METHOD FOR VISUALIZATION OF BRAIN HISTAMINERGIC NEURONS IN HYPOTHALAMUS

Full Text

Гистаминергическая система мозга играет важную роль в регуляции функций нейроэндокринной и сердечно-сосудистой систем организма, процессов сна и бодрствования, терморегуляции, гомеостаза, пищевого и питьевого поведения, памяти и обучения, а также в патогенезе таких заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона, эпилепсия, морфиновая наркомания, алкоголизм и др. [1, 2, 8]. Гистаминергическая система мозга состоит из нейронов, синтезирующих, транспортирующих и выделяющих гистамин, и гистаминовых рецепторов, на которые он воздействует. Тела гистаминергических нейронов (Гн) головного мозга млекопитающих локализуются только в задней гипоталамической области, где образуют пять скоплений - ядер (Е1-Е5) [3]. При этом аксоны гистаминергических нейронов распространяются во все отделы мозга [2]. Для морфофункционального исследования Гн применяются две иммуногистохимические методики: с использованием антител против гистамина [10] и фермента его синтеза гистидиндекарбоксилазы [11, 12]. Нами было предложено использовать в качестве маркёра для выявления Гн активность моноаминооксидазы типа Б (МАО Б), которая является ключевым ферментом метаболизма гистамина в мозгу. Известно, что метаболизм является единственным способом удаления гистамина после завершения нейропередачи Гн, поскольку система обратного захвата гистамина в них отсутствует, в отличие от других типов аминергических нейронов, имеющих специфические транспортёры своих медиаторов для их обратного захвата [7, 9]. Используя разработанную нами гистохимическую методику избирательного определения в мозгу активности МАО Б [4], мы установили, что все Гн гипоталамуса, в отличие от других типов нейронов, имеют высокую активность МАО Б. Другие типы нейронов гипоталамуса МАО Б не содержат. Следовательно, определяя гистохимически в криостатных срезах гипоталамуса активность МАО Б, можно избирательно выявлять гистаминергические нейроны мозга [5, 6]. Недостатками этой методики являются: 1) необходимость заморозки образцов, что часто сопровождается их повреждением; 2) необходимость хранения образцов в жидком азоте, что ограничивает его срок; 3) невозможность использования методики для парафиновых срезов мозга, которые более широко используются в гистологических исследованиях мозга, чем криостатные срезы. Целью настоящего исследования была разработка иммуногистохимической методики выявления гистаминергических нейронов в парафиновых срезах гипоталамуса крыс. Материал и методы. Исследование проведено на 10 беспородных белых крысах-самцах в возрасте 45 и 90 сут. Все опыты выполнены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 30.01.2018 г.). Образцы гипоталамуса замораживали в жидком азоте с помощью криостата CM 1850 (Leica Microsystems Gmbh, Германия), готовили серийные криостатные срезы толщиной 10 мкм, которые обрабатывали гистохимически на выявление активности МАО Б [4-6]. Этот метод выявления Гн был взят в качестве прототипа. Другие кусочки гипоталамуса фиксировали в цинк-этанол-формалине при +4 ºС (на ночь), а затем заключали в парафин. С помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) изготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм и монтировали их на предметные стекла. Срезы инкубировали с 3 % Н2О2 в течение 10 мин для устранения эндогенной активности пероксидазы. Затем промывали в фосфатном буферно-солевом растворе (PBS), рН 7,4, по 2 мин×3. Наносили нормальную козью сыворотку для блокировки неспецифического окрашивания (на 30 мин при 37 ºC). Промывали в PBS, рН 7,4, по 2 мин×3. Затем срезы обрабатывали первичными поликлональными кроличьими антителами против МАО Б (Elabscience, cat.No.EPP15673 (Китай) в разведении 1:100 при +4 ºС, 20 ч, во влажной камере. Промывали в PBS, рН 7,4, 2 мин×3. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью набора детекции (Elabscience cat.No. E-IR-R213 (Китай), нанося поочередно при комнатной температуре Reagent 1: Polymer Helper (20 мин), Reagent 2: Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG (25 мин) и промывали в PBS, рН 7,4, 2 мин×3. Затем добавляли 50 мкл DAB Chromogen в 1 мл DAB Substrate, перемешивали и наносили на срез. Инкубировали 1 мин 20 с. Реакцию прекращали промыванием срезов в PBS, pH 7,4, с последующим обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации, просветлением в ксилоле и заключением в полистирол. Результаты исследования. В полученных иммуногистохимических препаратах гипоталамуса избирательно и четко выявлялись Гн (рисунок). Высокая иммунореактивность МАО Б выявлялась в их цитоплазме, умеренная - в их отростках (нейропиле), а в ядрах нейронов она отсутствовала. Их локализация точно соответствовала Гн, определяемым в криостатных срезах гипоталамуса с помощью гистохимической методики выявления активности МАО Б. Нейроны другой медиаторной природы этой методикой в гипоталамусе не выявлялись. При этом высокую активность и иммунореактивность МАО Б определяли в эпиндимоцитах, выстилающих желудочки мозга, умеренную - в эндотелии кровеносных капилляров мозга. Однако их окраска не мешала выявлению самих Гн в гипоталамусе. В других отделах мозга МАО Б определялась в разных типах нейронов, особенно в серотонинергических нейронах ядер шва моста, в которых МАО Б участвует в метаболизме серотонина. Однако в гипоталамусе МАО Б выявлялась только в Гн. Поскольку тела Гн мозга расположены только в гипоталамусе, это позволяет использовать методику для избирательного выявления этих нейронов в этом отделе промежуточного мозга. Обсуждение полученных данных. Преимуществами предлагаемой иммуногистохимической методики выявления Гн по сравнению с гистохимическим методом на выявление активности МАО Б в криостатных срезах является: 1) более чёткое выявление нейронов (вероятно, из-за использования более тонких срезов и меньшей диффузии продуктов реакции из-за фиксации); 2) возможность использования материала через длительное время после его забора, так как он может храниться неограниченное время в парафиновых блоках; 3) возможность сравнения полученных препаратов с препаратами, окрашенными по Нисслю или при помощи других общепринятых нейрогистологических методик, а также и другими иммуногистохимическими методиками на соседних срезах или при двойном иммуномечении в тех же нейронах. Вместе с тем, следует отметить, что предлагаемая методика позволяет выявлять в гипоталамусе не только Гн, но и танициты и кровеносные капилляры, а в других отделах мозга - и нейроны другой нейромедиаторой природы. Таким образом, предлагаемая иммуногистохимическая методика с учётом указанных ограничений позволяет выявлять гистаминергические нейроны в парафиновых срезах гипоталамуса крысы. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. М. З. Сбор и обработка материала: А. В. З. Статистическая обработка данных: А. В. З. Анализ и интерпретация данных: С. М. З., А. В. З. Написание текста: С. М. З., А. В. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: smzimatkin@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorky St., Grodno 230009, Belarus

A. V. Zaerko

Grodno State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorky St., Grodno 230009, Belarus

References

Supplementary files