Using the fluorescent dye Nuclear Yellow for staining neurons in histological sections

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Тельца Ниссля (хроматофильная субстанция, тигроид) — специфические структуры цитоплазмы нейронов, которые позволяют оценивать функциональное состояние клеток [1, 2]. Они состоят из субмикроскопических высокой электронной плотности гранул и зерен (рибосомы или зерна Палада), которые тесно связаны с мембранами эндоплазматической сети, которая, в свою очередь, играет важную роль в жизнедеятельности нейрона и обладает высокой лабильностью в физиологических условиях и, особенно, при патологии [3].

Хроматофильная субстанция может быть выявлена при рутинном окрашивании гематоксилином и эозином, однако эталонным методом считается окрашивание по Нисслю, которое было предложено в 1894 г. немецким невропатологом, психиатром и нейрогистологом Францем Нисслем [4]. Техника основывается на использовании основных анилиновых красителей, таких как толуидиновый синий, метиленовый синий, метиленовый зеленый, тионин, азур, крезиловый фиолетовый, связывающихся с нуклеиновыми кислотами внутри клеток [4]. Благодаря этому хроматофильная субстанция, богатая РНК, хорошо визуализируется. Кроме неё, метод Ниссля позволяет исследовать форму ядра и его расположение, хроматин, ядрышко с добавочными тельцами. Это необходимо для выявления таких изменений клеточного ядра, как его деформация, смещение ядра к периферии клетки, кариопикноз, изменение размеров и структуры ядрышка, наличие телец Кахаля, появление крупных внутриядерных включений. К выявляемым данным методом окраски изменениям цитоплазмы относят её гиперхромию, частичное или полное исчезновение хроматофильной субстанции (хроматолиз), накопление липофусцина и появление особых цитоплазматический включений, характерных для нейродегенеративных заболеваний и возрастных изменений нервных клеток [3, 5, 6].

В настоящее время метод окрашивания по Нисслю не теряет своей актуальности: с помощью него исследовались последствия черепно-мозговой травмы у крыс [7], функциональные и морфологические изменения при энцефалопатии, вызванной воздействием гравитационных перегрузок [8], проводилась оценка нейродегенеративных процессов, вызванных дезорганизацией нейрофиламентов [9], а также при болезни Паркинсона [10], нейрональной гипертрофии и регенерации после травмы лицевого нерва [11].

В современных нейрогистологических исследованиях большую роль играют методы, связанные с флуоресцентным окрашиванием, в силу обеспечения ими высокой контрастности и лучшего разрешения по сравнению со светлопольной микроскопией. В связи с этим, возникает потребность в разработке простой и хорошо воспроизводимой методики окрашивания нервных структур, выявляющей их аналогично методу Ниссля, с использованием флуорохромов.

На сегодняшний день разработаны коммерческие варианты флуоресцентных красителей по Нисслю: например, группа красителей NeuroTrace (Thermo Fisher Scientific, США) [12–14]. Существенным недостатком данных флуорохромов является их высокая стоимость. Кроме того, они применяются для окрашивания свежезамороженных или фиксированных криосрезов мозга. Публикаций об успешном применении данного красителя на парафиновых срезах не имеется. Ранее, для этой же цели было предложено использовать крезиловый фиолетовый в малом разведении, который флуоресцирует в красной области видимого спектра [15]. Картина такого окрашивания оказалась похожа на наблюдаемую при классической окраске по Нисслю с использованием данного красителя [15]. Иные общедоступные красители для проведения флуоресцентной окраски по Нисслю, в частности, эмитирующие в синем диапазоне видимого спектра, равно как и методика подобной окраски в общедоступных источниках не приводятся.

Среди доступных флуорохромов, которые потенциально могут быть использованы для флуоресцентной окраски по Нисслю, можно отметить Nuclear Yellow (NY; синоним — Hoechst S769121). Данный реагент связывается с нуклеиновыми кислотами [16] и преимущественно используется для ретроградного прижизненного окрашивания нейронов [17, 18]. Несмотря на большой потенциал красителя в области нейрогистологии, его применение остается недостаточно обоснованным. Для сравнения, анализ публикационной активности в базе данных PubMed показывает, что наиболее часто используемый в конфокальной микроскопии флуоресцентный краситель для окраски ядерной ДНК — DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) за последние 15 лет описывался в 7196 работах, тогда как для NY данный показатель составляет всего 2 работы.

Цель исследования

Целью данной работы является проверка красителя Nuclear Yellow (Hoechst S769121) на применимость в качестве красителя для визуализации нейронов на гистологических срезах.

