MORPHO-FUNCTIONAL CHANGES IN THE LIVER AND THE POSSIBILITY OF THEIR CORRECTION IN THE OFFSPRING OF RATS WITH CHOLESTASIS

Full Text

Заболевания печени являются одними из самых распространенных хронических болезней у беременных женщин [6]. В связи с повышением нагрузки на печень и нарастанием содержания женских половых гормонов в III триместре беременности у женщин иногда происходит застой желчи (холестаз). При этом в крови накапливаются желчные кислоты, билирубин и холестерин [11]. Отмечается снижение синтеза желчных кислот и их трансплацентарного транспорта за счет уменьшения сродства переносчиков к желчным кислотам в клетках трофобласта плаценты [12]. Доказано, что при поражении печени у беременных у плода происходят серьезные изменения структуры и функции различных внутренних органов, особенно тех, которые были поражены у матери [9]. Гистофункциональные изменения печени у беременных крыс и их плодов в определенной мере синхронизированы. При этом увеличение нагрузки на печень у беременных самок и холестатическое повреждение ее тканей в эксперименте вызывает ряд компенсаторно-приспособительных изменений в печени плода, что позволяет предположить наличие тканеспецифических связей между органами матери и плода [1, 11]. Влияние холестаза у беременных на развитие у потомства внутренних органов, в частности печени, изучено недостаточно. Вместе с тем, среди средств коррекции патологии печени используют урсодезоксихолевую кислоту (УДХК) - естественную нетоксичную гидрофильную желчную кислоту, являющуюся составной частью пула желчных кислот. Основными механизмами действия УДХК являются цитопротективный и холеретический эффекты, обусловленные изменением пула желчных кислот с вытеснением УДХК токсических первичных желчных кислот (хенодеоксихолевая и др.), всасывание которых в кишечнике тормозится. Кроме того, УДХК оказывает иммуномодулирующее действие, вызывая снижение экспрессии антигенов HLA I и II классов на гепатоцитах, клетках билиарного эпителия, уменьшение продукции провоспалительных цитокинов. УДХК обладает также антиапоптозным и антиоксидантным свойством [2, 5, 10]. Цель настоящего исследования - выяснение воздействия подпеченочного холестаза у беременных самок на морфофункциональное состояние печени их потомства и возможности коррекции выявленных нарушений. Материал и методы. В работе использован материал от 30 беспородных белых крысят раннего постнатального периода развития (2 сут), в том числе 20 крысят - потомства крыс с экспериментальным подпеченочным холестазом, вызванным на 17-е сутки беременности наложением лигатуры на верхнюю часть общего желчного протока [3]. 10 из них взяты от нелеченых самок, другие 10 - от самок, которые с 17-х суток беременности и в течение 7 сут после родов получали препарат УДХК «Урсофальк» (Фальк, Германия) с пищей в дозе 50 мг/(кг·сут) (1-яи 2-я экспериментальные группы соответственно). 10 контрольных крысят родились от самок, которым в этот же срок беременности проделывали все те же хирургические манипуляции, но без перевязки общего желчного протока (ложнооперированные животные). Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках. С этого дня и до родов подопытных и контрольных самок, а также родившихся от них крысят содержали в стандартных условиях вивария при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Все опыты проведены с учётом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На данное исследование получено разрешение Этического комитета Гродненского государственного медицинского университета. Подопытных и контрольных крысят декапитировали под эфирным наркозом, быстро извлекали и взвешивали печень. Один кусочек печени от каждого животного фиксировали в смеси Карнуа и заливали в парафин, срезы толщиной 5 мкм монтировали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином - эозином. Срезы толщиной 10 мкм использовали для определения в клетках печени нейтральных гликопротеинов по методу Шабадаша [8]. Другие кусочки печени помещали на полоски маркированной фильтровальной бумаги и замораживали в парах жидкого азота, в котором хранили до начала исследования. Срезы толщиной 10 мкм готовили с помощью криостата Leica CM 1850 (Leica, Германия) при температуре -20 ºC, наклеивали на предметные стекла, подсушивали в течение 1 ч и использовали для определения в гепатоцитах активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ; КФ 1.3.99.1) по М.Nachlas; лактатдегидрогеназы (ЛДГ; КФ 1.1.1.27) по R. Hess; NADH-дегидрогеназы (NADH-ДГ; КФ 1.6.99.3) по М.Nachlas; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ; КФ 1.1.1.49) по R. Hess; кислой фосфатазы (КФ; фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; КФ 3.1.3.2) по Гомори [7]. Окрашенные срезы промывали в дистиллированной