MORPHO-FUNCTIONAL TRANSFORMATION OF EPENDYMAL CELLS IN THE DYNAMICS OF POSTNATAL DEVELOPMENT OF THE RAT BRAIN VENTRICLES

Full Text

Введение. Реснитчатые эпендимоциты, выстилающие стенки желудочков головного мозга (ЖГМ), наряду с выполнением барьерной, опорной и метаболической функций, играют существенную роль в транспорте спинномозговой жидкости (ликвора) за счет двигательной активности их цилиарного аппарата [8, 12, 17]. Сосудистые сплетения (СС) боковых и III желудочков, являющиеся основным источником образования ликвора [2, 13], обеспечивают его быстрый ток в направлении IV желудочка и подпаутинного пространства, как полагают, за счет пульсации, обусловленной сердечной деятельностью [3]. Скоординированное биение подвижных ресничек эпендимоцитов обеспечивает более медленный однонаправленный отток спинномозговой жидкости во время диастолы, а также ее перемешивание между центральными и пристеночными отделами ЖГМ [12, 14]. О важной роли эпендимоцитов в данном процессе свидетельствуют клинические и экспериментальные наблюдения избыточного накопления ликвора, вплоть до развития гидроцефалии при нарушениях дифференцировки эпендимоцитов и развитии дисфункции их реснитчатого аппарата [7, 9]. В литературе имеются публикации, посвященные исследованию микроскопической структуры и транспортной функции эпендимной выстилки [4, 15, 16] и сосудистых сплетений [6, 11, 13] ЖГМ в отдельные возрастные периоды, однако роль эпендимоцитов в формировании сбалансированной системы ликвородинамики в разных отделах ЖГМ в постнатальном онтогенезе продолжает оставаться недостаточно изученной. Цель исследования - изучение морфометрических параметров и цилиарной активности реснитчатых эпендимоцитов в процессе постнатального развития желудочков головного мозга. Материал и методы. Изучены ЖГМ 109 белых крыс-самцов Вистар в возрастном интервале от рождения до 12 мес, выращенных в условиях кафедрального вивария. Распределение животных по возрастным группам проводили в соответствии с периодизацией постнатального развития крыс [1]. Группа периода молочного кормления (38 крыс) включала новорожденных (1-3 сут) - 15 особей, животных подсосного периода (10, 20 сут) - 23 особи; группа периода полового созревания (28 крыс) - инфантильные особи (1, 3 мес); группа репродуктивного периода (43 крысы): молодые (4, 8 мес) - 26 особей и взрослые (12 мес) - 17 особей. Эксперименты производились на наркотизированных животных (уретановый наркоз, 1000/кг внутрибрюшинно). После извлечения из полости черепа головной мозг переносили в подогретую до 36,5±0,5 ºС среду Игла МЕМ с L-глутамином. С помощью вибратома PELKO easiSlicertm (США) изготовляли горизонтальные срезы толщиной 100-300 мкм. Биоптаты из стенок боковых (Бж), III (IIIж), IV (IVж) ЖГМ и водопровода мозга (Вм) помещали в лункообразное углубление предметного стекла, заполненного средой Игла МЕМ, накрывали покровным стеклом и проводили прижизненную видеомикроскопию с помощью программно-аппаратного комплекса «Азимут-4» (НПО Азимут, Санкт-Петербург, Россия). О функциональной активности эпендимоцитов судили по частоте биения ресничек (ЧБР), скорости движения жидкости в пристеночной зоне (СДЖ). Измеряли линейные размеры эпендимоцитов - высоту клеток (ВК) и длину ресничек (ДР). Была использована методика прямой видеорегистрации биоптатов с последующим компьютерным анализом цифровых видеофайлов при помощи программы MOSFRO (v. 4) [5]. Животных выводили из эксперимента путем декапитации. Все эксперименты проведены в соответствии с отечественными нормативами и современными международными биоэтическими стандартами по работе с лабораторными животными (заключение этического комитета ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России, протокол № 4 от 18.10.2016 г.). Для гистологического исследования головной мозг крыс фиксировали в 10 % нейтральном формалине и заливали в парафин. Горизонтальные серийные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином. Для оценки возрастной динамики объема Бж, IIIж, IVж выбирали срезы, на которых их площадь сечения была максимальной. Площадь полости желудочка мозга на срезе (SЖГМ) определяли