Методы

Материалы исследования

Работа проводилась на срезах ствола мозга интактных лабораторных крыс линии Wistar (n=8). Объекты фиксировались в цинк-этанол-формальдегиде и далее подвергались заливке в парафин. Срезы толщиной 5 мкм были получены с помощью ротационного микротома Microm HM 325 (Thermo Scientific, США) и приклеены на предметные стёкла Super frost plus (Menzel, Германия).

Перед окраской проводилось удаление парафина с препаратов в ксилоле и регидратация в растворах этанола нисходящей концентрации и дистиллированной воде.

Для приготовления рабочего раствора красителя Nuclear Yellow (NY) использовали реагенты от двух разных производителей: NY (3K010, Люмипроб РУС, Россия) и NY (ab138903, Abcam, Великобритания). Окрашивание проводили водным раствором красителя с концентрацией 10 мкг/мл при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее, препараты промывали в дистиллированной воде в течение 10 – 15 с, а затем дегидратировали в изопропаноле и просветляли в ксилоле в течение 8 – 10 с, после чего заключали препараты в перманентную среду Bio Mount HM (Bio-Optica, Италия).

Окрашивание по Нисслю проводили водным раствором крезилового фиолетового с концентрацией 0,1% в течение 5 минут. После этого препараты промывали в дистиллированной воде в течение 5 минут и проводили дифференцировку по одному препарату под контролем микроскопа в 96% этаноле с добавлением ледяной уксусной кислоты (на 100 мл 2 – 3 капли ледяной уксусной кислоты), до полного исчезновения фоновой окраски нейропиля. Далее, препараты промывали в 96% этаноле, дегидратировали в изопропаноле и просветляли в ксилоле в течение 8 – 10 с, после чего заключали препараты в перманентную среду DePeX Mounting Medium (GEORGE T. GURR LTD, Великобритания).

Критерии отбора

Неактуально

Целевые показатели исследования

Основной показатель

В качестве основных показателей были выбраны: 1) соответствие выявляемых с помощью предложенной методики структур и характера их выявления с таковыми при использовании метода Ниссля; 2) спектральные характеристики исследуемого красителя, а именно максимум флуоресценции и интенсивность флуоресценции при связывании с различными морфологическими структурами.

Дополнительные показатели

Дополнительно были исследованы препараты после окрашивания красителем NY от разных производителей.

Методы измерения целевых показателей

Полученные препараты изучали методами микроскопии проходящего света видимого диапазона и конфокальной лазерной микроскопии.

Для изучения препаратов, окрашенных крезиловым фиолетовым, применялся микроскоп Leica DM 750, объектив PLAN 100×/1,25 OIL и цифровой камерой ICC50 (Leica Microsystems, Германия).

Исследование препаратов, окрашенных NY, проводили при помощи конфокальных лазерных микроскопов LSM710 (объектив LD C-Apochromat 40x/1.1 W Korr M27) и LSM800 (объектив Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27) (Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали лазер с длиной волны 405 нм. Модель LSM800 применялась для получения флуоресцентных изображений в режиме Frame; использованная; комбинация фильтров: Track 2: MBS None; Ch2: Р3342 400 – 565 нм. С помощью модели LSM710 были получены изображения нервной ткани в режимах сканирования Lambda mode для построения спектральных характеристик красителя; использованная комбинация фильтров: MBS – 405, FW1: Rear; Ch: 416 – 727 нм.

Статистические процедуры

Размер выборки

·         Неприменимо

Статистические методы

·         Неприменимо

Результаты

Объекты исследования

Неактуально

Основные результаты исследования

При окраске с помощью NY участков нервной ткани были четко визуализированы как ядерные структуры клетки, так и хроматофильная субстанция, богатая РНК (рис. 1, a). Характер полученной картины позволяет провести четкую аналогию между окраской с помощью данного флуоресцентного красителя и стандартной окраской по Нисслю (рис.1). При сравнении изображений, полученных окрашиванием нервной ткани обычным методом Ниссля и красителем Nuclear Yellow, виден разный характер окраски ядрышка нейрона. В первом случае окраска интенсивная и контрастная, в то время как флуоресцентно окрашенные ядрышки неодинаковы по уровню свечения: для некоторых наблюдается флуоресценция, превосходящая по интенсивности флуоресценцию цитоплазмы, а для других наоборот.

Спектр эмиссии красителя NY был получен для нескольких исследуемых образцов (рис. 2). В каждом случае сохранялась одна и та же закономерность зависимостей. Максимумы флуоресценции для всех участков нервной ткани наблюдались в диапазоне от 494 до 500 нм (рис. 2, b). Наибольшей интенсивностью флуоресценции характеризовались ядра глиальных клеток (рис. 2), которые отличаются неоднородностью и высокой степенью конденсации хроматина. Участки нейропиля обладали незначительной по сравнению с перечисленными ранее структурами флуоресценцией, обусловленной наличием РНК в отростках нейронов. Интенсивность флуоресценции ядрышка нейрона превосходила цитоплазматическую (рис. 2, b). При этом визуально отмечалось, что часть ядрышек нейроцитов окрашена ярко, другие имеют более слабую флуоресценцию (рис. 3).