воде, фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в полистирол. Изучение, микрофотографирование и количественную оценку активности изучаемых ферментов проводили с использованием микроскопа Axioscop 2 plus (Сarl Zeiss, Германия) с цифровой видеокамерой (Leica DFC 320, Германия) и программы компьютерного анализатора изображения Image Warp (Bit Flow, США). Определяли оптическую плотность полученного осадка хромогена в цитоплазме гепатоцитов на максимуме поглощения окрашенных продуктов реакций. Для электронно-микроскопического исследования кусочки печени фиксировали на льду в 1% растворе OsO4 на 0,05 М буфере Миллонига (pH 7,2-7,4). Материал обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в аралдит. Срезы изготавливали на ультрамикротоме МТ-7000 (RMC, США). Для стандартизации на полутонких срезах выбирали однотипные участки - промежуточную зону печеночных долек, ультратонкие срезы контрастировали 2% раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония), фотографировали с помощью цифровой камеры (Olympus MegaView III, Германия). Морфометрию проводили с помощью программы для обработки изображения iTEM (Olympus Soft Imaging Solutions, Germany), обводя курсором на мониторе компьютера митохондрии и оценивая их размеры и форму, количество и относительную площадь, занимаемую в цитоплазме. При этом автоматически вычисляли периметр (Р), площадь (S), фактор формы (4πS/P2 - показатель сферичности и неровности контура митохондрий) и фактор элонгации (максимальный диаметр/минимальный диаметр - показатель сферичности) митохондрий. Полученные результаты обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью лицензионной программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). В описательной статистике для каждого показателя определяли значение медианы (Me) и интерквартильного диапазона (IQR). Значимыми считали различия между показателями в контрольной и подопытной группах при значениях Р<0,05 (Mann-Whitney U-test). Результаты исследования. Среднее количество крысят, родившихся от одной самки, - 8±3. У крысят контрольной группы на 2-е сутки после рождения печень покрыта тонкой соединительнотканной капсулой. В большом количестве встречаются очаги кроветворения. Границы долек плохо очерчены из-за слабого развития соединительной ткани (рис. 1, а). Нередко встречаются двуядерные гепатоциты. Пластинки гепатоцитов, так же как и синусоидные капилляры, имеют извитой ход, нет их четкого радиального расположения. В гепатоцитах выявляется большое количество гликогена и преимущественно располагающихся на периферии печеночных долек. В цитоплазме гепатоцитов хорошо развиты все органеллы, особенно гранулярная эндоплазматическая сеть (ГрЭС), отмечаются большое количество липидных капель, единичные лизосомы. В гепатоцитах хорошо сформированы билиарный и сосудистый полюса. Митохондрии имеют овальную форму и примерно одинаковые размеры (рис. 2, а). Большинство гепатоцитов - светлые, встречаются единичные темные и промежуточные. У подопытных самок крыс происходит удлинение сроков беременности, в среднем, на 1-2 сут по сравнению с контрольными. Макроскопически печень у них увеличена, зеленого цвета, с закругленным краем. При морфологическом исследовании печени самок крыс отмечается большое количество холангиол с пролиферирующим эпителием, что является подтверждением холестаза. Количество крысят у подопытных крыс - такое же, как у контрольных. Крысята рождаются слабыми и менее жизнеспособными. У них отмечается желтизна внутренних органов, в частности, печени и серозных оболочек. Масса крысят, родившихся от матерей с холестазом (1-я экспериментальная группа), на 7% меньше, чем в контрольной группе. У них в печени выявляется значительное расширение и кровенаполнение как портальных сосудов, так и синусоидных капилляров. Имеется меньшее количество очагов кроветворения, чем в контроле (см. рис. 1, б) и большее - двуядерных гепатоцитов. Содержание гликогена в гепатоцитах увеличивается. Гепатоциты с включениями гликогена располагаются в дольке равномерно. Активность маркерного фермента митохондрий - СДГ в гепатоцитах у крысят этой группы ниже, чем в контрольной группе, на 42,6%. Активность другого маркерного фермента митохондрий - NADH-ДГ значимо выше на 40% (табл. 1). По данным электронной микроскопии, у крысят, родившихся от матерей с холестазом, резко увеличивается количество темных и промежуточных клеток. Значительно уменьшается содержание липидных включений в цитоплазме гепатоцитов. ГрЭС более выражена, чем у контрольных крысят. Характерна дегрануляция (высвобождение рибосом ГрЭС). Увеличивается количество лизосом. Наблюдается полиморфизм митохондрий, отмечена тенденция к увеличению их средней площади (табл. 2), повышается число очень крупных митохондрий (мегамитохондрий). Встречаются митохондрии с просветленным матриксом и лизированными кристами (см. рис. 2, б). Зачастую крупные митохондрии скапливаются вблизи ГрЭС и окружают «гликогруппа), была на 2,3% выше, чем в 1-й группе, и значимо не отличалась от контроля. Масса печени в данной группе составляла 0,291 г, что на 23% больше, чем в 1-й и контрольной группе. Синусоидные капилляры умеренно расширены. Сохраняется меньшее количество очагов кроветворения (см. рис. 1, в). Нормализуется распределение гепатоцитов с включениями гликогена: они располагаются, как и в контроле, преимущественно на периферии печеночной дольки. Активность СДГ в цитоплазме гепатоцитов нормализуется. Активность NADH-ДГ остается значимо повышенной. Результаты электронно-микроскопического исследования показали, что в гепатоцитах у крысят, матери которых с 17-х суток беременности и в раннем послеродовом периоде получали урсофальк, отмечается большое количество обширных «гликогеновых полей». Светлые гепатоциты преобладают над темными и промежуточными и в них повышается число лизосом и возрастает общее количество митохондрий, а также делящихся и крупных митохондрий (см. рис. 2, в). Происходит увеличение средней площади, периметра и фактора элонгации митохондрий (см. табл. 2). Дегрануляция незначительна по сравнению с таковой в 1-й экспериментальной группе. Обсуждение полученных данных. Гемопоэтическая функция печени характерна для внутриутробного развития, и к моменту рождения осуществляется в основном переход на медуллярный путь кроветворения. При этом очаги кроветворения в печени еще сохраняются в течение нескольких суток после рождения, постепенно убывая. Уменьшение количества очагов кроветворения в печени у крысят, вероятно, связано с удлинением сроков беременности у самок. Появление большого числа двуядерных гепатоцитов у подопытных крысят свидетельствует об активизации регенераторных процессов в печени. Активность фермента аэробного распада углеводов в цитратном цикле - СДГ, в группе крысят, родившихся у матерей с холестазом, снижается, что приводит к задержке процессов роста и дифференцировки структурных компонентов гепатоцитов. Активность маркерного фермента анаэробного гликолиза - ЛДГ в экспериментальных группах остается на уровне контрольных показателей. Активность Г-6-ФДГ в цитоплазме гепатоцитов, которая является маркерным ферментом агранулярной эндоплазматической сети и пентозофосфатного цикла, имеет тенденцию к повышению в группе крысят при холестазе у матери. Это свидетельствует об увеличении синтеза липидов в клетке и усилении ее дезинтоксикационных функций. Характер ультраструктурных нарушений в гепатоцитах соответствует выявленным на светооптическом уровне гистохимическим изменениям. Снижение активности СДГ и повреждения митохондрий указывают на угнетение митохондриальных энергетических процессов в цитоплазме гепатоцитов у крысят при холестазе у матери. Наличие большого количества темных и промежуточных клеток косвенно свидетельствует об усилении в печени регенераторных процессов. Темные гепатоциты отличаются от светлых высоким энергетическим потенциалом митохондрий и более активным синтезом АТФ. Необходимо отметить, что темные и светлые гепатоциты не являются различными субпопуляциями клеток, а представляют собой переменные клеточные состояния, различающиеся энергетической активностью [5]. Меньшее количество липидных капель в гепатоцитах у крысят от матерей с холестазом возможно связано с нарушением всасывания липидов в кишечнике матери и может приводить к нарушению энергетического обеспечения гепатоцитов. Увеличение количества лизосом в гепатоцитах у этих крысят и тенденция к повышению активности КФ в цитоплазме гепатоцитов могут свидетельствовать о некотором усилении процессов аутофагии, направленных на удаление разрушенных органелл и мембран, в том числе и в результате их ускоренного изнашивания при повышенной активности клеток. Выявляемые в цитоплазме гепатоцитов у крысят, матери которых получали препарат «Урсофальк», очень крупные митохондрии, вероятно, могут быть гиперфункционирующими. Изменение же размеров и формы митохондрий свидетельствует о компенсаторных возможностях в энергетическом аппарате клеток [11]. Таким образом, экспериментальный холестаз у матери во время беременности оказывает значительное влияние на развитие и становление функций печени у потомства. При использовании с целью коррекции данной патологии препарата «Урсофальк» частично восстанавливается структура и метаболизм гепатоцитов, что подтверждает цитопротективное и мембраностабилизирующее действие УДХК.

About the authors

N. I. Duduk

Grodno State Medical University

Email: duduk.natalya@mail.ru

R. I. Kravchuk

Grodno State Medical University

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: zimatkin@grsmu.by

References

Supplementary files