МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТИНА И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ТИМУСА ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ В УСЛОВИЯХ ВРОЖДЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА

Полный текст

Как известно, из всех органов иммунной системы только тимус подвергается инволютивным изменениям. Достаточно хорошо изучены морфофункциональные изменения в этом органе при возрастной инволюции [13]. Помимо этого, многие стрессогенные факторы вызывают развитие острой атрофии тимуса [5, 12]. Акцидентальная инволюция может наблюдаться в результате действия физического и психоэмоционального стресса [7], под влиянием ряда химических веществ [13], а также на фоне инфекционных заболеваний, травм и оперативных вмешательств [5, 8]. Отличительной особенностью акцидентальной инволюции является её обратимость, т.е. структура железы восстанавливается после завершения действия стрессового агента до уровня возрастной нормы [3, 9]. Опухолевые заболевания также сопровождаются развитием акцидентальной инволюции тимуса и, как следствие, формированием Т-клеточного иммунодефицита [5]. Механизмы этого процесса до сих пор остаются невыясненными. Одни авторы считают пусковым фактором прямую индукцию апоптоза тимоцитов и уменьшение доли Т-клеток в S-стадии клеточного цикла [6, 15]. Другие - считают наиболее значимым недостаточное поступление в тимус клеток-предшественников. При этом в костном мозге они сохраняются в достаточном количестве и являются функционально полноценными. Вероятно, это может быть следствием миграции клетокпредшественников из костного мозга в селезенку или опухоль [4]. Есть мнение, что индукторами инволюции могут выступать глюкоркортикоидные гормоны и цитокины [6, 10]. Установлено, что активация иммунной системы материнского организма животных в ранние сроки беременности приводит к снижению противоопухолевого иммунного ответа у потомства [13]. Показано, что развитие опухоли в организме животных приводит к серьезному дисбалансу эндокринной системы, сопровождается выраженной атрофией вилочковой железы с дезорганизацией эпителиальных клеток, структур нетимопоэтического окружения коркового и мозгового вещества, а также угнетением тимопоэза [6]. В то же время, много данных о том, что сам иммунодефицит способствует формированию более агрессивной опухоли с развитием ранних отдаленных метастазов [12]. Несмотря на это, практически отсутствуют данные о состоянии иммунных органов при канцерогенезе в условиях врожденного иммунодефицита. Поэтому исследование органов иммуноэндокринной системы в этих условиях является актуальным и представляет научный интерес для широкого круга специалистов. Цель настоящей работы - гистологический и иммуногистохимический анализ тимуса потомства крыс с врожденным иммунодефицитом при постнатальном введении канцерогена. Материал и методы. Работа выполнена на белых нелинейных крысах (n=80). Животные содержались в виварии, уход за ними осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». На проведение данного исследования получено разрешение локального этического комитета (№ 8, 09.11.2016 г.). Животные были разделены на 4 группы: интактного контроля (потомство здоровых самок, n=20), контрольную (потомство спленэктомированных крыс, n=20), 1-ю подопытную (потомство здоровых самок, которым через 1 мес после рождения начинали внутрибрюшинно вводить канцероген (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 нед, n=20), 2-ю подопытную (потомство спленэктомированных самок, которым через 1 мес после рождения начинали внутрибрюшинно вводить 1,2-диметилгидразин из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 нед, n=20). Сроки и дозы введения канцерогена были выбраны в соответствии с моделью индукции опухолей толстой кишки [14]. Выведение из эксперимента осуществляли через 6 мес после окончания курса введения канцерогена путем декапитации. При аутопсии животных подопытных групп проводили ревизию органов брюшной полости с вскрытием толстой кишки. При патоморфологическом исследовании учитывали частоту развития новообразований, их морфологические особенности, локализацию. Животные, у которых