Effect of experimental diabetes mellitus of the mother on the morphological characteristics of spermatogenesis of the offspring

Full Text

Актуальность настоящего исследования обусловлена распространённостью мужского фактора в структуре бесплодного брака, что диктует необходимость тщательного изучения данной проблемы. Согласно современным представлениям, снижение фертильности у мужчин связано с возрастающим действием на мужской организм многочисленных экзогенных и эндогенных факторов [1]. В то же время на сегодняшний день уделяется особое внимание роли пренатального стресса в нарушении структурно-функционального становления систем жизнеобеспечения плода [2]. Одним из факторов, обусловливающих развитие пренатального стресса, являются экстрагенитальные заболевания. Среди них особое место, в силу своей распространённости, занимает сахарный диабет 1 типа [3]. По данным ВОЗ, сахарный диабет в настоящее время является актуальной проблемой современной медицины, что обусловлено тяжестью и частотой этого заболевания [4, 5]. Только за последние 20 лет число больных сахарным диабетом 1 типа увеличилось почти в 3 раза. При этом эксперты Всемирной диабетической ассоциации прогнозируют, что число больных сахарным диабетом к 2030 г. увеличится в 1,5 раза, в том числе среди женщин фертильного возраста [6].

В отечественной и зарубежной литературе в настоящее время имеются многочисленные работы, касающиеся влияния сахарного диабета на мужскую репродуктивную систему. В то же время работы, посвящённые изучению влияния сахарного диабета матери на морфофункциональное состояние мужской репродуктивной системы потомства в условиях клиники и эксперимента, немногочисленны и имеют подчас противоречивый характер. Так, Jelodar G. с соавт. (2009 г.) установили, что у половозрелого потомства самок крыс с экспериментальным диабетом имеет место увеличение массы яичек, сопровождающееся увеличением числа извитых семенных канальцев и их диаметра, а также снижением числа клеток Лейдига, клеток Сертоли и сперматогоний на фоне повышения концентрации глюкозы крови [7]. Amorim E.M. с соавт. (2011 г.) выявили снижение массы семенников потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом, снижение концентрации сперматозоидов и их двигательной активности, протекающие на фоне гипогликемии [8]. Заслуживает внимание исследование Ge Z.J. с соавт. (2014 г.), показавшего, что у потомства самок мышей с экспериментальным диабетом имеет место повышенный уровень метилирования ДНК у сперматозоидов [9].

В связи с этим цель настоящего исследования – анализ морфофункционального состояния сперматогенного эпителия у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проведены на белых лабораторных крысах Вистар (самках) и их 70-дневном потомстве. Для достижения поставленной цели у взрослых половозрелых самок моделировали сахарный диабет 1 типа. Воспроизводство сахарного диабета осуществлялось по общепринятой методике с помощью стрептозотоцина (Streptozotocin; MP Biomedicals, LLC; USA), который вводился животным внутрибрюшинно трижды с интервалом 7 дней (по 2,5 мг на 100 г массы в 1-ю и 3-ю нед и 2 мг на 100 г массы во 2-ю нед) [10]. Всего за весь курс 10 лабораторных животных с массой от 230 до 256 г получали по 17 мг стрептозотоцина, под влиянием которого у лабораторных животных развивался сахарный диабет, о чём свидетельствовал постоянный повышенный уровень содержания сахара в крови (32,56±2,44 ммоль/л), который сохранялся на протяжении как минимум 3 мес. Подсадка к интактным самцам для спаривания проводилась через 1 нед после последнего введения стрептозотоцина. В результате рождались подопытные крысята, эту группу составили 10 крысят из 10 помётов. Контрольную группу составили 11 крысят из 10 помётов.

Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», приказ №755 от 12.08.77 (МЗ СССР). Выведение лабораторных животных из эксперимента проводилось путём декапитации под эфирным наркозом. Протокол заседания этического комитета ФГБОУ ВО «ЮУГМУ Минздрава» № 8 от 11.11.2018.

На серийных гистологических препаратах семенников, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью морфометрической установки (Motic BA400, Германия) проводилось определение площади паренхимы и стромы (межканальцевой соединительной ткани) семенников у лабораторных животных интактной и опытной групп. Оценку числа и площади семенных извитых канальцев, суммарного содержания сперматогенных клеток и их субпопуляционного состава [11], а также количества сустентоцитов из расчёта на один извитой семенной каналец проводили по общепринятой методике [12, 13]. Цитологический анализ клеток сперматогенного эпителия производился при увеличении 400 (окуляр × 10; объектив × 40).