Дополнительные результаты исследования

Сравнение препаратов, окрашенных красителями разных производителей, не выявило различий в характере флуоресценции.

Обсуждение

Резюме результатов исследования

Представленный в данном исследовании метод позволил флуоресцентно выявить структуры клеток нервной ткани, богатые нуклеиновыми кислотами, в частности, хроматофильную субстанцию нейронов, что позволяет сопоставить информативность данного метода с таковой при окрашивании по Нисслю. Выявлены отличия окраски по предлагаемому методу от классической окраски. Исследование спектральных свойств красителя установило различия в интенсивности флуоресценции между структурами клеток нервной ткани, но не выявило смещения максимумов флуоресценции при анализе структур, содержащих ДНК (хроматин) и РНК (ядрышко, хроматофильная субстанция).

Интерпретация результатов исследования

Nuclear Yellow позиционируется производителем как ядерный краситель, который способен связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, однако преимущественно связывающийся с участками, богатыми аденином и тимином, в малой бороздке ДНК, значительно усиливая флуоресценцию [17, 19]. Нами обнаружено, что окраска структур, богатых РНК, таких как хроматофильная субстанция и ядрышки нейронов, дает интенсивную флуоресценцию, что позволяет говорить о том, что полученная методология флуоресцентного окрашивания действительно аналогична методу Ниссля. Однако есть ряд особенностей, отличающих предложенную окраску от классической.

Особенностями флуоресцентных окрасок являются зависимость интенсивности и максимума флуоресценции от концентрации флуорохрома [20, 21] и молекулярного окружения [22]. Данные зависимости, по всей видимости, проявляются и при окраске ядрышек некоторых нейронов NY. В частности, для отдельных нейронов характерна слабая флуоресценция этих субклеточных структур, что можно объяснить явлением самогашения (self-quenching) флуоресценции, которое заключается в снижении квантового выхода флуорохрома при близком расположении двух или более его молекул [21]. Поскольку ядрышко отличается высокой плотностью РНК [5], это ведёт к концентрированию красителя в данной области. В связи с этим возникают условия для ослабления флуоресценции в зоне усиленного связывания красителя с целевыми структурами.

Однако подобное явление наблюдается лишь в некоторых ядрышках крупных нейронов и отсутствует в глиальных клетках, для которых характерны маленькие ядрышки и большой объем гетерохроматина [23]. В связи с этим, можно обратить внимание на особенности флуоресценции Nuclear Yellow, выявленные при изучении ядер гепатоцитов и тимоцитов, хроматин которых обладает различной степенью конденсации [24]. Выяснилось, что относительно рыхло расположенный хроматин ядер гепатоцитов демонстрировал более интенсивную флуоресценцию, чем сильно конденсированный хроматин ядер тимоцитов [24]. Краситель DAPI также образует флуоресцентный комплекс путем связывания в малой бороздке АТ-богатых последовательностей ДНК [25]. Показано, что количество связанного с клеткой DAPI зависит от степени конденсации хроматина, которая, в свою очередь, зависит от метода подготовки клеток. Например, экстракция гистоновых белков путем промывания клеток 0,1 н. соляной кислотой почти удваивает количество связанного с ДНК DAPI [25]. Исходя из этих данных можно предположить, что высокая конденсация хроматина в глиальных клетках уменьшает доступность участков для связывания с NY, что приводит к расположению флуоресцентных меток, недостаточному для самогашения, а следовательно, обеспечивает высокую интенсивность флуоресценции ядер глиальных клеток.

Анализ связывания красителя с РНК затруднен в силу ее гетерогенности и растворимости, иногда приводящей к потере РНК в клетках или ядрах во время обработки материала, а также тем фактом, что РНК почти всегда обнаруживается в комплексе со специфическими белками, некоторые из которых могут влиять на ее способность взаимодействовать с флуорохромами [24]. Опираясь на данные приведенного исследования, вариацию интенсивности флуоресценции ядрышек можно объяснить и разной доступностью РНК к красителю. Высокая доступность к образованию флуоресцентных комплексов приводит к большой плотности флуоресцентных меток, вследствие чего они подвергаются самогашению.

