ТЕМНЫЕ НЕЙРОНЫ МОЗГА

Аннотация

На светооптическом и электронно-микроскопическом уровне в норме и при различных видах патологии описано строение темных гиперхромных и гиперхромных сморщенных нейронов головного мозга, а также дана их функциональная характеристика. Гиперхромный темный нейрон является клеткой с активным белковым синтезом, которая, однако, при длительном и интенсивном воздействии неблагоприятных факторов или при генетических сбоях может гибнуть путем апоптоза.

Полный текст

Все исследователи встречают в гистологических препаратах мозга тёмные (гиперхромные), а иногда и темные сморщенные нейроны. Тёмные нейроны мозга всегда были предметом дискуссии в клинической и экспериментальной нейроморфологии. До настоящего времени не ясно, являются ли они артефактом или свидетельствуют о патологических изменениях? Каково происхождение, природа (морфофункциональные особенности) и судьба таких нейронов? Морфологическая характеристика и встречаемость тёмных нейронов К тёмным несморщенным нейронам мозга относят клетки с гиперхромной цитоплазмой, размеры которых не отличаются от нормохромных, а к сморщенным гиперхромным - уменьшенные в размерах вытянутые, узкие, деформированные, иногда со штопорообразно закрученным отростком, с пикнотичным ядром [4, 5]. При аккуратном взятии и быстрой фиксации образцов в жидкости Карнуа во фронтальной коре мозга у взрослых интактных крыс темные, гиперхромные нейроны составляют 2%, в коре мозжечка - 4%, в ядре Е2 гипоталамуса - 1%. При этом темные сморщенные нейроны встречаются ещё реже, их менее 1% [4]. В постнатальном онтогенезе в неокортексе у интактных крыс на препаратах, окрашенных по Нисслю, на 2-е сутки после рождения тёмные нейроны составляют 8% от общего количества нейронов, на 45-е сутки - 11%, а на 90-е - 9%. При этом гиперхромные сморщенные нейроны выявляются лишь с 20-х суток после рождения (2%), на 45-е сутки они составляют 3%, а на 90-е - практически не встречаются [8, 9]. При экспериментальных воздействиях и патологических состояниях количество темных нейронов может значительно возрастать. При моделировании подпеченочного холестаза у крыс в новой коре мозга наблюдалось увеличение содержания темных и темных сморщенных нейронов до 6%, а в коре мозжечка - до 16 и 25% соответственно [4]. После полного 5-суточного отведения всей желчи у крыс в коре мозга и мозжечка количество темных нейронов резко возрастало. Их ядра повторяли форму клетки, оболочка ядра образовывала складки, количество ядерных пор увеличивалось, и происходил массовый выход гранул рибонуклеопротеинов в цитоплазму. Гранулярная эндоплазматическая сеть (ГЭС) имела расширенные цистерны с уменьшенным количеством рибосом. Однако последние в большом количестве присутствовали в цитоплазме, образуя свободные полирибосомы. Кристы в митохондриях были разрушены или вовсе отсутствовали, цистерны комплекса Гольджи расширены. В сморщенных нейронах имелись участки дегенерации цитоплазмы с вакуолями [4, 5]. Применение аминазина в дозе 1 мг/кг в соматосенсорной коре мозга у крыс вызывало значительное увеличение числа гиперхромных нейронов, они составляли около 30% от общего числа подсчитанных клеток. Изменения нейронов сопровождались уменьшением количества синаптических окончаний, их набуханием и истончением [14, 27]. Эпилептические судороги, вызванные аппликацией на теменную кору мозга анастезированных крыс кристалла блокатора калиевых каналов 4-аминопиридина, сопровождались появлением тёмных нейронов в гиппокампе и ретикулярной формации моста [34]. У крыс после антенатальной алкоголизации во все сроки после рождения в коре мозга выявлено повышение количества темных пирамидных нейронов. При этом в различные сроки постнатального развития выраженность этих изменений была неодинаковой. Так, на 45-е сутки количество гиперхромных сморщенных нейронов было увеличено на 66% по сравнению с контролем. Гиперхромные сморщенные нейроны у контрольных животных на 45-еи 90-е сутки почти исчезали, а у крыс, подвергавшихся антенатальной алкоголизации, напротив, их количество резко возрастало [8, 9]. Установлено, что в цитоплазме несморщенных темных нейронов в коре мозга у крыс, подвергавшихся антенатальной алкоголизации, количество митохондрий на единице площади