EXPRESSION OF MGLUR2/3 METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTORS IN THE VENTROLATERAL PART OF A NUCLEUS TRACTUS SOLITARII IN RATS IN THE EARLY POSTNATAL PERIOD IN NORM AND IN PRENATAL SEROTONIN DEFICIENCY

Full Text

Интеграция информации, приходящей в ядро одиночного пути (ЯОП) от висцеральных органов (респираторных, кардиоваскулярных и др.), опосредуется классическими нейротрансмиттерами, из которых основным возбуждающим является глутамат [1, 3]. Его высвобождение и передача импульсов регулируются различными медиаторами и их рецепторными системами - глутамата, GABA, серотонина [10]. В ЦНС передача глутамата может или усиливаться, или уменьшаться в зависимости от активации специфических рецепторов, в частности, определенных подтипов метаботропных рецепторов глутамата (mGluRs). В ЯОП эти рецепторные подтипы присутствуют в синапсах и широко распространены как на пресинаптических терминалях афферентных волокон, так и телах нейронов. Метаботропные рецепторы глутамата делят на 3 группы на основании гомологии аминокислотных последовательностей. Подтипы рецепторов mGluR2 и mGluR3 (mGluR2/3) входят в группу II, локализуются преимущественно на пресинаптических терминалях, связываются с аденилатциклазой и являются ауторецепторами, ингибирующими высвобождение глутамата путем блокирования потенциал-зависимых ионных кальциевых каналов, этим значительно снижая его синаптическую передачу [4, 15, 19]. Считают, что mGluR2/3 выполняют функцию модулятора передачи глутамата, регулирующего высвобождение трансмиттера, и их активация, в отличие от их ионотропных аналогов, не приводит к быстрому электрофизиологическому ответу [6]. Такое опосредование и контроль высвобождения возбуждающего трансмиттера в ЯОП этой рецепторной сетью играют важную роль в механизмах баланса возбуждения и торможения нейронов в респираторных субъядрах ЯОП (при обработке поступающей информации), особенно в ранние постнатальные сроки развития (т. е. в период созревания дыхательной системы у млекопитающих и человека), когда могут возникать патологические изменения в структуре дыхательных ядер, приводящие, в свою очередь, к развитию респираторных дисфункций. Несмотря на это, практически не уделяется внимания исследованию динамики экспрессии метаботропных рецепторов mGluR2/3 в респираторных субъядрах ЯОП в ранний постнатальный период. Установлено, что в ЯОП в нейротрансмиссию глутамата из висцеральных афферентов, наряду с другими трансмиттерами, вовлекается серотонин (5-HT) [18]. В субъядрах ЯОП присутствует значительное количество серотонергических волокон, приходящих из медуллярных ядер шва [20]. Выявлено, что здесь имеет место постоянное спонтанное высвобождение 5-HT из терминалей серотонинергических волокон, при этом регуляция нейротрансмиссии медиатора осуществляется его системой обратного захвата [7]. В ЯОП происходит интенсивная экспрессия рецепторов 5-HT (в основном подтипов 5-HT3 и 5-HT1А), локализующихся преимущественно пресинаптически на афферентных терминалях [11, 12, 17]. Серотонин через активацию этих подтипов рецепторов способствует либо высвобождению глутамата, либо ингибированию его высвобождения [10]. Взаимодействия между серотонином и глутаматом и их рецепторными системами слабо освещены в литературе, также остается без ответа вопрос о влиянии дефицита серотонина на деятельность возбуждающей глутаматергической системы в респираторных ядрах в ранние постнатальные сроки развития. В связи с этим целью настоящей работы было исследование динамики экспрессии метаботропных рецепторов mGluR2/3 в вентральном и латеральном респираторных субъядрах ЯОП в ранний постнатальный период в норме и при пренатальном дефиците серотонина у крыс. Материал и методы. Работа проведена на лабораторных крысах линии Вистар (n=16) из питомника ИФ РАН. Содержание животных и все экспериментальные процедуры осуществляли в соответствии с «Правилами содержания и проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для снижения эндогенного содержания серотонина использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы (фермента его синтеза) пара-хлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА в дозе 400 мг/кг самкам крыс вводили внутрибрюшинно на 9-е сутки беременности (для длительного снижения эндогенного содержания серотонина до 50-80% в период формирования у плодов ЯОП, одиночного пути и собственной серотонинергической системы). Продолговатый мозг у родившихся крысят исследовали на 5-, 10-еи 20-е сутки. В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок. При исследовании были использованы по 5-6 как подопытных, так и контрольных крысят каждого срока развития. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатно-солевом буфере (рH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 5 мкм на уровне Bregma 11.88 - 12.00 [16]. С помощью поликлональных кроличьих антител к рецепторам глутамата (mGluR2/3) (Abcam, США) выявляли распределение метаботропных рецепторов mGluR2 и mGluR3 (mGluR2/3). В качестве вторичных реагентов для mGluR2/3 использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). Клеточная локализация mGluR2/3: интегральный мембранный протеин. Иммуноцитохимические реакции у контрольных и подопытных животных осуществляли одновременно, часть срезов докрашивали тионином (Serva, США, Германия) и заключали в синтетическую среду Permount (Termo, США). Морфологический анализ проводили на цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия). На стандартной площади, равной 0,1 мм2, учитывали плотность сплетения иммунопозитивных терминальных отростков в нейропиле, плотность расположения зерен и крупных гранул (последние, предположительно, считаются терминальными синаптическими структурами и их скоплениями) [9]. Для проведения оценки оптической плотности продукта реакции в нейропиле использовали изображения, полученные с помощью цифровой видеокамеры, и програмное обеспечение ВидеоТест Мастер Морфология (ООО «Видео Тест», Санкт-Петербург). Статистическую обработку проводили средствами анализа ANOVA (Statistica 7.0, Statsoft Inc., США). Вычисляли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку. Критическим уровнем значимости считали р<0,05. Результаты исследования. Латеральное субъядро ЯОП. На 5-е сутки у контрольных животных в нейропиле выявляются интенсивно окрашенные отростки и терминали, образующие плотную сеть, на которой присутствуют много иммунопозитивных гранул (рисунок, а) (оптическая плотность продукта реакции составляет 0,097±0,008). На 10-е сутки интенсивность окрашивания отростков и терминалей снижается по сравнению с таковой на 5-е сутки (0,050±0,006). В нейропиле уменьшается плотность иммунопозитивных отростков, они образуют более рыхлую сеть (см. рисунок, в). На 20-е сутки интенсивность окрашивания отростков и гранул в нейропиле снова повышается (см. рисунок, д), увеличивается и плотность распределения иммунопозитивных отростков (0,088±0,008). На 5-е сутки в латеральном субъядре у подопытных животных иммунопозитивные отростки и терминали, в отличие от таковых у контрольных животных, образуют рыхлую сеть (см. рисунок, б), их меньше (0,050±0,005) и интенсивность их окрашивания ниже. На 10-е сутки как интенсивность окрашивания отростков и терминалей, так и плотность сети отростков (0,040±0,008) в нейропиле снижаются, но остаются много иммунопозитивных гранул (см. рисунок, г). На 20-е сутки интенсивность окрашивания отростков и терминалей вновь повышается (см. рисунок, е), но она меньше, чем у контрольных животных, плотность сети отростков также ниже (0,043±0,004). Вентральное субъядро ЯОП. На 5-е сутки у животных в контроле в нейропиле вентрального субъядра, так же как и в нейропиле латерального, интенсивно окрашены отростки и терминали, образующие плотную сеть (оптическая плотность равна 0,092±0,005). На 10-е сутки интенсивность окрашивания снижается, иммунопозитивных отростков и терминалей в нейропиле выявляется значительно меньше (0,054±0,007), они образуют рыхлую сеть. На 20-е сутки интенсивность окрашивания вновь повышается, увеличивается плотность сети иммунопозитивных отростков, терминалей и гранул (0,089±0,006). На 5-е сутки в вентральном субъядре у подопытных животных интенсивность окрашивания отростков и терминалей, образующих более рыхлую сеть, ниже чем у контрольных животных. Их оптическая плотность составляет (0,049±0,005). На 10-е сутки происходит некоторое снижение интенсивности окрашивания отростков и терминалей, отростки образуют рыхлую сеть, присутствуют многочисленные мелкие гранулы. Их оптическая плотность (0,039±0,003). На 20-е сутки интенсивность окрашивания сети отростков и терминалей вновь повышается, так же как и оптическая плотность (0,0424±0,006). Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что в период раннего постнатального развития у контрольных животных происходит изменение уровня экспрессии глутаматных метаботропных mGluR2/3 подтипов рецепторов. В неонатальном периоде как в вентральном, так и латеральном субъядрах, обнаружен высокий уровень экспрессии mGluR2/3. С увеличением постнатального возраста (во время 2-й недели) происходит резкое снижение экспрессии mGluR2/3, однако к ювенильному возрасту (к концу 3-й недели) уровень экспрессии вновь повышается в обоих респираторных субъядрах. Известно, что метаботропные рецепторы глутамата являются семейством рецепторов, связанных с G-протеинами, и представлены тремя группами, включающими 8 подтипов. Группа I включает подтипы mGluR1 и mGluR5, и эти рецепторы способствуют высвобождению глутамата, располагаясь на телах нейронов. Рецепторы, входящие в группу II (mGluR2 и mGluR3) и группу III (mGluR4, mGluR6, mGluR7, mGluR8), являются