Установленная в настоящем исследовании особенность флуоресценции ядрышек нервных клеток может рассматриваться как преимущество предлагаемой окраски, поскольку позволяет получить дополнительный критерий для оценки функционального состояния нервной клетки. Преимуществом использования Nuclear Yellow является способность возбуждаться диодным лазером (405 нм), которым обычно комплектуются бюджетные варианты конфокальных микроскопов. Некоторые красители, например, DAPI, способны возбуждаться данным лазером, однако длина волны возбуждающего излучения удалена от максимума поглощения флуорохрома (для DAPI в комплексе с ДНК максимум поглощения составляет 358 нм [25]). В связи с этим, требуется повышение используемой мощности в несколько раз, при этом рост интенсивности возбуждающего излучения приводит к нежелательному ускорению выцветания флуорохрома [26].

Ограничения исследования

К ограничениям исследования можно отнести то, что для использования данной методики необходимо применять флуоресцентные и конфокальные лазерные микроскопы.

Заключение

Таким образом, краситель Nuclear Yellow пригоден для визуализации нервных структур на парафиновых срезах с получением флуоресценции в синем спектральном диапазоне. Это позволяет применять его в различных иммуногистохимических исследованиях с использованием меток, флуоресцирующих в красном и дальнем красном спектральном диапазоне. Он эффективно возбуждается диодным лазером 405 нм, входящим в стандартную комплектацию бюджетных конфокальных микроскопов, не проявляет сдвига спектральных характеристик при связывании с ДНК и РНК, коммерчески доступен. Также стоит отметить простоту метода окраски и длительную сохранность гистологических препаратов без потери флуоресценции.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Сравнение окрашивания нейронов NY с окрашиванием по Нисслю крезиловым фиолетовым. a) Краситель NY, конфокальная лазерная микроскопия, LSM800, объектив Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27. b) Крезиловый фиолетовый, светлопольная микроскопия, Leica DM 750, объектив PLAN 100 × /1.25 OIL.

Fig. 1. Comparison of Nuclear Yellow (NY) neuron staining with Nissl cresyl violet staining. a) NY dye, confocal laser microscopy, LSM800, objective: Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27. b) Cresyl violet, light microscopy, Leica DM 750, objective: PLAN 100 × /1.25 OIL.

Рис. 2. Интенсивность флуоресценции различных структур нервной ткани при окраске Nuclear Yellow (NY). a) область нервной ткани, окрашенной NY. b) спектр эмиссии красителя NY, снятый в разных участках нервной ткани. ROI — Region of interest. Интенсивность света измеряется в относительных, безразмерных единицах яркости (уровнях серого). ROI 1 (черная кривая) — эмиссия, снятая с участка ядрышка нейрона. ROI 2 (красная кривая) — с участка нейропиля, ROI 3 (синяя кривая) — с участка цитоплазмы нейрона (область хроматофильной субстанции). ROI 4, 5 (зеленая и фиолетовая кривые) — с участка глиальных клеток мозга с разной степенью конденсации хроматина.

Fig. 2. Intensity of fluorescence of different neural structure stained with Nuclear Yellow (NY). a) an area of nervous tissue stained with NY. b) the emission spectrum of the NY dye, taken in different parts of the nervous tissue. ROI — Region of interest. Light intensity is measured in relative, dimensionless units of brightness (gray levels). ROI 1 (black curve) is the emission taken from the nucleolar region of the neuron. ROI 2 (red curve) is from the neuropile region, ROI 3 (blue curve) is from the cytoplasm region of the neuron (region of Nissl substance). ROI 4, 5 (green and purple curves) — from a section of brain glial cells with varying degrees of chromatin condensation.

Рис. 3. Изображения нервной ткани, окрашенной Nuclear Yellow (NY). LSM800, объектив Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27.

Fig. 3. Picture of nervous tissue stained with Nuclear Yellow (NY). LSM800, objective: Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27.

About the authors

Ksenia A. Eremenko

Federal State Budgetary Scientific Institution ‘Institute of Experimental Medicine’

Author for correspondence.
Email: kseniaagelskaya@gmail.com
ORCID iD: 0009-0008-2774-898X

лаборант-исследователь лаборатории экспериментальной гистологии и конфокальной микроскопии

Russian Federation, 12 Akademika Pavlova st, Saint Petersburg, Russia, 197022

Anastasiia A. Beketova

Federal State Budgetary Scientific Institution ‘Institute of Experimental Medicine’

Email: beketova.anastasiya@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-8659-733X
SPIN-code: 6780-2677

лаборант-исследователь лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Russian Federation, Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 1

Olga V. Kirik

Federal State Budgetary Scientific Institution ‘Institute of Experimental Medicine’

Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
SPIN-code: 5725-8742
Scopus Author ID: 27171304100

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Russian Federation, Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 1

Dmitrii E. Korzhevskii

Federal State Budgetary Scientific Institution ‘Institute of Experimental Medicine’

Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-code: 3252-3029
Scopus Author ID: 12770589000

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы

Russian Federation, Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 1

References

Supplementary files