MЕТОДИКА ВЫЯВЛЕНИЯ ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА

Полный текст

Гистаминергическая система мозга играет важную роль в регуляции функций нейроэндокринной и сердечно-сосудистой систем организма, процессов сна и бодрствования, терморегуляции, гомеостаза, пищевого и питьевого поведения, памяти и обучения, а также в патогенезе таких заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона, эпилепсия, морфиновая наркомания, алкоголизм и др. [1, 2, 8]. Гистаминергическая система мозга состоит из нейронов, синтезирующих, транспортирующих и выделяющих гистамин, и гистаминовых рецепторов, на которые он воздействует. Тела гистаминергических нейронов (Гн) головного мозга млекопитающих локализуются только в задней гипоталамической области, где образуют пять скоплений - ядер (Е1-Е5) [3]. При этом аксоны гистаминергических нейронов распространяются во все отделы мозга [2]. Для морфофункционального исследования Гн применяются две иммуногистохимические методики: с использованием антител против гистамина [10] и фермента его синтеза гистидиндекарбоксилазы [11, 12]. Нами было предложено использовать в качестве маркёра для выявления Гн активность моноаминооксидазы типа Б (МАО Б), которая является ключевым ферментом метаболизма гистамина в мозгу. Известно, что метаболизм является единственным способом удаления гистамина после завершения нейропередачи Гн, поскольку система обратного захвата гистамина в них отсутствует, в отличие от других типов аминергических нейронов, имеющих специфические транспортёры своих медиаторов для их обратного захвата [7, 9]. Используя разработанную нами гистохимическую методику избирательного определения в мозгу активности МАО Б [4], мы установили, что все Гн гипоталамуса, в отличие от других типов нейронов, имеют высокую активность МАО Б. Другие типы нейронов гипоталамуса МАО Б не содержат. Следовательно, определяя гистохимически в криостатных срезах гипоталамуса активность МАО Б, можно избирательно выявлять гистаминергические нейроны мозга [5, 6]. Недостатками этой методики являются: 1) необходимость заморозки образцов, что часто сопровождается их повреждением; 2) необходимость хранения образцов в жидком азоте, что ограничивает его срок; 3) невозможность использования методики для парафиновых срезов мозга, которые более широко используются в гистологических исследованиях мозга, чем криостатные срезы. Целью настоящего исследования была разработка иммуногистохимической методики выявления гистаминергических нейронов в парафиновых срезах гипоталамуса крыс. Материал и методы. Исследование проведено на 10 беспородных белых крысах-самцах в возрасте 45 и 90 сут. Все опыты выполнены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 30.01.2018 г.). Образцы гипоталамуса замораживали в жидком азоте с помощью криостата CM 1850 (Leica Microsystems Gmbh, Германия), готовили серийные криостатные срезы толщиной 10 мкм, которые обрабатывали гистохимически на выявление активности МАО Б [4-6]. Этот метод выявления Гн был взят в качестве прототипа. Другие кусочки гипоталамуса фиксировали в цинк-этанол-формалине при +4 ºС (на ночь), а затем заключали в парафин. С помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) изготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм и монтировали их на предметные стекла. Срезы инкубировали с 3 % Н2О2 в течение 10 мин для устранения эндогенной активности пероксидазы. Затем промывали в фосфатном буферно-солевом растворе (PBS), рН 7,4, по 2 мин×3. Наносили нормальную козью сыворотку для блокировки неспецифического окрашивания (на 30 мин при 37 ºC). Промывали в PBS, рН 7,4, по 2 мин×3. Затем срезы обрабатывали первичными поликлональными кроличьими антителами против МАО Б (Elabscience, cat.No.EPP15673 (Китай) в разведении 1:100 при +4 ºС, 20 ч, во влажной камере. Промывали в PBS, рН 7,4, 2 мин×3. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью набора детекции (Elabscience cat.No. E-IR-R213 (Китай), нанося поочередно при комнатной температуре Reagent 1: Polymer Helper (20 мин), Reagent 2: Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG (25 мин) и промывали в PBS, рН 7,4, 2 мин×3. Затем добавляли 50 мкл DAB Chromogen в 1 мл DAB Substrate, перемешивали и наносили на срез. Инкубировали 1 мин 20 с. Реакцию прекращали промыванием срезов в PBS, pH 7,4, с последующим обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации, просветлением в ксилоле и заключением в полистирол. Результаты исследования. В полученных иммуногистохимических препаратах гипоталамуса избирательно и четко выявлялись Гн (рисунок). Высокая иммунореактивность МАО Б выявлялась в их цитоплазме, умеренная - в их отростках (нейропиле), а в ядрах нейронов она отсутствовала. Их локализация точно соответствовала Гн, определяемым в криостатных срезах гипоталамуса с помощью гистохимической методики выявления активности МАО Б. Нейроны другой медиаторной природы этой методикой в гипоталамусе не выявлялись. При этом высокую активность и иммунореактивность МАО Б определяли в эпиндимоцитах, выстилающих желудочки мозга, умеренную - в эндотелии кровеносных капилляров мозга. Однако их окраска не мешала выявлению самих Гн в гипоталамусе. В других отделах мозга МАО Б определялась в разных типах нейронов, особенно в серотонинергических нейронах ядер шва моста, в которых МАО Б участвует в метаболизме серотонина. Однако в гипоталамусе МАО Б выявлялась только в Гн. Поскольку тела Гн мозга расположены только в гипоталамусе, это позволяет использовать методику для избирательного выявления этих нейронов в этом отделе промежуточного мозга. Обсуждение полученных данных. Преимуществами предлагаемой иммуногистохимической методики выявления Гн по сравнению с гистохимическим методом на выявление активности МАО Б в криостатных срезах является: 1) более чёткое выявление нейронов (вероятно, из-за использования более тонких срезов и меньшей диффузии продуктов реакции из-за фиксации); 2) возможность использования материала через длительное время после его забора, так как он может храниться неограниченное время в парафиновых блоках; 3) возможность сравнения полученных препаратов с препаратами, окрашенными по Нисслю или при помощи других общепринятых нейрогистологических методик, а также и другими иммуногистохимическими методиками на соседних срезах или при двойном иммуномечении в тех же нейронах. Вместе с тем, следует отметить, что предлагаемая методика позволяет выявлять в гипоталамусе не только Гн, но и танициты и кровеносные капилляры, а в других отделах мозга - и нейроны другой нейромедиаторой природы. Таким образом, предлагаемая иммуногистохимическая методика с учётом указанных ограничений позволяет выявлять гистаминергические нейроны в парафиновых срезах гипоталамуса крысы. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. М. З. Сбор и обработка материала: А. В. З. Статистическая обработка данных: А. В. З. Анализ и интерпретация данных: С. М. З., А. В. З. Написание текста: С. М. З., А. В. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Сергей Михайлович Зиматкин

Гродненский государственный медицинский университет

Email: smzimatkin@mail.ru
кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии 230009, Беларусь, г. Гродно, ул. Горького, 80

Анастасия Викторовна Заерко

Гродненский государственный медицинский университет

кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии 230009, Беларусь, г. Гродно, ул. Горького, 80

Список литературы

Дополнительные файлы