Кроме того, для оценки более тонких нарушений сперматогенного цикла экспериментальных животных проводилось определение ряда общепринятых индексов, в том числе индекса сперматогенеза (отношение числа слоёв сперматогенного эпителия к числу подсчитанных канальцев), индекса релаксации сперматогенеза (индекс напряжённости сперматогенеза, клеточный индекс) (отношение суммарного содержания зародышевых клеток различных типов, в том числе сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов, к числу сустентоцитов) и герминативного индекса (отношение числа сперматогоний к числу сустентоцитов) [13].

Полученные результаты были статистически обработаны на компьютере с использованием программы Statistica v.6 («Statistica Inc.») и представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки. Учитывая небольшую выборку животных, значимость полученных результатов определялась при помощи ннепараметрического U-критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными изменения считали при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом площадь паренхимы семенника уменьшалась, а площадь стромы увеличивалась по сравнению с контролем (табл. 1). При этом у подопытных крысят увеличивалось число семенных извитых канальцев в единице площади на срезе и уменьшалась площадь поперечного среза семенного извитого канальца.

 

Таблица 1. Морфометрические показатели семенников экспериментальных животных (M±m) / Table 1. Morphometric parameters of the testes of experimental animals (M±m)

Параметры	Контроль	Опыт
Площадь паренхимы, мкм2	520216±6098	488418±7131*
Площадь стромы, мкм2	73084±6098	104882±7131*
Количество семенных извитых канальцев	7,91±0,19	8,86±0,16*
Площадь поперечного среза семенного извитого канальца, мкм2	57775±1327	50603±585*

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (p <0,05).

 

Наибольший интерес представляют данные цитологического анализа сперматогенного эпителия (из расчёта на один извитой семенной каналец) потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Полученные результаты отражены в табл. 2. Показано, что у подопытных животных снижалось суммарное содержание сперматогенных клеток и изменялся их субпопуляционный состав. Так, у подопытных крысят уменьшалось суммарное количество сперматогоний. При этом значимых различий в содержании сперматогоний ранней степени зрелости (сперматогонии А) у интактной и опытной групп нам выявить не удалось, а содержание сперматогоний промежуточной (сперматогонии П) и конечной стадии зрелости (сперматогонии В) уменьшалось по сравнению с интактной группой. Вместе с тем у подопытных животных уменьшалось суммарное содержание сперматоцитов 1 и 2 порядка и сперматид, включая молодые и зрелые формы. Как следствие, уменьшалось содержание сперматозоидов. Выявленные изменения обусловили уменьшение индекса сперматогенеза у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом по сравнению с интактными животными. Исследование содержания у животных интактной и опытной групп сустентоцитов не выявило существенных различий (22,06±0,61 и 22,14±0,6 соответственно). Однако анализ величины герминативного индекса и индекса релаксации сперматогенеза позволил установить значимое уменьшение этих показателей у подопытных животных по сравнению с контролем (табл. 2).

 

Таблица 2. Характеристика сперматогенного эпителия экспериментальных животных из расчёта на один извитой семенной каналец (M±m) / Table 2. Characteristics of the spermatogenic epithelium of experimental animals per one convoluted seminiferous tubule (M±m)

Параметры	Контроль	Опыт
Сперматогенные клетки	501,8±7,7	334±6,3*
Сперматогонии (общ.)	56,4±1,3	50,4±0,8*
Сперматогонии, %	11,2±0,2%	15,2±0,4%*
Сперматогонии А	12,04±0,57	13,7±0,62
Сперматогонии П	4,46±0,24	3,56±0,12*
Сперматогонии В	39,9±0,96	33,17±0,86*
Сперматоциты	93,5±1,6	73,6±3,2*
Сперматоциты, %	18,7±0,4%	22,1±0,9%*
Сперматиды (общ.)	199±6,9	119±5,5*
Сперматиды, %	39,6±1,1%	35,5±1,2%*
Ранние сперматиды	138,6±4,9	82,9±4,2*
Поздние сперматиды	60,4±4,4	36,1±2,9*
Сперматозоиды	152,8±4,7	91±5,2*
Сперматозоиды, %	30,5±0,9%	27,2±1,5%
Индекс сперматогенеза	3,87±0,02	3,59±0,04*
Герминативный индекс	2,56*	2,28*
Индекс релаксации сперматогенеза	22,3*	15,1*

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (p <0,05).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ полученных результатов позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом имеет место нарушение сперматогенного цикла, что находит своё проявление в уменьшении содержания клеток сперматогенного эпителия, что в конечном итоге обусловливает снижение суммарного содержания сперматозоидов.