на оцифрованных микрофотографиях (ув. 10) путем обведения границ полости по внутренней поверхности стенки ЖГМ и последующих измерений в программе Image . Определение объемных фракций сосудистых сплетений в ЖГМ (VСС) проводили стереологически на серийных срезах с помощью окулярной сетки с 60 равноудаленными узлами пересечения (об. 40, ок. 10). Среднюю площадь сечения сосудистых сплетений (SСС) рассчитывали по формуле SСС=SЖГМ×VСС. Для каждого желудочка и каждой возрастной группы рассчитывали коэффициенты изменения ЧБР (КЧБР), СДЖ (КСЖД), SЖГМ (KЖГМ) и SСС (КСС) по сравнению с новорожденными (значения соответствующих параметров новорожденных были приняты за 1,0). Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 8.0. Для проверки статистических гипотез о значимости различий между параметрами разных возрастных групп использовали t-критерий Стьюдента при уровне значимости p≤0,05. Результаты исследования. Полости желудочков головного мозга на всех исследованных препаратах были выстланы лежащими в один слой кубическими или низкопризматическими эпендимоцитами с хорошо развитым реснитчатым аппаратом. Только в водопроводе мозга эпендимоциты имели отчетливую призматическую форму (рис. 1). Возрастная динамика количественных структурных и функциональных параметров эпендимной выстилки в различных отделах головного мозга крыс представлена в табл. 1. У новорожденных животных линейные параметры эпендимоцитов существенно варьировали в зависимости от желудочка: высота клеток (ВК) в IVж и Вм на 14-23 % была больше, чем в Бж и IIIж. Длина ресничек (ДР) была минимальной в Бж и IVж (5,3-5,8 мкм) и максимальной в водопроводе мозга (11,3 мкм). На протяжении 1 мес постнатального развития для всех ЖГМ характерна сходная по направленности динамика ВК: рост на 30-40 % в Бж и 45-56 % - в IIIж и IVж по сравнению с новорожденными. Увеличение ДР зарегистрировано только в IIIж и IVж. У половозрелых животных (4, 8 и 12 мес) данные показатели во всех изученных отделах стабилизируются в диапазоне ±10 % от исходного уровня. Наименее выражена возрастная динамика показателей в Вм: значения ВК и ДР сохраняются на стабильном уровне (±10 %) в течение всего периода наблюдения. Возрастная динамика мерцательной активности эпендимоцитов в разных ЖГМ также имеет существенные особенности (рис. 2). У новорожденных животных ЧБР в Бж в 1,5-1,7 раза больше, чем в IIIж и IVж; СДЖ максимальна в Бж, IIIж и Вм, превышая аналогичный показатель IVж в 1,4 раза. В Бж исходно высокая (22 Гц) ЧБР сохраняется в течение первых 10 сут после рождения. Начиная с 20-х суток, показатель стабилизируется на уровне 15-17 Гц (p<0,05). В IIIж и IVж с более низкими начальными значениями ЧБР (13-15 Гц) максимальный подъем показателя (в 1,3-1,5 раза) зарегистрирован на 20-е сутки. У 1-месячных животных и в более поздние сроки ЧБР также стабилизируется на уровне ±10 % от исходного. В водопроводе мозга закономерной динамики мерцательной активности эпендимоцитов на протяжении всех изученных возрастных периодов не выявлено. Несмотря на описанные региональные особенности двигательной активности эпендимоцитов, цилиарный клиренс в пристеночном слое во всех изученных отделах изменяется сходным образом (см. рис. 2). СДЖ достигает максимальных значений на 10-е сутки и отчетливо снижается к концу 1-го месяца на 22-33 % (Бж, IVж) и 45-55 % (IIIж, Вм). Начиная с 3-го месяца и до 12-го средние величины СЖД в Бж, IIIж и Вм стабилизируются на уровне 30-40 % от показателей 2-10 сут и 60-70 % - в IVж и не имеют значимых различий между желудочками. Сопоставление возрастной динамики размерных характеристик ЖГМ и показателей цилиарного транспорта эпендимоцитов (см. рис. 2, 3) свидетельствует, что кривые изменений SСС и СДЖ во всех ЖГМ имеют отчетливо выраженный «зеркальный» характер: коэффициенты корреляции Пирсона для Бж, IIIж и IVж равны 0,82, 0,64 и 0,87 соответственно. Возрастная динамика SЖГМ и SСС в разных желудочках мозга также имеет существенные особенности (табл. 2, см. рис. 3). Значительный прирост SЖГМ зарегистрирован на 10-е сутки после рождения в Бж и IIIж в 1,7 и 2,0 раза соответственно. К моменту