РАЗВИТИЕ СУБЭПИКАРДИАЛЬНОГО НЕРВНОГО СПЛЕТЕНИЯ У КРЫСЫ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ

Полный текст

Сердце млекопитающих и особенно человека является одним из наиболее иннервированных органов. Не зря сложный комплекс нервных аппаратов сердца иногда называют «маленьким мозгом» [4, 6]. В последние десятилетия с внедрением в нейробиологии новых более точных и прецизионных методов нейроиммуногистохимического (НИГХ) анализа все больше внимания уделяется вопросам структурной организации нервных сплетений сердца у млекопитающих. Ранее три нервных сплетения были описаны НИГХ-методами в миокарде левого желудочка у человека и в эпикарде (ЭП), миокарде и эндокарде у крысы [2, 3]. По современным данным, число внутрисердечных нервных сплетений достигает 5-7 в зависимости от топографии эпикарда, числа ганглиев, биохимического статуса нейронов, наличия немиелинизированных и миелинизированных нервных волокон и окончаний [5, 8, 9]. Иннервация сердца изучается на протяжении многих десятилетий, однако вопросы, касающиеся развития нервных сплетений сердца в онтогенезе, нейромедиаторной природы аксонов парасимпатической и симпатической нервной системы и другие, остаются малоизученными. Нерешенным является вопрос о возможном регуляторном влиянии нервных элементов на васкуляризацию и неогенез сосудов сердца. Целью настоящей работы явилось изучение формирования нервных сплетений, выяснение медиаторной природы их нервных волокон и исследование взаимосвязи нервных структур и кровеносных сосудов ЭП на разных стадиях постнатального развития крысы. Материал и методы. Работа выполнена на крысах линии Вистар разного возраста, а именно: 1-го (Р1), 14-го (Р14), 30-го (Р30) дней постнатального развития и половозрелых 3-месячных крысах (всего 16 наблюдений). В ходе эксперимента соблюдали международные правила Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными и «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Данное исследование имеет положительное заключение локального этического комитета ФГБНУ «ИЭМ» (№ 3-17 от 30.11.2017 г.). Животных выводили из эксперимента парами этилового эфира, выделяли сердце и околосердечную область и фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде. После заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Часть срезов окрашивали толуидиновым синим по Нисслю и гематоксилином - эозином. Для иммуногистохимического выявления синаптофизина (Syn), являющегося специфическим белком синаптических везикул, использовали поликлональные кроличьи антитела (разведение производителя; MONOSAN, Нидерланды). Для идентификации катехоламинергических структур применяли поликлональные кроличьи антитела к тирозингидроксилазе (ТН) (1:1000, Abcam, Великобритания). Нервные стволы и пучки нервных сплетений, а также нервные клетки без учета их медиаторной специфики выявляли с помощью иммуногистохимического маркирования белка PGP 9.5 - широко используемого нейрального маркера [1]. Для этого применяли поликлональные кроличьи антитела (1:200, Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из наборов EnVision+ SystemLabelledPolymer-HRP Anti-Mouse (Dako, Дания) и Reveal Polyvalent HRP/DAB Delection System kit (SpringBioscience, США) - так называемую пероксидазную метку. Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). Для иммуногистохимических реакций проводился отрицательный контроль с нанесением на срезы вместо первичных антител их разбавителя (Dako, Дания). Результаты исследования. Анализ срезов, сделанных через все сердце новорожденной крысы, после выявления нейронального маркера белка PGP 9.5 показал неравномерное распределение нервных структур (рис. 1). У новорожденной крысы основная их масса сосредоточена вне органа в области корней или основания магистральных сосудов, а меньшая - представлена развивающимся внутриорганным эпикардиальным сплетением. В межорганной рыхлой соединительной ткани и развивающейся жировой клетчатке постоянно обнаруживаются 1-2 относительно крупных (от 200 до 350 мкм) ганглиев округлой или неправильной формы, расположенных между стволом аорты, правым ушком сердца и легочной артерией. Микроганглии, тяжи и группы нервных клеток (НК) встречаются на задней стенке венозного синуса, в основании краниальной и каудальной полых вен, а также на задней стенке левого предсердия в области легочных вен. Ганглии состоят из компактно расположенных НК и небольшого числа нейробластов диаметром 13,5-20 мкм (рис. 2, а, б). Через 2 нед размеры НК увеличиваются почти в 2 раза. Вокруг тел некоторых из них с помощью реакции на Syn обнаруживаются перицеллюлярные синаптические аппараты, образованные преганглионарными парасимпатическими нервными волокнами (см. рис. 2, б). На поперечных срезах между аортой и легочной артериями часто встречаются фрагменты вагосимпатического ствола. Отходящие от него многочисленные