В то же время на сегодняшний день уделяется особое внимание роли пренатального стресса, одними из патогенетических факторов которого являются экстрагенитальные заболевания, в том числе сахарный диабет, в нарушении структурно-функционального становления систем жизнеобеспечения плода.

Так установлено, что пренатальный стресс может обусловить у потомства комплекс разнообразных микро- и ультраструктурных морфологических, нейрохимических, эндокринных, метаболических изменений, которые могут вызывать не только тератогенные действия, но и микроструктурные и функциональные нарушения у потомства. При этом они могут закрепляться и оказывать продолжительное или перманентное влияние в течение всей его последующей жизни (явление внутриутробного программирования болезней) [2]. При этом пренатальный стресс вызывает долговременные нарушения у потомства, прежде всего в системе нейроэндокринной регуляции репродукции и гормональной адаптации, что может оказать существенное влияние на становление сперматогенеза [2]. Ведущими патогенетическими элементами, обусловливающими развитие пренатального стресса при сахарном диабете матери, являются гиперглюкоземия и гиперкетонемия.

Согласно данным литературы, при гипергликемии матери, обусловленной экспериментальным сахарным диабетом, глюкоза, в избытке проникая через плаценту в кровь плода [14], вызывает гиперплазию бета-клеточного аппарата поджелудочной железы. Развивающийся гиперинсулинизм плода в конечном итоге приводит к развитию гипогликемии, являющейся одним из наиболее серьёзных осложнений антенатального периода, обусловливающим нарушения процессов гистогенеза, в том числе пролиферации и дифференцировки тканевых элементов семенников.

Вместе с тем известно, что сустентоциты (клетки Сертоли) выполняют не только поддерживающую функцию по отношению к клеткам сперматогенного эпителия, но и участвуют в эндокринной регуляции сперматогенеза [15]. В частности, сустентоциты секретируют целый ряд пептидов, действующих на клетки Лейдига, в том числе ингибин и активин, увеличивающие экспрессию рецепторов лютеинизирующего гормона на клетках Лейдига и тем самым индуцирующие процессы стероидогенеза [16]. Под влиянием фолликулостимулирующего гормона гипофиза сустентоциты синтезируют андрогенсвязывающий белок, который обеспечивает транспорт половых гормонов к сперматогенным клеткам. Таким образом, сустентоциты, являясь важным и специфическим компонентом микроокружения, активно участвуют в регуляции сперматогенеза [17].

Нами у подопытных животных установлено снижение как индекса релаксации сперматогенеза, представляющего собой отношение суммарного содержания сперматогенных клеток к числу сустентоцитов, так и герминативного индекса, отражающего отношение числа сперматогоний к суммарному содержанию сустентоцитов. Исходя из этого, нельзя исключить, что одной из причин нарушения сперматогенного цикла у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом I типа является депрессия функционального состояния сустентоцитов.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что экспериментальный сахарный диабет матери обусловливает нарушение генеративной функции яичек у половозрелого потомства, что проявляется снижением содержания сперматозоидов, а также уменьшением субпопуляционного состава сперматогенных клеток.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ/ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования: Брюхин Г.В. Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, анализ и интерпретация данных, написание текста: Брюхин Г.В., Антонов С.Д.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. Bryukhin G.V. created the concept and design of the study. Bryukhin G.V. and Antonov S.D. collected and processed the material, performed statistical data processing, analyzed and interpreted the data and wrote the text.

About the authors

Gennady V. Bryukhin

South-Ural State Medical University

Email: bgenvas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3898-766X
SPIN-code: 7691-8383

Dr. Sci. (Med), Professor

Russian Federation, 64, Vorovskogo Street, Chelyabinsk, Chelyabinsk Region, Ural Federal District, 454092

Sergey D. Antonov

South-Ural State Medical University

Author for correspondence.
Email: s.d.antonov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3166-5270
SPIN-code: 1877-6037

aspirant

Russian Federation, 64, Vorovskogo Street, Chelyabinsk, Chelyabinsk Region, Ural Federal District, 454092

References

Supplementary files