цитоплазмы на 20-еи 45-е сутки после рождения было значительно меньше, чем в контроле. При этом митохондрии становятся более сферичными и менее вытянутыми, количество и длина крист на 1 мкм2 в них были ниже на 20-е и особенно на 45-е сутки после рождения. В цитоплазме общее количество рибосом на единице площади и содержание рибонуклеопротеинов в гиперхромных нейронах у этих животных было значительно выше, чем в нормохромных нейронах. При этом в них относительное количество свободных рибосом в постнатальном онтогенезе прогрессивно нарастало, а связанных - снижалось. При этом происходило значительное уменьшение протяженности цистерн ГЭС на единице площади цитоплазмы и их расширение, особенно на 45-е сутки постнатального развития [11, 12]. Темные сморщенные нейроны на 20-еи 45-е сутки постнатального развития у крыс после антенатальной алкоголизации имеют темные цитоплазму и складчатое ядро. В цитоплазме наблюдаются дезорганизация и деструкция органелл. Канальцы ГЭС содержат мало рибосом, цистерны комплекса Гольджи расширены, митохондрии набухшие, без крист, с осмиофильным матриксом. Преобладают свободные рибосомы, образующие обширные скопления. В цитоплазме встречаются гиперосмиофильные гомогенные участки, что определяет темную окраску этих нейронов на электронномикроскопических фотографиях [11, 12]. В сенсомоторной коре мозга потомства крыс при различных патологических состояниях на электронномикроскопическом уровне выделяют 3 типа темных нейронов. Гиперхромные клетки первого типа содержат менее осмиофильное по сравнению с цитоплазмой ядро, в цитоплазме - расширенные цистерны эндоплазматической сети, распавшиеся на вакуоли цистерны комплекса Гольджи, митохондрии с разрушенными кристами. В гиперхромных клетках второго типа повышена осмиофилия цитоплазмы за счет накопления мелкогранулярного материала, а уплотненное ядро приобретает неправильные очертания. Гиперхромные нейроны третьего типа имеют темное, неправильной формы ядро; в их цитоплазме выявляются щелевидные уплотнения и поврежденные органеллы [19, 20, 26]. После хронического потребления крысами алкоголя в дозе 3,5 г/(кг·сут) в гистаминергическом ядре Е2 гипоталамуса доля гиперхромных нейронов возрастала с 1 до 10%. При этом в цитоплазме нейронов происходили ультраструктурные изменения, которые свидетельствуют об активации ядерного аппарата (гипертрофия и перемещение ядрышек к ядерной оболочке, конденсация субъединиц рибосом вблизи ее внутренней мембраны, расширение перинуклеарного пространства и возрастание складчатости ядерной оболочки), деструкции и гипертрофии различных органелл (эндоплазматической сети, комплекса Гольджи, лизосом, митохондрий), отражающих адаптационные изменения изучаемых нейронов [13]. Темные нейроны характерны для гипоксии мозга и расцениваются как ишемически измененные сморщенные клетки [32]. При окклюзии средней мозговой артерии у крыс гиперхромные нейроны были выявлены в неокортексе, гиппокампе, боковом стриатуме, ядрах таламуса и миндалевидного тела [35]. После 30-минутной субтотальной ишемии мозга при двусторонней перевязке общих сонных артерий во фронтальной коре мозга значительно возрастает число темных и темных сморщенных нейронов [29]. При этом гиперхромные нейроны составляют основную массу всех нейронов гистаминергического ядра Е2. Ядра гиперхромных нейронов угловато-округлые, с извилистой оболочкой. Периметр ядер этих нейронов на 45% больше, а сферичность на 10% меньше, чем в контроле. Количество рибосом на 1 мкм наружной мембраны ядерной оболочки на 60% больше. В гиперхромных нейронах целостность этой мембраны часто нарушена. Хроматин в них мелкозернистый, распределён равномерно, встречаются лишь небольшие участки гетерохроматина, площадь их ядрышек на 44% больше, чем в контроле. Отмечено смещение ядрышка к периферии и массовый выход из него гранул рибонуклеопротеинов. Количество свободных рибосом на 1 мкм2 цитоплазмы гиперхромных нейронов гистаминергического ядра Е2 на 46% больше, чем в контроле. Митохондрии в этих нейронах распределены по цитоплазме неравномерно, их кристы, внешняя и внутренняя мембраны часто подвержены деструкции. Общее количество лизосом в таких нейронах на 25% больше, чем у животных контрольной группы [23]. Аналогичные ультраструктурные изменения развивались при гипоксии и в коре большого мозга [20, 32]. Происхождение тёмных нейронов Спорным остается вопрос о происхождении темных нейронов мозга. Являются ли они артефактом или это проявление их патологического состояния? Показано, что увеличение интервала времени от взятия образца мозга до фиксации приводит к увеличению числа тёмных нейронов: если через 10 и 30 мин количество их существенно не возрастает, то через 12-24 ч все нейроны становятся тёмными [37]. Даже после внутрисердечной перфузии раствором глутаральдегида кратковременное механическое повреждение мозга с помощью стержня вызывало в окружающей зоне появление многочисленных тёмных нейронов. При этом аналогичное повреждение после микроволнового нагревания мозга не сопровождалось появлением тёмных нейронов [40]. Темные и сморщенные нейроны наблюдались в участках механического повреждения коры мозга у крыс при взятии образцов для исследования. Позднее либо грубое взятие образцов мозга может приводить к артефактному образованию темных нейронов. При адекватном взятии материала для исследования возникновения этого артефакта можно избежать. На основании светооптических и электронно-микроскопических данных в экспериментах на животных предположено, что тёмные нейроны появляются в результате нарушения функционирования хранящих энергию желеподобных структур, которые занимают пространство между ультраструктурными элементами (вероятно, автор имеет в виду гиалоплазму). При этом механизмом образования тёмных нейронов является непрограммированная инициация фазового перехода этих структур (возможно, переход гиалоплазмы из золя в гель), которая может быть обратимой (при некоторых физиологических состояниях) или необратимой, приводящей к гибели клетки путём, отличным от некроза и апоптоза [37, 38]. При введении аминазина в дозе 5 мг/кг в коре мозга и ретикулярной формации преобладали явления гиперхромного окрашивания нейронов, накопления в них РНК, белков с одновременным понижением активности кислой фосфатазы, что рассматривается как выражение понижения функциональной активности клеток коры. Доза 20 мг/кг вызывала появление резко гиперхромных нейронов и единичных сморщенных [1]. При длительном (30 сут) введении аминазина установлены усиливающаяся гиперхромия и сморщивание нейронов [14]. Полагают, что предшествующие (прижизненные) патологические воздействия лишь увеличивают чувствительность нейронов к артефактной ишемии и развитию тёмных нейронов [37]. Предположено, что формирование тёмных (сжатых, сморщенных) нейронов сопровождается крупномасштабной экскрецией воды, что происходит при многих неврологических заболеваниях, таких как ишемия, и обеспечивается неферментативными механизмами [39]. Считают, что темные сморщенные нейроны возникают в результате быстрой потери более половины объёма цитоплазматической жидкости (воды, неорганических ионов и метаболитов), которая в течение нескольких минут покидает клетки путём пассивной диффузии, без затрат энергии. Этот процесс усиливается в результате обезвоживания организма (при использовании мочегонных средств) [38]. Морфофункциональное состояние тёмных нейронов L. Einarson и E. Krogh [36] определяли гиперхроматофилию клетки как состояние торможения, временного прекращения ее активности. Накопление базофильного вещества в нейроне и его гиперхромное окрашивание рассматривают как морфологическое выражение процесса охранительного торможения [24, 27]. Б. Н. Клосовский и Е. Н. Космарская [21] выделяют несколько стадий изменений нейронов коры мозга при тормозном состоянии от первоначального набухания перикарионов и гипохромии до гиперхромной окраски. Гиперхромное окрашивание, за исключением сморщивания, относят к группе функциональных изменений. Иногда гиперхромия затрагивает только часть нейрона, что приводит к мысли о том, что отдельные зоны клетки могут находиться в различном функциональном состоянии [27]. Подтверждением низкой функциональной активности темных сморщенных нейронов служат результаты электронно-микроскопического и ауторадиографического исследования, показавшие снижение скорости выведения вновь синтезированной РНК из ядра в цитоплазму [28]. Вместе с тем, существуют данные, согласно которым темный несморщенный нейрон - это клетка с интенсивным белковым синтезом, который обеспечивается суперэкспрессией амплифицированных генов [16]. С. Г. Калиниченко и Н. Ю. Матвеева относят гиперхромные сморщенные нейроны к клеткам в состоянии пикноза и атрофии с признаками коагуляционного некроза [17]. Однако Н. Е. Ярыгин и В. Н. Ярыгин [33] исключили гиперхромное окрашивание клетки с признаками сморщивания из группы дистрофических изменений и отнесли эти изменения к функционально-приспособительным. Гиперхроматофилия нейронов может характеризовать преобладание синтеза белка над его расходованием [26], а сморщивание с дегидратацией цитоплазмы, возможно, происходит в связи с нарушением водно-солевого обмена нейронов. По нашим данным, гиперхромные нейроны коры мозга имеют ряд характерных особенностей развития органелл в постнатальном онтогенезе. Так, происходит уменьшение относительного числа митохондрий, количества и длины их крист, что сопровождается снижением в цитоплазме этих нейронов активности маркерных ферментов митохондрий сукцинатдегидрогеназы и NADH-дегидрогеназы [10]. Это свидетельствует об уменьшенной функциональной активности митохондрий и энергетического обеспечения нейронов. По сравнению с нормохромными гиперхромные нейроны имеют гораздо больше связанных и, особенно, свободных рибосом, что обеспечивает их гиперхромную окраску по Нисслю. Уменьшение количества связанных с ГЭС рибосом и увеличение числа свободных рибосом свидетельствуют о переключении биосинтеза белка на собственные нужды нейронов, что необходимо для их выживания в неблагоприятных условиях. Однако из-за сниженного синтеза белка на экспорт в терминали участие этих нейронов в деятельности коры мозга, по-видимому, будет уменьшено. При этом сморщивание части гиперхромных нейронов, вероятно, можно рассматривать как срыв адаптации, ведущий к последующей их гибели [8]. Сморщивание гиперхромных нейронов А. Е. Снесарев [31] относил к дегенеративной атрофии, биологический смысл которой заключается в приспособлении к длительной консервации в неблагоприятных условиях [25]. Д. Э. Коржевский расценивает сморщивание нейронов как патологическое состояние, которое предшествует гибели клетки [22]. Для сморщенных нейронов характерен пикноз клеточного ядра, отражающий происходящие в клетке некробиотические процессы, что свидетельствует о них как о структурах, пребывающих в состоянии физиологической дегенерации [2, 6, 15]. Судьба тёмных несморщенных и сморщенных нейронов Данные о судьбе темных нейронов весьма противоречивы. В ранние сроки после экспериментальной черепно-мозговой травмы (первые 7 сут) у крыс встречались гиперхромные сморщенные нейроны с плохо различимыми ядром и ядрышком, с извитыми, деформированными отростками, некоторые из которых затем восстанавливали свою структуру [18]. После ишемии, в течение первого часа после восстановления кровообращения, в гиперхромных нейронах наблюдалось уплотнение органелл, но их ультраструктура восстанавливалась в течение 1-х суток. Те нейроны, в которых не произошли восстановительные процессы, погибали и были элиминированы путем фагоцитоза [43]. Были исследованы окрашенные по Нисслю тёмные нейроны неокортекса и гиппокампа при латеральном гидравлическом ударе мозга у крыс (моделирование черепно-мозговой травмы). В неокортексе число погибших нейронов через 24 ч после повреждения было меньше, чем тёмных нейронов в более ранний период. При этом в гиппокампе число погибших нейронов было равно числу тёмных нейронов [41, 44]. Морфологические особенности и дальнейшее существование гиперхромных нейронов в коре мозга, гиппокампе и ретикулярной формации оценивали после индуцированной эпилепсии. В пораженных клетках было выявлено набухание митохондрий, часть из нейронов подвергались отеку, постепенному распаду органелл и выходу их остатков в окружающую среду через большие разрывы в плазмолемме и фагоцитозу [34, 39]. Анодная поляризация вызывает появление темных нейронов в неокортексе независимо от интенсивности и длительности поляризационных токов. Такие нейроны практически не встречались у контрольных животных. Темные нейроны были наиболее распространенными во II и IV слое фронтальной коры через 24 ч после последней поляризации. После этого почти все нейроны постепенно вернулась к