ауторецепторами, которые при возбуждении подавляют высвобождение глутамата и в основном локализуются на пресинаптических мембранах [4, 15, 19]. Показано, что снижение высвобождения глутамата опосредуется пресинаптическим рецепторным звеном [5, 8, 14, 21]. Подтверждением этого могут служить данные о том, что агонисты метаботропных рецепторов группы II снижают синаптическую передачу глутамата в синапсах барорецепторов в ЯОП и, наоборот, блокада рецепторов группы II повышает сиаптическую передачу глутамата [13]. Учитывая эти наблюдения и результаты, полученные в данной работе, с большой вероятностью можно предположить, что во время неонатального периода при достаточно высоком уровне экспрессии mGluR2/3 будет иметь место низкое высвобождение глутамата, однако во время 2-й постнатальной недели резкое снижение экспрессии mGluR2/3, возможно, будет способствовать увеличению его высвобождения, в ювенильном возрасте (т. е. к концу 3-й постнатальной недели) повышение экспрессии рецепторов будет вновь тормозить высвобождение глутамата. Поскольку нейроны, входящие в состав вентрального и латерального субъядер ЯОП, являются в основном инспираторными [2], то, вероятно, что ранний неонатальный период и ювенильный возраст могут быть критическими в связи со снижением в это время в респираторных субъядрах ЯОП уровня возбуждающего нейротрансмиттера и возможным повышением тормозных эффектов. Как известно, источником постоянного высвобождения серотонина в субъядрах ЯОП является значительное количество волокон, приходящих из медуллярных ядер шва [8, 21]. Выявлено, что в ЯОП имеет место интенсивная экспрессия рецепторов 5-HT (в основном подтипов 5-HT3 и 5-HT1А), локализующихся преимущественно пресинаптически на афферентных терминалях [12, 15, 17]. Показано, что существуют 2 пути действия серотонина - возбуждающий и тормозный. Серотонин через активацию этих подтипов рецепторов способствует либо высвобождению глутамата (при активации 5-HT3), либо его ингибированию (при активации 5-HT1А) [10]. Полагают, что в ЯОП высвобождение большого количества серотонина из серотонинергических волокон, активируя рецепторное звено, может участвовать в нейротрансмиссии глутамата [10]. Результаты данного исследования показали, что снижение содержания серотонина в пренатальный период оказывает влияние на интенсивность экспрессии mGluR2/3 в обоих субъядрах ЯОП. Сокращение более чем в 2 раза экспрессии рецепторов mGluR2/3 во все исследованные сроки во время раннего постнатального периода более выражено в вентральном субъядре. Такое изменение экспрессии рецепторов mGluR2/3 будет, вероятно, способствовать увеличению высвобождения глутамата в респираторных субъядрах и, как следствие, повышению возбудимости инспираторных нейронов, приводящего к нарушению баланса возбуждения и торможения нейронов ЯОП в респираторном цикле. Вероятным объяснением снижения экспрессии рецепторов является то, что дефицит серотонина может приводить к изменению процессов синтеза рецепторных белков и, как результат, к нарушению формирования глутаматергических синапсов, которое в постнатальный период может быть причиной недостаточного развития возбуждающей глутаматергической рецепторной сети в целом. Нельзя исключить возможность того, что пренатальное снижение содержания серотонина может приводить к изменениям структуры медуллярных ядер шва при их развитии и становлении и, как следствие, вызывать не только уменьшение количества серотониновых волокон, приходящих в ЯОП, но и вторичное снижение уровня высвобождаемого в ЯОП серотонина. Весьма вероятным является предположение о том, что пренатальный дефицит серотонина может быть причиной нарушения иннервации респираторных органов и приводить к уменьшению числа афферентных волокон, приходящих от них в ЯОП, что не исключает возможности резкого снижения числа рецепторов серотонина, локализующихся на их терминалях и участвующих в нейротрансмиссии глутамата. Проведенное исследование показало, что во время первых трех постнатальных недель в респираторных субъядрах ЯОП происходят колебания уровня экспрессии рецепторов mGluR2/3, подавляющих высвобождение глутамата. Учитывая способность глутамата активировать различные типы рецепторов, вероятно, в этот период раннего онтогенеза происходит настройка нейронов на передачу и реализацию возбуждения, т. е. созревания глутаматергической системы, обеспечивая в дальнейшем согласованную работу всех ее элементов. Структурные нарушения глутаматергической рецепторной сети, вызванные дефицитом серотонина, несомненно, могут быть основой развития респираторной дисфункции во время постнатального периода.

About the authors

L. I. Khozhai

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru
Laboratory of Nervous System Ontogenesis 6 Makarova Emb., St. Petersburg 199034

References

Supplementary files