РЕАКЦИЯ ЭНДОКРИНОЦИТОВ ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШКИ КРЫС НА ВВЕДЕНИЕ МЕЛАТОНИНА

Полный текст

Эндокриноциты (ЭнК) эпителия слизистой оболочки органов пищеварительной системы, в частности кишки, вырабатывают большой спектр гормонов и биологически активных веществ [5]. Было показано, что экспериментальное воздействие на организм животного может приводить к морфологическим перестройкам эндокринного аппарата эпителия. При воздействии различных факторов на эпителий слизистой оболочки кишки наблюдается изменение количественного содержания ЭнК. Например, у животных при изменении диеты или голодании, воздействии высокоинтенсивного импульсного магнитного поля или введении декстрансульфата натрия наблюдается увеличение числа эндокриноцитов кишки [1, 3, 6, 7, 9], что свидетельствует о включении компонентов эндокринного аппарата в реакцию эпителия слизистой оболочки органов пищеварения на действующие факторы [3]. Мелатонинсодержащие лекарственные фармакологические препараты используются в медицине для нормализации циклов «сон-бодрствование», а также при лечении заболеваний органов пищеварения [2, 10]. В эксперименте на крысах показано, что разные дозы мелатонина (1-10 или 100-1000 мг/кг) влияют на моторику двенадцатиперстной кишки крыс [8, 12]. Эндокринные ЕС-клетки эпителия слизистой оболочки органов пищеварения, в том числе кишки, в норме вырабатывают мелатонин [5]. Обычно мелатонинсодержащие препараты принимают в течение длительного времени, однако данных в опубликованной литературе о хроническом воздействии (в течение 1 мес) терапевтической дозы и более высоких доз на эндокринный аппарат эпителия слизистой оболочки органов пищеварения в настоящее время нет. Цель настоящего исследования - оценить при помощи гистологических и количественных методик количественное содержание эндокриноцитов в эпителии слизистой оболочки двенадцатиперстной, ободочной и прямой кишки при введении крысам разных доз мелатонина. Материал и методы. Исследование проводилось по типу аналитического на биологических моделях при экспериментальном воздействии на 30 половозрелых крысахсамцах линии Вистар. Протоколы опытов одобрены локальным этическим комитетом СЗГМУ им И. И. Мечникова (протокол № 12 от 10.12.2014 г.) и соответствуют биоэтическим принципам. Все манипуляции выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР), «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ от 2003 г. № 267). Для исследования сформировали 3 группы по 5 крыс в каждой. Препарат «Мелаксен» (раствор мелатонина, МТ) вводили с помощью внутрижелудочного зонда. В 1-й группе исследования мелатонин вводили в течение 1 мес по 1 терапевтической дозе (МТ1), во 2-й группе - в течение 1 мес по 20 терапевтических доз (МТ20), в 3-й группе - однократно по 100 терапевтических доз (МТ100). Одна терапевтическая доза определялась из расчета 0,5 мг/кг массы тела животного. Кратность введения и дозы МТ выбраны исходя из клинических рекомендаций использования данного лекарственного препарата. Стократная доза выбрана для демонстрации негативного воздействия лекарственного препарата (отравления) при суициде. Для каждой группы экспериментальных животных была сформирована группа контроля (всего - 3 группы по 5 крыс), получавшая количество изотонического раствора NaCl, равное по объему изучаемому препарату (15 крыс). На следующие сутки после окончания опыта крыс ингаляционно усыпляли раствором фторотана (0,5 %), затем проводили эвтаназию путем декапитации. Для светооптического исследования забирали образцы двенадцатиперстной, ободочной, прямой кишки (n=90), которые подвергали стандартной гистологической обработке. Изучение материала проводили методами световой микроскопии с последующей морфометрией на гистологических препаратах. Поперечные срезы для обзорного изучения эпителия окрашивали гематоксилином Майера с докраской эозином. Для выявления ЭнК использовали импрегнацию серебром по методам Гримелиуса (для выявления аргирофильных клеток) и Массона-Гамперля в модификации Синга (для выявления аргентаффинных клеток). Также проводили иммуногистохимическое определение ЭнК, продуцирующих серотонин (серотониниммунореактивные клетки (СИР-клетки), используя поликлональные кроличьи антитела против серотонина (1:150, NovoCastra, Великобритания) и вторичные антитела и реагенты - реактивы из набора LSAB2 (DAKO, Дания). В изучаемых образцах определяли количественное содержание аргирофильных, аргентаффинных и серотониниммунореактивных клеток. ЭнК подсчитывали с помощью окулярной морфометрической сетки в 100 полях зрения и относили к 1 мм2 поверхности среза эпителия слизистой оболочки кишки. Использовали микроскоп Биомед 6 (Ломо, Россия); об. 40, ок. 7, окулярную морфометрическую сетку с шагом 10 мкм, увеличением 7 (Ломо, Россия). С помощью морфометрической сетки определяли длину кишечных ворсинок двенадцатиперстной кишки, ширину и высоту складок ободочной кишки, глубину крипт изучаемых отделов кишки. Морфометрические измерения проводили на 5-10 срезах с различных стекол в каждой группе исследования. Статистическая обработка была осуществлена с использованием программного обеспечения Statistica 10.0. Для всех данных была применена описательная статистика (критерий Манна-Уитни). Различия считали значимыми при p<0,05. Результаты исследования. При хроническом (МТ1, МТ20) и остром (МТ100) введении мелатонина у экспериментальных животных были выявлены структурные изменения стенки кишки. В двенадцатиперстной кишке крыс введение препарата приводило к уменьшению высоты кишечных ворсинок (от 29 до 42 % в разных группах исследования). При введении МТ1 она составляла в среднем 238±13,56 мкм, при МТ20 - 204±19,65 мкм, при МТ100 - 248±13,56 мкм, в контрольных группах - 350±21 мкм. Для ободочной кишки у подопытных животных также было характерно уменьшение высоты складок (более чем на 20 % в разных группах исследования): при введении МТ1 - 458±22 мкм, при МТ20 - 188±28,88 мкм, при МТ100 - 426±10,77 мкм, в контроле - 534±28,57 мкм. В прямой кишке наблюдалось увеличение глубины крипт (от 55 до 62 % в разных группах исследования): при введении МТ1 - 9,42±4,78 мкм, при МТ20 - 14,40±1,12 мкм, при МТ100 - 13,8±0,4 мкм, в контроле - 8,88±0,9 мкм. ЭнК располагались в эпителии слизистой оболочки двенадцатиперстной, ободочной и прямой кишки преимущественно в глубине кишечных крипт, а в двенадцатиперстной кишке - в основании кишечных ворсинок. По форме эндокриноциты у подопытных крыс не отличались от ЭнК у контрольных крыс. Общая популяция ЭнК, выявленная в эпителии слизистой оболочки двенадцатиперстной, ободочной и прямой кишки по методу Гримелиуса (аргирофильные клетки, рис. 1), в хронических опытах с введением МТ1 и МТ20 была увеличена по сравнению с контролем на 24-76 % в разных группах исследования. При введении МТ100 в изучаемых отделах кишки отмечалась разная реакция ЭнК на вводимое вещество. В двенадцатиперстной кишке число аргирофильных клеток было уменьшено на 25 %, в эпителии ободочной кишки - сопоставимо с показателями у контрольных крыс, тогда как в прямой кишке число данных клеток было выше контроля на 38 %. Количественное содержание аргентаффинных клеток, вырабатывающих серотонин и мелатонин и выявленных по методу Массона-Гамперля (см. рис. 1), в изучаемых отделах кишки у экспериментальных животных было выше, чем у контрольных особей. При хроническом введении МТ1 и МТ20 было отмечено значимое повышение их относительного содержания от 24 до 48 % по разным отделам кишки. В остром опыте с МТ100 наблюдалась тенденция к увеличению числа аргентаффинных клеток в изучаемых отделах кишки. Исходя из того, что мелатонин тесно связан с серотониновым обменом, и в норме оба гормона вырабатываются ЕС-клетками (аргентаффинные клетки), было проанализировано число серотониниммунореактивных клеток (СИР-клеток, рис. 2) в эпителии у подопытных крыс. У контрольных животных, получавших изотонический раствор NaCl, число серотониниммунореактивных клеток во всех отделах кишки было сопоставимо с числом аргентафинных клеток (см. рис. 1). У подопытных крыс наблюдалось преимущественно значимое повышение числа серотонин-иммунореактивных клеток в изучаемых отделах кишки от 24 до 72 % в различных группах исследования по сравнению с контрольными животными. Исключение составило число СИР-клеток в прямой кишке у крыс, которым ежедневно в течение 1 мес вводили МТ1. У данных животных число клеток было понижено на 17 %. Число СИР-клеток у подопытных крыс было больше числа аргентаффинных клеток в двенадцатиперстной кишке на 45-55 %, в ободочной кишке - на 31-50 %. В прямой кишке подобная закономерность была выражена в остром опыте с МТ100, когда число СИР-клеток было на 73 % больше числа аргентафинных клеток. Кроме того, в остром опыте было отмечено, что СИР-клетки во всех изучаемых отделах кишки составляли значительную долю от общего числа аргирофильных клеток: в двенадцатиперстной кишке - 68 %, в ободочной - 76 %, в прямой - 84 %. В хронических опытах с введением МТ1 и МТ20 выявленная закономерность была также обнаружена, но слабее выражена: в двенадцатиперстной кишке СИР-клетки составляли 60-60,5 % от общего числа ЭнК, в ободочной - 40-52 %, в прямой кишке - 19-24 %. Обсуждение полученных данных. Количественный анализ содержания ЭнК (аргирофильных, аргентаффинных, СИР-клеток) показал, что в большинстве случаев при введении мелатонина