нормальному морфофункциональному состоянию в течение 1 мес после последней поляризации [42]. Гиперхромия и сморщивание нейронов коры мозга расценивали как дегенеративные, но не лишенные возможности обратимости изменения [14]. В течение 1 ч после восстановления кровотока после 1-часовой перевязки средней мозговой артерии тело и дендриты тёмных нейронов проявляли гипербазофилию, аргирофилию, осмиофилию и резкое электронно-микроскопическое уплотнение ультраструктур. Между 1 ч и 1 сут после перевязки степень ультраструктурного уплотнения уменьшалась и появлялись происходящие из митохондрий спиральные, слоистые мембранные структуры. В дальнейшем цитоплазма некоторых нейронов проявляла апоптотическую конденсацию ядерного хроматина как у только появившихся «темных» нейронов. Затем апоптотические нейроны превращались в мембранно-связанные, плотные и электронно-плотные фрагменты, которые поглощались фагоцитами [43]. Согласно данным литературы, жизненный цикл гиперхромных нейронов можно разделить на 3 периода. Первый период характеризуется паранекротическим состоянием. В одних случаях темные клетки выходят из такого состояния и превращаются в нормохромные. В других случаях явления, характеризующие первый период, прогрессируют, темные клетки дегенерируют и исчезают. В гиперхромных клетках, активно синтезирующих белок, происходит активация генетического аппарата, сопоставимая со стрессовой ситуацией на уровне генома. В этих условиях есть большая вероятность сбоя в механизмах регуляции активности генов. Следствием такого сбоя может быть «хаотическая» экспрессия, приводящая к трансформации клеток и программированной клеточной гибели - апоптозу [3, 7, 16, 30]. Механизм образования «тёмных» нейронов может быть обратимым (при некоторых физиологических состояниях) или необратимым, приводящем к гибели клетки путём, отличным от некроза и апоптоза [37]. При холестазе или потере желчи у крыс в коре мозга и мозжечка обнаружено, что темные сморщенные нейроны мозга одновременно были гиперфуксинофильными, которые относят к гибнущим нейронам [45]. Вместе с тем, в коре мозга животных, подвергавшихся антенатальной алкоголизации, значительное увеличение числа темных сморщенных нейронов с 20-х суток после рождения не сопровождалось дальнейшей убылью общего числа нейронов при исследовании через 45 и 90 сут [8, 9]. Судьба «тёмных» нейронов (восстановление или смерть) зависит от существующих условий. При этом восстановление объёма сморщенных нейронов требует энергии, поскольку блокада ферментов митохондрий тормозит это восстановление и приводит к гибели этих нейронов [38]. Заключение В нормальных условиях, при адекватной подготовке материала, в мозгу животных и человека встречаются лишь единичные темные (гиперхромные) и еще реже темные сморщенные нейроны. Их количество может значительно возрастать в участках механического повреждения мозга при взятии образцов для исследования или при отсроченной фиксации (в этих случаях их следует рассматривать как артефакт). При экспериментальных воздействиях и патологических состояниях число темных нейронов может значительно возрастать. Темные несморщенные нейроны имеют поврежденные митохондрии и повышенное количество свободных рибосом, определяющее гиперхроматоз цитоплазмы и повышенный белковый синтез для собственных нужд клетки. Последнее можно рассматривать как адаптационную реакцию, направленную на выживание нейронов в неблагоприятных условиях. Однако способность таких нейронов выполнять свои обычные функции в мозге остается неясной. Сморщивание нейронов возникает, вероятно, в результате резкого нарушения их водно-солевого обмена и быстрой потери значительного количества воды. При этом объем цитоплазмы клеток уменьшается, что приводит к увеличению плотности расположения в них рибосом и гиперхроматозу. Кроме того, происходит фрагментарное сгущение и уплотнение гиалоплазмы этих нейронов, видимое на электронномикроскопических фотографиях как гомогенные участки гиперосмиофилии. Сморщивание нейронов следует рассматривать как тяжелое патологическое изменение, иногда необратимое и приводящее к их гибели. Вместе с тем, вопросы о функциональном состоянии и судьбе темных нейронов мозга остаются нерешенными и нуждаются в дальнейшем исследовании.