пучки нервных волокон объединяются с пучками аксонов НК интрамуральных узлов, и в результате образуются смешанного типа нервные сплетения вокруг стенок магистральных сосудов околосердечной области. Вблизи ганглиев и нервных пучков, а иногда и внутри них обнаруживаются небольшие скопления мелких гранулярных клеток, представляющих собой нейроэндокринные хромаффинные клетки (ХК) (см. рис. 2, б, в). С помощью реакции на ТH были избирательно выявлены также и симпатоадреналовые компоненты сердца. Одни из них представлены симпатическими волокнами, встречающимися по отдельности или в составе пучков различного диаметра смешанного типа в основном сплетении, расположенном в межорганной соединительной ткани. Еще одним TH+-компонентом, нередко присутствующим в этой области сердца, являются ХК, способные синтезировать катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин). Симпатические ганглии в околосердечной области сердца практически отсутствовали, но изредка встречались небольшие группы ТН+-нейронов. У новорожденных крыс иннервация тканей самого сердца, включая предсердия и желудочки, была слабо выражена. Большая часть тонких PGP 9.5+-нервных пучков, берущих начало от нервного сплетения на границе ушек и желудочков, выявлялась на поверхности развивающегося сердца. Применение иммуногистохимической реакции на PGP 9.5 позволило установить, что на данной стадии онтогенеза клетки однослойного плоского эпителия ЭП (или проэпикарда) содержат этот нейральный маркер. На препаратах видно, что между эпителием и развивающимся миокардом находится субэпикардиальный слой, толщина которого варьирует на протяжении всего периметра сердца. Внутри субэпикардиального слоя встречаются фибробластоподобные клетки, а также многочисленные венозные сосуды с широкими просветами разной формы, выстланные эндотелиальными клетками (см. рис. 2, г, е). Некоторые из сосудов заполнены эритроцитами. Эти картины свидетельствуют о продолжающемся у новорожденных крыс процессе формирования кровеносных сосудов. Как видно на рис. 2, г, в области миокарда они еще отсутствуют. С помощью реакции на белок PGP 9.5 на всех срезах непосредственно под эпителием ЭП обнаруживали развивающееся нервное сплетение (см. рис. 1; 2, г-е). Нервные волокна в его составе окрашивались в черный цвет и отличались от PGP 9.5+-клеток эпителия эпикарда. Последние окрашивались в коричневый цвет и располагались на самой поверхности сердца. Нервное сплетение локализуется в субэпикардиальном слое, там же, где формируются венозные сосуды. Фрагменты тончайших пучков немиелинизированных аксонов этого сплетения находились вблизи эпителия и новообразующихся венозных сосудов. Узкопетлистая часть эпикардиального нервного сплетения занимала приблизительно 2/3 поверхности основания обоих желудочков, а более разреженная широкопетлистая часть располагалась в направлении к верхушке сердца (см. рис. 1). При использовании двух иммуногистохимических реакций (на PGP 9.5 и ТН) удалось обнаружить волокна различной медиаторной природы. Большинство аксонов субэпикардиального нервного сплетения, так же как и ганглии околосердечной области, у новорожденных крыс являются PGP 9.5+, тогда как ТH+-симпатические нервные волокна встречаются редко. Это свидетельствует о том, что большинство нервных структур сердца у новорожденных относятся к холинергическим парасимпатическим элементам автономной нервной системы. Иннервация миокарда предсердий и желудочков у новорожденных крыс еще слабо выражена. Немногочисленные тонкие пучки холинергических аксонов обнаруживались в периферической части миокарда ближе к ЭП. В глубине миокарда правого желудочка среди кардиомиоцитов находились малочисленные Syn+-терминали (рис. 3, б). Что касается симпатической иннервации, с помощью реакции на ТН изредка удавалось обнаружить единичные тонкие пучки аксонов и небольшие группки (2-3) ХК в верхней части правого и левого желудочков вблизи предсердий (см. рис. 3, а). В этот же срок в околосердечной области в развивающейся парааортальной жировой клетчатке симпатические волокна и их терминали четко идентифицировались вокруг артериол. У крыс на стадиях развития P14 и P30 PGP 9.5+-иммунореактивность эпителия ЭП постепенно ослабевала и через 3 мес полностью исчезала. У 3-месячных крыс субэпикардиальный слой отсутствовал. Между эпителием ЭП и дифференцированным миокардом устанавливались типичные для дефинитивного сердца межтканевые взаимоотношения (рис. 4). В миокарде среди зрелых исчерченных пучков кардиомиоцитов, кроме венозных капилляров с широкими просветами (сосудов синусоидного типа, стенка которых представлена одним только слоем эндотелия), наблюдались артериолы, а также мелкие и средние артерии. Через 3 мес стенки артерий и вен окружались густой сетью PGP 9.5+-и ТН+-аксонов и их окончаний. Миокард сердца оказывался пронизанным трехмерной сетью нервно-сосудистых