вступления в репродуктивный возраст (4 мес) размер данных желудочков увеличивается более медленно - в 1,3-1,5 раза по сравнению с 10-ми сутками. В растущих желудочках к 10-м суткам наблюдается ускоренное формирование сосудистых сплетений (рис. 4, а, б). В целом, для Бж и IIIж характерна сходная динамика роста размерных характеристик ЖГМ и СС, при этом на все изученные сроки в Бж скорость роста объема сосудистых сплетений существенно (КСС/KЖГМ=1,4-1,6) опережает темпы увеличения его объема, а в IIIж оба процесса идут с одинаковой скоростью (см. рис. 3, а, б). В IVж SЖГМ увеличивается равномерно в первые 8 мес (см. рис. 3; 4, в, г). При этом только в возрастном интервале от 1 до 4 мес сосудистые сплетения во всех желудочках мозга растут ускоренными темпами (КСС/KЖГМ=1,3-1,4). Обсуждение полученных данных. Результаты исследования свидетельствуют о том, что после рождения эпендимная выстилка ЖГМ развивается как целостная тканевая система. Наиболее значимые ее изменения отмечены в течение первых 20 сут жизни животного. Самые динамичные морфофункциональные перестройки наблюдаются в Бж. Они включают ускоренный рост площади полости желудочка на срезе, опережающий темп развития сосудистых сплетений, максимальные значения морфометрических параметров и мерцательной активности эпендимоцитов, наиболее высокий уровень СДЖ в пристеночной зоне. Эти наблюдения коррелируют с данными литературы о важной роли Бж в морфогенезе и функционировании системы ЖГМ [9, 10, 14]. Сходные по направленности, но не столь количественно выраженные изменения зарегистрированы в IIIж, IVж и Вм. По всей вероятности, от рождения до 20-х суток цилиарный транспорт, как функция эпендимоцитов, является ведущим механизмом, обеспечивающим перемещение ликвора по системе ЖГМ. К концу 1-го месяца жизни во всех желудочках и области водопровода мозга зарегистрировано отчетливое снижение показателей цилиарного клиренса (ЧБР, СДЖ) по сравнению с 10-20-ми сутками. В репродуктивном возрасте (4-12 мес) продолжающийся рост ЖГМ и сосудистых сплетений сопровождается стабилизацией транспортной активности эпендимоцитов на уровне 30-50 % от максимальных значений СДЖ в каждом отделе. Возрастная динамика размерных характеристик ЖГМ и показателей цилиарного транспорта эпендимоцитов свидетельствует о снижении вклада эпендимоцитов в обеспечение транспорта СМЖ по системе ЖГМ в связи с формированием более эффективных механизмов быстрой ликвороциркуляции на основе осцилляции стенок и сосудистых сплетений желудочков, обусловленной сердечной деятельностью [3, 14]. Редуцированный по сравнению с 10-20-ми сутками уровень цилиарного клиренса эпендимоцитов у животных репродуктивного возраста продолжает оставаться достаточным для перемешивания ликвора между центральной и пристеночными зонами полости ЖГМ, а также поддержания медленного транспорта СМЖ в пристеночной зоне [12, 14]. При этом эпендимоциты продолжают играть важную роль в регуляции осмолярности ликвора и обеспечении продукции сигнальных молекул, влияющих на процессы нейрогенеза, роста фибробластов и сосудистого эндотелия в тканях стенки ЖГМ [8]. Заключение. В целом, выявленные количественные закономерности отражают морфогенетические процессы последовательного созревания тканевых структур головного мозга, направленные на формирование сбалансированной дефинитивной системы ликвородинамики. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. В. П. Сбор и обработка материала: О. А. Ф., Т. В. К. Статистическая обработка данных: О. А. Ф. Анализ и интерпретация данных: А. В. П., О. А. Ф. Написание текста: А. В. П., О. А. Ф. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. V. Pavlov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: pavlov@ysmu.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000, Russian Federation

O. A. Fokanova

Yaroslavl’ State Medical University

Email: oafokanova-76@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000, Russian Federation

T. V. Korableva

Yaroslavl’ State Medical University

Email: korablevat@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000, Russian Federation

References

Supplementary files