МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРОЗА СОСУДИСТО-МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА

Полный текст

Остеоартроз (ОА) представляет собой самую частую патологию костно-мышечной системы [12]. Болезнь начинается с доклинических невизуализируемых обычными методами изменений в суставе. У людей патология сердечнососудистой системы и ожирение являются самыми распространёнными коморбидными заболеваниями, наблюдаемыми при ОА [2]. ОА усугубляет течение артериальной гипертонии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности (ХСН) [14] и сам интенсивнее прогрессирует на их фоне. Ранее была изучена реорганизация тканей коленного сустава у крыс в условиях экспериментальной ХСН [6] и обнаружены признаки их начального поражения. Ожирение - самый весомый модифицируемый фактор риска ОА, в то же время их взаимосвязи весьма неоднозначны [5, 13]. Попытка получить гонартроз с помощью удаления гена лептина и развития ожирения не увенчалась успехом [15]. Цель данного исследования - выявить особенности структурно-функциональных изменений синовиальной мембраны (СМ) и суставного хряща (СХ) коленного сустава у крыс с экспериментальной ХСН в сочетании с ожирением. Материал и методы. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Оренбургского государственного медицинского университета (выписка из протокола № 150) и выполнено на базе гистологической лаборатории кафедры патологической анатомии. Из 15 самцов крыс линии Вистар в возрасте 8 мес 1-ю (контрольную) группу составили 5, находившихся на стандартном режиме вивария (свободный доступ к пище и воде, 12-часовой световой день, средняя температура воздуха около 21 °C). Остальным 10 крысам ежедневно в течение 2 нед делали подкожные инъекции 0,1 мл 1% раствора фенилэфрина гидрохлорида (Мезатон, Украина) с последующим плаванием в течение 20 мин в резервуаре с водой. Данный метод используется для воспроизведения ХСН [4]. Затем 5 животных (2-я группа) сразу были выведены из эксперимента передозировкой эфирного наркоза, а у 5 животных 3-й группы воспроизводили ожирение. Для этого крысы были помещены в тесные клетки, симулирующие гиподинамию современного человека, и в течение 2 мес находились на высококалорийной многокомпонентной диете, включавшей пшено (21%), сдобу (30%), жареный на растительном масле картофель (20%), сырое свиное сало (12%), шоколад (4%), фундук (4%), печенье (5%), подсолнечную халву (4%), 20% раствор фруктозы вместо воды «по требованию» (итого белки - 9,61%, жиры - 31,87%, углеводы - 58,52%). Животных взвешивали в 1-, 30-е и 60-е сутки пребывания на диете, определяли общий и удельный прирост массы тела для подтверждения факта развития ожирения. Оба коленных сустава от каждой крысы были осмотрены для определения деформации, отёка, гиперемии, отсепарированы от кожи и прилегающих мышц. У одного из них вскрывали суставную полость для макроскопической оценки его тканей, 2-й - оставался неповрежденным, весь материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. После декальцинации и стандартной гистологической проводки делали серийные срезы толщиной 5-6 мкм в сагиттальной плоскости. Были изучены: ареолярный тип СМ в передних и боковых областях суставной капсулы коленных суставов, СХ проксимального эпифиза большеберцовой кости (латеральный и медиальный мыщелки). Для обзорной микроскопии парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера - эозином [7]. Гликозаминогликаны определяли окрашиванием 0,5% толуидиновым синим при рН 7,4; 4,7 с проведением контроля (обработка гиалуронидазой). На парафиновых срезах, помещённых на стекла Super frost plus, с помощью набора реактивов моноклональных антител для иммуногистохимии (BioGenex, США) идентифицировали ключевой белок хрящевой ткани коллаген II типа, выявляли экспрессию маркера апоптоза каспазы-3 и маркера деградации межклеточного вещества матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9). Оценивали 100 полей зрения от каждого исследуемого объекта. Степень экспрессии коллагена II типа и ММР-9 оценивали визуально по балльной системе от 1 до 4, количество клеток, экспрессирующих каспазу-3, подсчитывали и определяли их относительное содержание. С помощью окулярного микрометра МОВ-1-15х при увеличении 300 измеряли толщину СХ и его зон в нагружаемой части сустава [1]. Используя окулярную сетку-вставку, подсчитывали объёмную плотность (ОП) сосудов микроциркуляторного русла СМ [1]. Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета программ MS Exсel 2007 и Statistica 6.6 for Windows. Производили подсчет среднеарифметических значений абсолютных и относительных величин, ошибок средних величин и стандартных отклонений. Значимость различий определяли по t-критерию Стьюдента. Критическим уровнем значимости считали p<0,05%. Результаты исследования. Макроскопические суставные структуры у животных подопытных групп не отличались от таковых в контроле: внешне суставы не были деформированы, отёчны, гиперемированы, СХ имел голубовато-белый цвет и ровную поверхность. При микроскопической оценке состояния тканей суставов в подопытных группах изменения СХ определялись в центральной (наиболее нагружаемой) зоне медиального мыщелка большеберцовой кости, не нагружаемые отделы не были изменены. При микроскопическом исследовании СМ ареолярного типа у контрольных 8-месячных животных видна синовиальная интима, состоящая из 2-3 рядов синовиоцитов и основного вещества, за ней следовали упорядоченный субинтимальный фиброваскулярный слой и волокнистый слой суставной капсулы. ОП сосудов микроциркуляторного русла в данной группе оказалась наибольшей по сравнению с таковой в других группах (таблица). Периваскулярная инфильтрация лимфоцитами и мононуклеарами, гиперплазия ворсин СМ отсутствовала. СХ у крыс данной группы соответствовал общим закономерностям строения гиалинового хряща. Уплощенные хондроциты поверхностной зоны располагались в 1-2 ряда, в промежуточной зоне они имели округлую форму и образовывали изогенные группы, в глубокой зоне находились гипертрофированные хондроциты, определялись участки хряща с пустыми лакунами. Разволокнение матрикса отсутствовало, пограничная линия была чёткой и непрерывной. При окрашивании толуидиновым синим интенсивность метахромазии была равномерной во всей толще СХ за исключением поверхностной зоны нагружаемых участков, где наблюдалось её снижение. При предварительной обработке препарата гиалуронидазой она отсутствовала, что позволяет предположить, что гиалуроновая кислота была основным субстратом, обеспечивавшим метахромазию в СХ. В СМ у животных с ХСН имелись участки с признаками фиброза и воспалительной лимфомакрофагальной инфильтрацией. Поверхность СХ была неровной, содержала вакуолизированные хондроциты, местами были обнаружены единичные эрозии (рис. 1). Клетки промежуточной и глубокой зон образовывали изогенные группы, включающие до 6 хондроцитов и чередующиеся с бесклеточными участками хряща. Многие клетки имели нечёткие, пикнотические ядра. Пограничная линия была прерывистой, наблюдались разволокнение межклеточного вещества и его неравномерная умеренная метахромазия. При исследовании коленных суставов крыс с ХСН и коморбидным ожирением было отмечено преобладание жирового и фиброзного типов СМ, наименьший показатель её васкуляризации, у большинства крыс - воспалительная инфильтрация лимфоцитами, макрофагами. Выявлено значительное уменьшение клеточной популяции СХ, множество пустых лакун, имелись участки с хаотичной ориентацией волокон матрикса. Поверхностная зона СХ преимущественно отсутствовала, определялись множество фиссур, местами проникающих в промежуточную зону до кальцифицированного хряща, пограничная линия удваивалась либо фрагментировалась (рис. 2). Глубокая зона СХ подвергалась оссификации. Имелось резкое усиление интенсивности метахромазии по всей толще СХ. При предварительной обработке гиалуронидазой она сохранялась. Иммуногистохимическое исследование (см. таблицу) выявило неодинаковые показатели экспрессии ММР-9, каспазы-3 и коллагена II типа в исследуемых группах. По сравнению с контролем в СМ коленных суставов у крыс подопытных групп отмечено увеличение экспрессии ММР-9 покровными синовиоцитами, наиболее выраженное у животных с сопутствующим ожирением. По сравнению с контрольной группой у животных в группе с ХСН содержание коллагена II типа значительно уменьшилось (рис. 3) и было наименьшим в группе с ХСН и ожирением (см. таблицу). Наименьшие показатели экспрессии каспазы-3 в СМ и СХ обнаружены у контрольных крыс (см. таблицу), наибольшие - у животных с сочетанием ХСН и ожирения (рис. 4). Обсуждение полученных данных. Отсутствие макроскопических изменений коленных суставов у крыс с изолированной ХСН и в сочетании с ожирением можно объяснить начальными стадиями ОА, его нетравматическим генезом. Микроскопические изменения суставных структур у крыс подопытных групп характеризовались признаками дегенеративной направленности. Наиболее выраженная комплексная дегенеративно-воспалительная реорганизация тканей была обнаружена в группе животных с сочетанием ХСН и ожирения. Полученные в эксперименте данные согласуются с результатами работ по моделированию ОА. У животных 8 мес по сравнению с 4-месячными крысами при одном и том же способе воспроизведения ХСН [6] отмечены более выраженные признаки поражения суставов, отсутствовал компенсаторный гиперсинтез коллагена II типа. Сходные изменения (растрескивание поверхности СХ, разволокнение, уменьшенное содержание протеогликанов, активация апоптоза) обнаружены при изучении СХ в условиях эндогенной интоксикации и трактовались авторами как умеренно выраженный ОА [8]. Повышенный показатель запрограммированной клеточной гибели среди хондроцитов согласуется с результатами исследования формирования системного стероидного артроза [3], при котором в состоянии апоптоза находятся 50-70% клеток. При моделировании ОА оперативными методами, внутрисуставными вмешательствами [10, 11] у животных наблюдались грубые посттравматические изменения со значительной деформацией подлежащей кости, остеофитозом и резким истончением СХ, соответствующие поздним стадиям ОА. Наше исследование не предполагало их получение, так как именно начальные потенциально обратимые стадии заболевания находятся в фокусе внимания современных исследователей. В настоящее время [16] используется термин «ранний» ОА, который имеет чёткие гистологические критерии (I-III степени поражения СХ по классификации Международного общества по исследованию остеоартроза OARSI [17]). Судя по совокупности морфологических признаков, можно заключить, что в группе крыс с сочетанием ХСН и ожирения нами был получен ранний ОА с поражением СХ, соответствующим II-III степени II стадии по классификации OARSI. Таким образом, ХСН обязательно сопровождается необратимыми дегенеративными изменениями тканей опорно-двигательного аппарата, что позволяет считать возникающую при ней системную гемодинамическую дисфункцию фактором их инициации. Наращивание коморбидной нагрузки усугубляет патологическую реорганизацию суставных структур, что наглядно демонстрирует подтверждение концепции коморбидности ОА. Нами была разработана принципиально новая, доступная и максимально близкая к реальным клиническим условиям экспериментальная модель ОА, основанная на имитации этиопатогенетических реалий заболевания человека и отражающая наиболее частое сочетание сосудистых, метаболических и дегенеративных изменений [9]. Предложенное решение основано на оригинальной идее и имеет большое практическое значение, так как позволяет проводить неосуществимые в клинике эксперименты по изучению ранних этапов развития ОА, а также апробировать новые средства и методы лечения этого заболевания. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Т.В.Ч., И.Э.К. Сбор и обработка материала: К.В.К., В.С.П., И.Э.К. Статистическая обработка данных: К.В.К., В.С.П. Анализ и интерпретация данных: К.В.К., В.С.П. Написание текста: К.В.К., И.Э.К., Т.В.Ч., В.С.П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Кристина Валерьевна Корочина

Институт профессионального образования Минздрава РФ

Email: kris_kor@inbox.ru
кафедра терапии 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6

Татьяна Викторовна Чернышева

Институт профессионального образования Минздрава РФ

Email: zaitv@yandex.ru
кафедра терапии 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6

Валентина Сергеевна Полякова

ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава РФ

Email: k_patanat@orgma.ru
460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6

Ирина Эдуардовна Корочина

Институт профессионального образования Минздрава РФ

Email: iris_kor@inbox.ru
кафедра терапии 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6

Список литературы

Дополнительные файлы