наблюдается значимое увеличения их числа. Эти показатели были более выражены в хронических опытах с введением МТ1 и МТ20. По-видимому, в данном случае увеличение количества ЭнК происходит вследствие ежедневного воздействия мелатонина, которое приводит к перестройке работы эндокринного аппарата эпителия кишки. В остром опыте с введением МТ100 данная особенность была менее выражена, что, возможно, связано с тем, что материал был забран на следующие сутки после однократного воздействия, и эндокринный аппарат не успел «перестроиться». Хроническое введение МТ1 и МТ20, вероятно, вызывает перестройку функциональной активности клеток эндокринного аппарата, приводящую к усилению секреции и постепенному «истощению» ЭнК. Продолжение введения мелатонина, по-видимому, стимулирует пролиферацию ЭнК эпителия слизистой оболочки кишки через камбиальную систему, проявляющуюся морфологически в виде увеличения, в том числе аргирофильных, аргентаффинных и СИР-клеток, что мы наблюдали в хронических опытах с введением МТ1 и МТ20. Подобная реакция эндокриноцитов кишки (увеличение количественного содержания) была ранее описана при других видах экспериментального воздействия, таких как голодание [6], диета с избыточно жирной пищей [7], висцеральная гипералгезия [11], воздействие высокоимпульсного магнитного поля [1], введение декстрансульфата натрия [9]. Обнаруженное в исследовании изменение численности ЭнК свидетельствует о реакции эпителия слизистой оболочки кишки и развитии регенераторных процессов в ответ на воздействие (острое или хроническое введение мелатонина). Тогда как уменьшение численного содержания эндокриноцитов (МТ1, прямая кишка) свидетельствует об истощении этих механизмов. При анализе количественного содержания ЭнК, вырабатывающих серотонин (см. рис. 1), определенных серебрением по методу Массона-Гамперля (аргентаффинные клетки) и с применением метода иммуногистохимии (СИР-клетки), было установлено, что у подопытных крыс число СИР-клеток значительно выше числа аргентаффинных клеток. У контрольных животных эти значения были сопоставимы. Возможно, это связано со спецификой реакции серебрения по методу Массона- Гамперля, для прохождения которой требуется достаточное количество вещества, реагирующего с серебром. Иммуногистохимический метод дает возможность добиться более четкой идентификации СИР-клеток в эпителии кишки у крыс [4] и выявляет клетки, содержащие серотонин, на разных стадиях их дифференцировки, с разным содержанием секрета в цитоплазме, в том числе и малодифференцированные клетки, которые методика серебрения не позволяет выявить из-за малого содержания гормона. Для подтверждения высказанных предположений об изменении активности камбиальной системы эпителия и появлении малодифференцированных клеток необходимо провести электронномикроскопическое изучение эпителия слизистой оболочки кишки при введении разных доз препарата. Длительное экспериментальное воздействие на эпителий слизистой оболочки кишки приводит к развитию компенсаторных процессов в ее различных отделах и проявляется в виде структурных изменений: укорочение кишечных ворсинок двенадцатиперстной кишки и складок ободочной кишки, увеличение глубины крипт прямой кишки. Наблюдаемое при введении мелатонина уменьшение длины кишечных ворсинок двенадцатиперстной кишки, по-видимому, приводит к уменьшению всасывательной поверхности, что в совокупности может сопровождаться ускорением транзита химуса, описанного ранее в литературе при введении мелатонина крысам в малых дозах [8, 12]. Таким образом, в опытах при экспериментальном введении разных доз мелатонина была обнаружена реакция эпителия слизистой оболочки двенадцатиперстной, ободочной и прямой кишки на их введение, которая проявляется в виде увеличения числа аргирофильных, аргентаффинных и серотонин-иммунореактивных клеток. Описанные морфологические реакции со стороны стенки кишки были более выражены при хроническом введении препарата, что, возможно, свидетельствует о развитии адаптивной реакции эпителия слизистой оболочки изучаемых отделов кишки. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства Санкт-Петербурга для аспирантов (серия ПСП № 16553). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: М. Л. Ч. Сбор и обработка материала: М. Л. Ч. Статистическая обработка данных: М. Л. Ч. Анализ и интерпретация данных: М. Л. Ч. Написание текста: М. Л. Ч. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Мария Леонидовна Чуркова

Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова

Email: mariya.churkova@szgmu.ru
кафедра медицинской биологии 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47, 9 пав

Список литературы

Дополнительные файлы