ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕЙРОНОВ ИНТРАМУРАЛЬНЫХ УЗЛОВ ТОЛСТОЙ КИШКИ, СОДЕРЖАЩИХ КАЛЬБИНДИН И КАЛЬРЕТИНИН

Полный текст

Введение. Выделяют большое количество Са-связывающих белков, содержащих в своей структуре от 2 до 6 Са-связывающих центров [8]. К наиболее распространенным в нервной системе, селективно экспрессирующимся в определенных популяциях нейронов, относятся кальбиндин (КБ) массой 28 килодальтон, кальретинин (КР) и парвальбумин (ПБ) [3, 7, 13]. В автономной нервной системе сравнительно большое количество КБ-содержащих нейронов описано в симпатических узлах [3] и метасимпатических интрамуральных узлах кишки [2, 9]. При этом в тонкой и толстой кишке грызунов число КР-иммунореактивных (ИР) нейронов значительно превосходит количество КБ-ИР-нервных клеток [10, 11]. В онтогенезе процентное содержание различных типов кальций-связывающих белков в автономной нервной системе меняется. Показано, что у крыс и кошек в ходе возрастного развития процент КБ-ИР-симпатических нейронов увеличивается с момента рождения до 10-х суток, затем снижается до конца первого месяца жизни [3]. В тонкой кишке процентное содержание КБ-ИР-нейронов возрастает за первые 20 сут жизни, КР-ИР-нейронов - увеличивается в течение 2 мес [3, 9]. Тем не менее, в литературе отсутствуют данные о возрастных изменениях экспрессии КБ и КР в нейронах интрамуральных узлов толстой кишки. Целью настоящего исследования явилось выявление локализации, процентного содержания и морфометрических характеристик КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральных метасимпатических узлах межмышечного (МС) и подслизистого автономных нервных сплетений (ПС) толстой кишки у крыс различных возрастных групп. Материал и методы. Работа выполнена на 30 крысах линии Вистар в возрасте 1, 10, 20, 30, 60 сут и 2 года после рождения (по 5 животных в каждой возрастной группе). Исследование проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На проведение исследования получено разрешение этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (протокол № 29 от 21.02.2019 г.). После введения летальной дозы уретана (3 г/кг внутрибрюшинно) животных перфузировали транскардиально раствором стандартного фоcфатноcолевого буфеpа (PBS, 0,01М, pH 7,4) (БиолоТ, Россия), затем 4 % pаcтвоpом паpафоpмальдегида (Sigma, США) на PBS. Из поперечной ободочной кишки выделяли фрагменты, которые фиксировали в течение 2 ч в указанной смеси, после чего промывали трехкратно в PBS в течение 30 мин и оставляли в 30 % растворе сахарозы на 24 ч. Из фиксированного материала на криостате готовили серии срезов толщиной 14 мкм. Выявление нейронов, содержащих КБ и КР, проводили при помощи меченых антител по методике, описанной нами ранее [9]. Для этого использовали первичные антитела кролика (Abcam, США, разведение 1:500 и 1:100 соответственно), вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом - индокарбоцианином (Cy3, Jackson Immunoresearch, США, разведение 1:100), дающим красную флюоресценцию. Для расчета процента иммуноположительных нейронов, кроме меток к КБ и КР, производили иммуномечение всей нейронной популяции при помощи антител к протеиновому генному продукту 9,5 (ПГП 9,5) [4]. Использовали первичные антитела к ПГП 9,5 от морской свинки (Abcam, США, разведение 1:200), вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC, разведение 1:100, Jackson Immunoresearch, США), дающим зеленую флюоресценцию. Срезы преинкубировали 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10 % сыворотки, 1 % тритон X-100, 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, 0,05 % тимерозола. Затем срезы инкубировали 24 ч с первичными антителами при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали 2 ч с вторичными антителами. После чего срезы отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Гистологические препараты исследовали на флюоресцентном микроскопе Olympus BX43 (Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCDкамерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Для анализа размеров и процентного соотношения иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Долю КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов определяли как их отношение к общему числу ПГП 9,5 ИР-нейронов, которое принимали за 100 %. Морфометрическому исследованию подлежали нервные клетки, срез которых прошел через ядро. Для определения площади сечения нейронов у животных в каждой возрастной группе в случайном порядке брали 100 нейронов, иммуноположительных к каждому из исследованных маркеров. Математическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Sigma Plot (StatSoft, США). Все величины представлены как средняя арифметическая величина ± ошибка средней. Значимость различий средних величин определяли по методикам ANOVA, критериям Вилкоксона и Манна-Уитни. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты исследования. Результаты иммунофлюоресцентного анализа показали, что КБ-ИР-и КР-ИР-нейроны выявляются в межмышечном и подслизистом нервных сплетениях поперечной ободочной кишки у крыс всех возрастных групп от новорожденных до старых. При этом флюоресценция различной степени интенсивности отмечается как в ядре, так и в цитоплазме нейронов (рис. 1, 2). В межмышечном автономном нервном сплетении у новорожденных крысят процент выявленных КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов невелик (табл. 1). У крысят в возрасте 10 сут и старше доля тех и других нейронов значимо больше. У крыс в возрасте 30 сут, 2 мес и 2 года доля КР-ИР-нейронов превосходит таковую КБ-ИР. В подслизистом автономном нервном сплетении у новорожденных крысят КБ не выявляется, но определяется во всех остальных возрастных группах (табл. 2). При этом к моменту рождения подавляющее большинство нейронов сплетения уже содержат КР. Значимо бóльший процент КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов обнаружен лишь у животных в возрасте 2 мес и старше. Анализ данных морфометрического исследования показал, что средняя площадь сечения КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов у новорожденных крысят значимо меньше, чем у крыс остальных возрастных групп (табл. 3). При этом средний размер таких нейронов у крыс в 2-летнем возрасте по сравнению с новорожденными больше, в межмышечном нервном сплетении - более чем вдвое, а в подслизистом - в 1,5 раза. Средняя площадь сечения КБ-ИР-и КР-ИР-клеток значимо превосходит таковую иммуноотрицательных нейронов во всех возрастных группах (p<0,05). При этом значимых различий между средней площадью сечения КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов в каждой возрастной группе не выявлено (p>0,05). Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что за первые 10 сут доля КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов в межмышечном автономном нервном сплетении толстой кишки увеличивается. Это согласуется с аналогичными данными, полученными нами ранее, для межмышечного нервного сплетения тонкой кишки. Как и в тонкой, в толстой кишке процент КБ-ИР-и КР-ИР-нейронов, выявляемых в подслизистом нервном сплетении, выше, чем в межмышечном нервном сплетении [3, 9]. В отличие от существующего представления о формировании подслизистого нервного сплетения у грызунов после 1-й недели жизни [2] в настоящем исследовании мы установили наличие выраженного подслизистого нервного сплетения в толстой кишке уже у новорожденных. Причём в нём выявляется только кальретинин, а кальбиндин определяется лишь с 10-х суток жизни. Полученные в настоящей работе данные подтвердили результаты наших предыдущих исследований о том, что в интрамуральных ганглиях кишки у взрослой крысы почти половина нейронов содержат КБ и КР [2, 3, 9]. Это отличается от динамики содержания указанных кальцийсвязывающих белков в симпатических узлах у крыс, где отмечено максимальное их содержание у новорожденных и 10-суточных животных и снижение в раннем постнатальном онтогенезе [3]. Значение такой гетерохронии остается пока неясным. Вероятно, это связано с важной ролью кальция в возрастных и стресс-индуцированных изменениях нервной системы [6, 12, 15]. Размеры нейронов интрамуральных узлов тонкой и толстой кишки возрастают в постнатальном онтогенезе. Однако средняя площадь сечения нейронов интрамуральных узлов толстой кишки меньше таковой нейронов тонкой кишки [3, 9]. Как и в тонкой, в толстой кишке КБ-ИР-и КР-ИР-нейроны крупнее иммунонегативных клеток [3]. Среди факторов, регулирующих развитие синапсов и их пластичность, большое значение имеет поддержание определенной концентрации ионов кальция, которое может изменяться в пространстве и во времени, и важная роль в этом отводится КБ и КР [8, 14]. В развивающихся нейронах при участии ионов кальция происходит регуляция роста нейронов и морфологической пластичности, в частности конуса роста и развитие дендритов, что совпадает по времени с увеличением содержания кальций-связывающих белков [15]. На более поздних этапах постнатального развития нейронов интрамуральных узлов кальций-связывающие белки играют роль кальциевых сенсоров и участвуют в поддержании уровня кальция в клетках. КБ и КР, связывая кальций, могут регулировать внутриклеточные ответы на физиологические стимулы и защищать клетки от кальций-опосредованной нейротоксичности, а также от процессов апоптоза [5]. В литературе имеются данные о возрастном снижении экспрессии КБ [1], что делает клетки более чувствительными к изменениям концентрации ионов кальция [6]. Однако результаты нашего исследования не подтверждают этого. Напротив, нами показано отсутствие достоверного снижения содержания кальций-связывающих белков в нейронах интрамуральных узлов метасимпатической нервной системы у старых животных. Заключение. Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе происходит увеличение доли КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральных узлах кишки, что противоположно возрастным изменениям содержания кальций-связывающих белков в чувствительных спинномозговых и симпатических узлах. Окончательное созревание нейронов интрамуральных узлов, содержащих различные типы кальцийсвязывающих белков, завершается к концу 1-го месяца жизни. Возрастной инволюции КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов кишки у старых крыс не отмечается. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. Д. Н., П. М. М. Сбор и обработка материала: А. Ф. Б. Статистическая обработка данных: А. Ф. Б. Анализ и интерпретация данных: А. Д. Н., П. М. М. Написание текста: А. Ф. Б. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Антонина Францевна Будник

Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х. М. Бербекова

кафедра анатомии человека 360004, г. Нальчик, ул. Чернышевского, 173

Петр Михайлович Маслюков

Ярославский государственный медицинский университет

Email: mpm@ysmu.ru
кафедра нормальной физиологии с биофизикой 150000, г. Ярославль, ул. Революционнная, 5

Александр Данилович Ноздрачев

Санкт-Петербургский государственный университет

кафедра общей физиологии 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9

Список литературы

Дополнительные файлы