сплетений. Обсуждение полученных данных. Результаты настоящей работы, полученные с помощью специальных маркеров (белок PGP 9.5 и TH), подтвердили, что у новорожденных животных (P1) основная масса нейронов интрамуральных ганглиев имеют холинергическую природу. Можно предположить, что их постганглионарные парасимпатические безмиелиновые аксоны, обнаруженные у новорожденных в субэпикардиальном сплетении, в период образования сосудов участвуют в процессе васкулогенеза и иннервации миокарда. Затем на поздних сроках вместе с сосудами они проникают с поверхности сердца вглубь желудочков и с симпатическими аксонами участвуют в иннервации сосудов сердца и собственно миокарда. Симпатическая иннервация в тканях миокарда особенно отчетливо обнаруживается через 2 нед после рождения, что по срокам совпадает с появлением зрения у крыс. Аналогичные данные об иннервации сердца у мыши свидетельствуют, что симпатические нейроны в сердечном нервном сплетении составляют только 4 %, в то время как холинергические - 82 %, а оставшиеся 14 % являются «бифенотипическими» [7]. Источником холинергических волокон субэпикардиального сплетения, по-видимому, являются нейроны интрамуральных ганглиев. Приведенные результаты НИГХисследования согласуются с данными литературы и результатами собственных наблюдений, полученными ранее [2, 3, 8, 9]. Важной особенностью иннервации сердца у крысы на ранних стадиях постнатального развития является слабое развитие его нервных сплетений по сравнению с околосердечной областью. Наличие плотного сплетения из немиелинизированных аксонов в атриовентрикулярном узле миокарда, широкопетлистого сплетения под эпителием эндокарда и фрагментов формирующихся рыхлых сплетений в верхних отделах желудочков свидетельствует о продолжающемcя гетерохронном развитии иннервации тканей в различных отделах сердца в постнатальном онтогенезе. В то же время, степень иннервации миокарда и сосудов сердца 1-месячной крысы сравнима с иннервацией сердца у половозрелых 3-месячных животных. Полученные результаты позволяют высказать некоторые предположения относительно функционального значения одновременной экспрессии PGP 9.5 клетками ЭП и холинергических аксонов субэпикардиального слоя. Возможно, на ранних стадиях развития во время формирования сосудов холинергические аксоны субэпикардиального нервного сплетения, кроме ацетилхолина, выделяют регуляторный пептид (PGP 9.5.). В дальнейшем, в более поздние сроки постнатального развития, за счет врастания в сплетение постганглионарных симпатических и афферентных волокон оно становится смешанным, состоящим из пучков аксонов различной медиаторной природы, и может выполнять эфферентную, сенсорную и нейротрофическую функции. Таким образом, с помощью иммуногистохимических реакций на белок PGP 9.5, ТН и Syn показано, что в околосердечной области у новорожденных крыс уже имеются хорошо сформированные ганглии, микроганглии, нервные сплетения из смешанных парасимпатических и симпатических пучков, а также встречаются скопления ХК. При этом парасимпатические элементы преобладают над симпатическими. Во многих ганглиях на нервных клетках обнаружены перицеллюлярные синаптические окончания преганглионарных волокон, что свидетельствует об установлении их связей с центральной нервной системой. В миокарде предсердий и желудочков у новорожденной крысы иннервация еще слабо выражена, однако в субэпикардиальном слое впервые обнаружено формирующееся нервное сплетение из пучков безмиелиновых парасимпатических аксонов. Эпителиальные клетки эпикарда на ранних стадиях развития временно экспрессируют белок PGP 9.5, позволяющий селективно выявлять эпителиальный пласт вокруг сердца. Через 2-4 нед после рождения эпителий эпикарда утрачивает свою иммунореактивность, субэпикардиальный слой не прослеживается, и через 3 мес устанавливаются характерные для зрелого ЭП взаимоотношения между нервным сплетением, подлежащей соединительной тканью и миокардом сердца. Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о процессах иннервации развивающегося эпикарда и позволяют сделать предположение об участии клеток ЭП и аксонов формирующегося нервного сплетения в процессе васкуляризации сердца в постнатальный период. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Е. И. Ч., Д. Э. К. Сбор и обработка материала: Е. С. П. Анализ и интерпретация данных: Е. И. Ч., Е. С. П., Д. Э. К. Написание и редактирование текста: Е. И. Ч, Д. Э. К. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Евгений Иванович Чумасов

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы; кафедра биологии, экологии и гистологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Елена Сергеевна Петрова

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: dek2@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы; кафедра фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы