATG5 связывается с белком ATG16L1, образуя крупный комплекс ATG12-ATG5-ATG16L1. Этот комплекс действует как эпсин для следующего этапа, определяя кривизну мембраны и способствуя ее изгибу.

Вторая система LC3 (MAP1LC3). В ней белок LC3 синтезируется в неактивной форме (pro-LC3) и обрабатывается белком ATG4 до формы LC3-I. Затем LC3-I связывается с липидом фосфатидилэтаноламином на мембране фагофора, превращаясь в LC3-II.

LC3-II — это ключевой маркер зрелой аутофагосомы. Он встраивается в растущую мембрану и обеспечивает "захват" содержимого аутофагосомы (например, взаимодействуя с рецепторами аутофагии, такими как p62/SQSTM1) [54, 55].

Когда фагофор полностью окружает свой груз, происходит замыкание мембраны, и образуется замкнутая двухмембранная везикула — аутофагосома. Зрелая аутофагосома не имеет ферментов для деградации, и ёе основная функция — доставить груз к лизосоме.

Аутофагосома транспортируется по цитоскелету и сливается с лизосомой, образуя аутолизосому. В ней кислая среда и гидролитические ферменты разрушают внутреннюю мембрану аутофагосомы и все её содержимое Образовавшиеся молекулы транспортируются обратно в цитоплазму для использования клеткой [56-58].

В отличие от апоптосомы и инфламмасомы, аутофагосома при электронной микроскопии обнаруживается часто и легко определяется как двумембранная везикула.

Для аутофагии характерно массовое образование двумембранных аутофагосом и аутофаголизосом. Цитоплазма клетки заполнена многочисленными вакуолями, ограниченными двойной мембраной . Это и есть аутофагосомы (Рис. 3, A). По мере слияния с лизосомами они превращаются в аутофаголизосомы (или аутолизосомы), которые имеют одинарную мембрану и содержат частично переваренный материал разной электронной плотности (Рис.3 B, C).

 

Рис. 3. Электронные микрофотографии аутофагосом (А) и аутофаголизосом (B, C) в пинеалоцитах крыс Wistar, подвергавшихся воздействию постоянного освещения в течение 21-го дня. ТЭМ, А - ×15000, B, С - ×6000.

При классическом апоптозе массового образования вакуолей не отмечается, вместо этого наблюдается конденсация хроматина и фрагментация клетки. При аутофагии конденсация хроматина и кариорексис как правило отсутствуют или выражены очень слабо. Ядро может сохранять свою форму вплоть до поздних стадий, хотя в конечном итоге также разрушается. И, наконец, клетка не распадается на мелкие, окруженные мембраной апоптотические тельца, которые фагоцитируются соседними клетками.

На ранних стадиях митохондрии, ЭПР, аппарат Гольджи могут выглядеть нормально, но они активно захватываются формирующимися аутофагосомами. По мере прогрессирования процесса они исчезают, будучи уничтоженными в аутофаголизосомах. Это отличается от некроза, где органеллы набухают и разрываются. Как и при апоптозе, плазматическая мембрана клетки длительное время остается интактной, что предотвращает выброс клеточного содержимого и, как следствие, воспаление. Однако в конечном итоге мембрана разрушается.

Поскольку цитоплазматические компоненты (рибосомы, цитоскелет, органеллы) последовательно уничтожаются аутофагией, цитоплазма становится все более "пустой" (электронно-прозрачной) и содержит в основном только эти гигантские вакуоли [59-62].

Однако, необходимо заметить, что классическая гибель клетки, индуцированная аутофагосомой, наблюдается в определенных физиологических условиях, например, при удалении определенных клеток в ходе эмбриогенеза. В патологии она часто сочетается с признаками апоптоза или некроза.

Проведенный анализ демонстрирует, что апоптосома, инфламмасома и аутофагосома, будучи ключевыми эффекторными комплексами программируемой клеточной гибели и адаптационного ответа, представляют собой яркий пример функциональной специализации, находящей прямое отражение в их уникальной ультраструктурной организации (Табл. 1-3).

Апоптосома предстает как высокоорганизованная молекулярная машина с жесткой семикратной симметрией, чья «колесоподобная» архитектура оптимизирована для точной и эффективной активации каспазы-9. Эта структурная точность обеспечивает «чистый» и контролируемый исход — апоптоз, морфологически характеризующийся конденсацией хроматина, сморщиванием клетки и образованием апоптотических телец при полном отсутствии воспалительной реакции.

Инфламмасома, в отличие от апоптосомы, представляет собой динамичную филаментозную структуру, собранную «по требованию» в ответ на сигналы опасности. Её организация в виде ASC-«пятна» (speck) идеально соответствует провоспалительной функции: она служит платформой для массовой активации каспазы-1, что приводит к пироптозу. Ультраструктурные признаки этого процесса — набухание клетки, формирование пор Gasdermin D в плазматической мембране и её последующий разрыв — отражают его быстрый и «шумный» характер, направленный на экстренную мобилизацию иммунного ответа.

Аутофагосома кардинально отличается от двух предыдущих комплексов, поскольку является не белковым олигомером, а двухмембранной везикулой. Её ультраструктура, выявляемая методом электронной микроскопии, является диагностическим маркером процесса аутофагии. Наличие двойной мембраны, окружающей фрагменты цитоплазмы и органеллы, визуализирует фундаментальную функцию этого комплекса — не запуск протеолиза, а изоляцию и доставку груза для деградации и рециклинга, что в большинстве случаев служит механизмом выживания клетки.

Табл. 1. Сравнительная характеристика аутофагосомы, апоптосомы и инфламмасомы.

Критерий	Апоптосома	Инфламмасома	Аутофагосома
Основная функция	Индукция апоптоза	Индукция воспаления	Лизис органелл
Ключевой процесс	Апоптоз (программируемая гибель клетки)	Врожденный иммунитет	Аутофагия (макроаутофагия)
Структура	Олигомерный белковый комплекс (платформа для активации каспаз)	Олигомерный белковый комплекс (платформа для активации каспаз)	Двухмембранная везикула (вакуоль)
Основные маркеры/ Компоненты	Апоптоз-активирующий фактор (1 (Apaf-1), каспаза-9, цитохром c	NLR-рецептор (NLRP3), ASC, каспаза-1	LC3-II, каскад ATG-белков
Триггеры (сигналы)	Повреждение (ДНК, митохондриальный стресс)	PAMP, DAMP	Голодание, стресс, поврежденные органеллы
Основные этапы	1. Выброс цитохрома c 2. Сборка апоптосомы 3. Активация каспазы-9 4. Активация каспазы-3/7 → апоптоз	1. Активация сенсора (NLRP3) 2. Олигомеризация, recruitment ASC 3. Активация каспазы-1 4. Образование IL-1β / IL-18	1. Образование фагофора 2. Элонгация 3. Замыкание в аутофагосому 4. Слияние с лизосомой 5. Деградация
Ключевые ферменты	Каспаза-9 (инициаторная), Каспаза-3/7 (эффекторные)	Каспаза-1 (интерлейкин-1-превращающий фермент)	ATG-белки, лизосомальные гидролазы
Конечный результат	Гибель клетки (без воспаления)	Запуск воспалительного ответа (пироптоз)	Выживание клетки, рециклинг компонентов, обеспечение энергией

Табл. 2. Гибель клетки при апоптозе, инфламмасоме и аутофагосоме

Критерий	Апоптоз	Пироптоз	Аутофагия
Суть процесса	Запрограммированная гибель клетки без воспаления. "Аккуратное самоубийство".	Запрограммированная гибель клетки с провоспалительным ответом. "Взрыв".	Процесс деградации и утилизации внутриклеточных компонентов. В основном – механизм выживания, но в некоторых случаях приводит к гибели (аутофагическая гибель клетки).
Основная функция	Удаление ненужных, поврежденных или старых клеток; поддержание гомеостаза; эмбриогенез.	Защита от внутриклеточных патогенов (бактерии, вирусы) и опасных сигналов (DAMP). Активация иммунного ответа.	Переработка поврежденных органелл, белковых агрегатов; обеспечение выживания при стрессе (голод, гипоксия).
Морфологические признаки	Сморщивание клетки, конденсация хромата, фрагментация ядра, образование апоптотических телец.	Набухание клетки, разрыв мембраны, выход провоспалительного содержимого.	Образование двумембранных вакуолей (аутофагосом), которые сливаются с лизосомами (аутофаголизосомы). Вакуолизация цитоплазмы.
Воспалительный ответ	Отсутствует. Апоптотические тельцы быстро фагоцитируются соседними клетками.	Сильный. Высвобождение провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-18) и DAMPs.	В основном отсутствует или слабый, так как клетка утилизирует сама себя.
Инициаторы	Внешние сигналы (лиганды смерти), внутренний стресс (ДНК-повреждение), недостаток факторов роста.	PAMP (молекулы патогенов), DAMP (молекулы опасности, например, АТФ, кристаллы мочевой кислоты).	Клеточный стресс (голодание, гипоксия, окислительный стресс), повреждение органелл.
При заболеваниях	Снижен при злокачественных новообразоаниях, аутоиммунных заболеваниях. Повышен при нейродегенерации.	Воспалительные заболевания (подагра, диабет 2 типа, болезнь Альцгеймера, сепсис).	Защитная роль: предотвращает нейродегенерацию, злокачественные новообразования, инфекции. Гибель клетки: может способствовать гибели опухолевых клеток при химиотерапии.

Табл. 3. Электронномикроскопичесие явления клетки гибели клеток, инициированных апоптосомой, инфламмасомой и аутофагосомой.

Апоптоз (Апоптосома)	Пироптоз (Инфламмасома)	Аутофагия (Аутофагосома)
Ранние стадии: Конденсация хроматина (скопление по периферии ядра). •Сморщивание клетки, потеря микроскопических выступов. •Сохраняется целостность органелл (митохондрий и др.). Поздние стадии: •Фрагментация ядра(кариорексис). • Образование апоптотических телец — мембранные структуры с фрагментами ядра и цитоплазмы. •Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или соседними клетками.	•Набухание клетки и органелл (особенно митохондрий). •Разрыв плазматической мембраны. •Высвобождение клеточного содержимого в межклеточное пространство. •Конденсация хроматина (может быть, но не так выражена, как при апоптозе). •Потеря целостности органелл, признаки некроза.	• Появление в цитоплазме двумембранных вакуолей — аутофагосом (ключевой признак). •Включение в аутофагосомы цитоплазматических компонентов, органелл (митохондрий, фрагментов ЭПР). •Слияние аутофагосом с лизосомами → образование аутофаголизосом (автолизосом), где происходит деградация содержимого. •При гибели: массовая вакуолизация цитоплазмы, деградация органелл, но ядро часто остается интактным до поздних стадий.

Таким образом, несмотря на общую принадлежность к регуляторным системам клеточного гомеостаза, апоптосома, инфламмасома и аутофагосома демонстрируют принципиально разные структурно-функциональные парадигмы. Апоптосома — это эталон структурной предопределенности и контроля, инфламмасома — пример адаптивной самоорганизации для быстрого запуска воспаления, а аутофагосома — уникальная мембранная конструкция для утилизации внутриклеточных компонентов. Детальное изучение их ультраструктуры не только углубляет понимание фундаментальных механизмов жизни и смерти клетки, но и открывает перспективы для разработки таргетных терапевтических стратегий, направленных на коррекцию нарушений этих процессов заболеваниях.

About the authors

David Areshidze

Russian Scientific Center of Surgery named after academician B.V. Petrovsky

Email: labcelpat@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3006-6281
SPIN-code: 4348-6781

MD, Cand. Sci. (Biology)

Head of Laboratory of Pathology of Cell

Russian Federation

Maria A Kozlova

РНЦХ им. Б.В. Петровского

Author for correspondence.
Email: kma-morph@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6251-2560
SPIN-code: 5647-1372

Старший научный сотрудник лаборатории патологии клетки, кандидат биологических наук

Russian Federation

References

Supplementary files