Моноаминоксидаза Б в развивающихся гистаминергических нейронах мозга крысы

Полный текст

Гистаминергические нейроны мозга играют важную роль в регуляции многих функций, систем и реакций организма: нейроэндокринной и сердечно-сосудистой, кровотока мозга, температуры тела, сна и бодрствования, пищевого и питьевого поведения, памяти и обучения, а также в патогенезе многих патологических состояний и заболеваний [1–5]. В головном мозге гистамин выполняет функции нейромедиатора и локализуется главным образом в гистаминергических нейронах; небольшое количество гистамина находится в тучных клетках оболочек мозга и прослоек рыхлой соединительной ткани [2, 4]. Тела гистаминергических нейронов мозга млекопитающих локализуются только в заднем гипоталамусе, где образуют пять скоплений – ядер (Е1-Е5) [1, 6]. При этом аксоны гистаминергических нейронов распространяются во все отделы мозга, где могут координировать другие нейронные системы [7–9].

Моноаминоксидаза типа Б (МАО Б) является ключевым ферментом метаболизма гистамина в мозге, где отсутствует гистаминоксидаза (гистаминаза), окисляющая до 40% гистамина на периферии. Метаболизм – единственный способ удаления гистамина после завершения нейропередачи гистаминергическими нейронами мозга, поскольку система обратного захвата гистамина в них отсутствует, в отличие от других типов аминергических нейронов, имеющих специфические транспортёры своих медиаторов для их обратного захвата [1, 5]. Гистамин метаболизируется ферментом гистамин-N-метилтрансферазой до теле-метилгистамина, который затем превращается с помощью МАО Б (окислительное дезаминирование) в N-теле-метилимидазолацетальдегид. Установлено, что все гистаминергические нейроны гипоталамуса, в отличие от других типов нейронов, имеют высокую активность МАО Б [1]. Другие типы нейронов гипоталамуса МАО Б не содержат, что послужило основанием для разработки нами гистохимического и иммуногистохимического методов выявления гистаминергических нейронов гипоталамуса, соответственно, в криостатных и парафиновых срезах [1, 10]. Представляло интерес сочетанное применение этих двух методов для параллельного выявления содержания ферментного белка и активности МАО Б для оценки становления специфического, медиаторного метаболизма в развивающихся гистаминергических нейронах мозга крысы.

Цель. Параллельная оценка активности и иммунореактивности МАО Б в гистаминергических нейронах гипоталамуса крыс в динамике постнатального онтогенеза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Опыты выполнены на 12 самках беспородных белых крыс с начальной массой 230±20 г и их потомстве (всего 45 крысят). Все опыты проведены с учётом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол №1 от 30.01.2018). Декапитация крысят осуществлялась на 5-е, 10-е, 20-е, 45-е и 90-е сут после рождения. При этом быстро извлекали головной мозг, вырезали гипоталамус и замораживали его в жидком азоте. С помощью криостата CM 1850 (Leica Microsystems Gmbh, Германия) готовили серийные криостатные срезы толщиной 12 мкм, которые обрабатывали гистохимически на выявление активности МАО Б [Зиматкин С.М., 2015]. Другие кусочки гипоталамуса фиксировали в цинк-этанол-формалине при +4 ºС (на ночь), а затем заключали в парафин. С помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) изготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм и монтировали их на предметные стёкла. Затем их обрабатывали первичными поликлональными кроличьими антителами против МАО Б (Elabscience, cat.No.EPP15673, Китай) в разведении 1:100, при +4 ºС, 20 ч, во влажной камере. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью набора детекции (Elabscience cat.No. E-IR-R213, Китай). Гистологические и гистохимические препараты изучали, фотографировали и анализировали с помощью микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), встроенной цифровой видеокамеры Leica (DFC 320, Германия) при увеличении объектива микроскопа ×40, а также программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). Полученные данные обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test). Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (p <0,05, где р – критическое значение уровня значимости).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При гистохимическом исследовании установлено, что активность маркерного фермента гистаминергических нейронов гипоталамуса МАО Б на 5-е сут после рождения не выявляется, на 10-е сут она очень низка, а затем прогрессивно нарастает, становясь на 90-е сут в 6 раз выше 10-суточной. Аналогичные данные получены и при иммуногистохимическом исследовании: с 10-х по 90-е сут постнатального развития иммунореактивность МАО Б в гистаминергических нейронах возрастает в 4 раза (рис. 1, 2).

 

Рис. 1. МАО Б в гистаминергических нейронах ядра Е2 гипоталамуса крыс в постнатальном онтогенезе: (a, c, e – гистохимический метод выявления активности МАО Б (по Зиматкину, Цыдику); b, d, f – иммуногистохимический метод выявления белка МАО Б (по Зиматкину, Заерко); a, b – 10-е сут, c, d – 20-е сут; e, f – 90-е сут постнатального развития. Цифровая микрофотография. Ув. 400)

 

Рис. 2. Активность и иммунореактивность МАО Б в гистаминергических нейронах ядра Е2 гипоталамуса крыс в динамике постнатального онтогенеза. Оптическая плотность цитоплазмы нейронов при гистохимическом и иммуногистохимическом методе выявления МАО Б. * р <0,05 при сравнении каждого срока с предыдущим

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами данные согласуются с результатами Leung и др. (1993), которые измеряли различия в региональной активности MAO A и MAO Б во время постнатального развития у крыс линии Вистар и установили, что активность MAO Б в гипоталамусе, полосатом теле, среднем мозге и коре больших полушарий была низкой на 5-й день, а затем, по мере развития мозга, заметно возрастала [11]. Таким образом, МАО Б, фермент метаболизма гистамина и маркер гистаминергических нейронов, на 5-е сут постнатального развития не выявляется, что может свидетельствовать о низком окислительном дезаминировании гистамина в исследуемых нейронах. Однако в это время в головном мозге наблюдается пик концентрации гистамина [12], который объясняется резким увеличением числа тучных клеток [5, 13] в промежуточном парусе между развивающимися таламусом и гиппокампом [13]. Роль гистамина мастоцитов в головном мозге неясна, хотя в раннем постнатальном онтогенезе эти клетки ответственны за формирование значительной части общего пула данного биогенного амина в мозге [5]. Общее содержание гистамина, вырабатываемого тучными клетками, в возрасте примерно 2 нед. постнатального развития постепенно снижается до уровня, характерного для взрослых особей. Снижение синтеза гистамина в тучных клетках обусловлено созреванием гистаминергических нейронов туберомаммиллярной области, которые также начинают его вырабатывать [14]. Это согласуется с нашими данными о прогрессивном нарастании в этих нейронах МАО Б в период с 10-х по 90-е сут постнатального развития крысы. Это отражает становление медиаторной активности развивающихся гистаминергических нейронов мозга. Синхронность постнатального развития активности и иммунореактивности МАО Б в гистаминергических нейронах мозга свидетельствует о параллельном накоплении в нейронах белка МАО Б и росте его ферментативной активности. При наличии разработанных гистохимических и иммуногистохимических методов такой подход можно использовать и при исследованиях других ферментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С 5-х по 90-е сут постнатального онтогенеза в цитоплазме гистаминергических нейронов гипоталамуса крысы параллельно нарастает активность и иммунореактивность фермента окислительного дезаминирования гистамина МАО Б, что отражает становление в них специфического, медиаторного метаболизма.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования: Зиматкин С.М. Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных: Заерко А.В. Анализ и интерпретация данных, написание текста: Зиматкин С.М., Заерко А.В.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. Research concept and design: Zimatkin S.M. Collection and processing of material, statistical processing of data: Zaerko A.V. Data analysis and interpretation, text writing: Zimatkin S.M., Zaerko A.V.

Об авторах

Сергей Михайлович Зиматкин

Гродненский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: smzimatkin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5728-2588
SPIN-код: 3592-5636

д. биол. н., проф.

Белоруссия, Гродно

Анастасия Викторовна Заерко

Гродненский государственный медицинский университет

Email: wersall_91@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6155-040X
Белоруссия, Гродно

Список литературы

Дополнительные файлы