не произошло формирования опухоли, в исследование не включены. При исследовании тимуса использовали следующие методы. Окраска гематоксилином-эозином. Материал фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, промывали проточной водой, затем выполняли стандартную проводку на тканевом гистопроцессоре Leica ASP 200 (Leica, Германия) и заливали в парафин. Парафиновые срезы материала толщиной 3 мкм наносили на отрицательно заряженные стекла (Mentzel Glasses super frost, Германия) и окрашивали гематоксилином - эозином по стандартной методике. Иммуногистохимический метод [2]. Исследования выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные полилизином, высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Проводили иммуногистохимические реакции ручным и аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров Autostainer-360 (Thermo, Великобритания) и Leica Bond-Max (Leica, Германия) с применением систем визуализации En-vision (DAKO, Дания) и NovoLink polymer (NovoCastra, Великобритания). Для иммуногистохимического исследования использовали моно-и поликлональные антитела (МКАТ и ПКАТ) (Santa Cruz, США и NovoCastra, Великобритания): 1) МКАТ к панцитокератину для неселективной идентификации эпителиальных клеток тимуса; 2) МКАТ к CD3 для идентификации зрелых тимоцитов; 3) ПКАТ к белку S-100 для идентификации клеток нейроэктодермального гистогенеза и дендритных клеток; 4) ПКАТ к синаптофизину для идентификации клеток нейроэндокринного происхождения; 5) МКАТ к CD68 для идентификации макрофагов в дольках тимуса; 6) ПКАТ к белку p53 для идентификации апоптотически измененных клеток в структурах дольки тимуса; 7) ПКАТ к белку bcl-2 для идентификации долгоживущих клеток и определения направленности апоптотических реакций в структурах дольки тимуса; 8) МКАТ к маркеру клеточной пролиферации Ki-67 для идентификации клеток, находящихся в митотической, G1-, S-и G2-фазах клеточного цикла. Компьютерная морфометрия. Цифровые снимки микропрепаратов получали с применением системы архивирования на базе микроскопа Leica DM4000B (Leica, Германия) с использованием цветной фотокамеры Leica DFC 425 и лицензионной программы Leica Application Sute 3.6.0 (Leica, Германия). Микрофотографии для проведения морфометрических измерений были получены при увеличениях 50,100 и 400 с обозначением градуировочной линейки на каждом снимке. Линейные морфометрические измерения площади мозгового вещества и толщины коркового вещества долек выполнены с использованием лицензионной программы Leica Application Sute 3.6.0. Измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением лицензионной программы МикроАнализ (ТелеМедТехника, Россия), а также демо-версии программы Sigma Scan Pro (Systant Software Inc, Япония). Интенсивность мембранной и цитоплазматической иммуногистохимической реакции оценивали методом автоматического выделения и подсчета интересующего цветового спектра (окрашенного DAB) по отношению к площади снимка. Затем определяли долю площади структур, обладающих позитивной иммуногистохимической реакцией, по отношению к общей площади фотографии. Для каждого среза измерения выполнены не менее чем в 10 презентативных полях зрения при увеличении 400. Статистическую значимость полученных данных определяли по t-критерию Стьюдента. Данные представляли в виде средней арифметической величины (х -) и ее средней ошибки (sх -). Результаты исследования. Через 6 мес после воздействия тимус у потомства спленэктомированных самок значительно отличается от такового у животных контрольной и 1-й подопытной группы. Тимус уменьшен в размерах, паренхима железы частично замещена жировой тканью, граница коркового и мозгового вещества долек определяется с трудом. В периферических отделах тимуса вместо долек имеются скопления эпителиальных клеток без лимфоцитов, окруженные жировой тканью (рисунок, а). В центральных отделах органа определяются небольшие дольки, в мозговом веществе которых отчетливо визуализируются скопления эпителиоцитов. В дольках отмечается уменьшение площади мозгового вещества в 2,4 раза и толщины коркового вещества на 28,6 %. Масса тимуса уменьшается незначительно (на 14 %), что связано с увеличением жировой ткани органа. Кроме того, при иммуногистохимическом исследовании выявлено увеличение числа CD3+тимоцитов в 1,86 раза и снижение их экспрессии в мозговом веществе в 1,72 раза (табл. 1). Установлено, что количество эпителиальных клеток коркового вещества, дающих положительную реакцию к панцитокератину, значимо снижается в 1,6 раза, в мозговом веществе - почти в 2 раза (табл. 2). Эпителиоциты коркового вещества обычно располагаются компактными группами и формируют густую сеть, между петлями которой расположены скопления тимоцитов. Медуллярные эпителиоциты смещаются к границе между корковым и мозговым веществом, при этом в центральной области мозгового вещества они отсутствуют (см. рисунок, б). При постановке иммуногистохимической реакции к синаптофизину установлено, что численность клеток APUD-серии увеличивается в 5,9 раза (см. табл. 2). Эти клетки располагаются в области кортико-медуллярной зоны, мозговом веществе и междольковых промежутках. Численность дендритных клеток, дающих положительную реакцию на белок S-100, и CD68+макрофагов возрастает в 1,4 и 1,8 раза соответственно (см. рисунок, в). Расположение этих клеток не отличается от такового в группе интактного контроля: они локализуются и в мозговом веществе, и в кортико-медуллярной зоне, а также формируют скопления вокруг сосудов в корковом веществе. В тимусе у потомства крыс 2-й подопытной группы значимо снижается число клеток, позитивных к белкам-регуляторам апоптоза (bcl- 2), которые располагаются как среди клеток мозгового вещества, так и среди кортикальных тимоцитов. Количество р53+-клеток в корковом, мозговом веществе и на их границе увеличивается более чем в 3 раза. Они формируют периваскулярные скопления вокруг сосудов коркового вещества и междольковых септ. Параллельно с этим отмечается снижение числа делящихся Ki-67-позитивных клеток как в корковом, так и в мозговом веществе долек (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. Было установлено, что в тимусе у потомства иммунодефицитных самок с постнатальным введением канцерогена происходят перестройка цитоархитектоники и иммуногистохимического фенотипа клеток, а также изменение соотношения разных популяций тимоцитов и их клеточного микроокружения. Это проявляется уменьшением всех морфометрических показателей дольки, значимым снижением клеточной пролиферации в корковом и мозговом веществе, уменьшением числа эпителиальных клеток в структурах дольки, увеличением клеток тимопоэтического микроокружения, экспрессирующих S-100, СD68 и синаптофизин. Кроме того, в структурах тимуса отмечается увеличение количества клеток, экспрессирующих белки-регуляторы апоптоза p53 и снижение bcl-2+-клеток. В процессе акцидентальной инволюции тимуса выделяют пять фаз [5, 6]. Все выявленные нами изменения характерны для 2-3-й фазы акцидентальной инволюции тимуса, которые, как известно, являются пока еще обратимыми [5]. Кроме того, основным структурным отличием акцидентальной инволюции от возрастной является уменьшение долек тимуса, а вследствие этого массы органа за счет потери лимфоцитов корковой зоны с последующей атрофией органа [6, 11]. В наших предыдущих исследованиях было установлено, что введение канцерогена потомству самок именно с иммунодефицитной беременностью приводит к развитию аденокарциномы толстой кишки с более агрессивным морфологическим фенотипом [12]. В настоящее время доказано, что вилочковая железа и опухоль оказывают друг на друга взаимное влияние. Развитие опухоли влечет за собой запуск акцидентальной инволюции тимуса, большинство опухолей являются тимусзависимыми. Это характерно для злокачественных новообразований различного происхождения, в том числе индуцированных с помощью канцерогенов [6]. Существует гипотеза, что при росте опухоли усиливается выход из тимуса незрелых тимоцитов, которые мигрируют в опухоль, где поддерживают рост трансформированных клеток - лимфозависимая фаза роста [1]. Поступление тимоцитов в опухоль может способствовать как усилению роста самих опухолевых клеток, так и сосудов путем продукции Т-лимфоцитами фактора роста сосудов [4]. Таким образом, изучив морфологическую картину и иммуногистохимический фенотип тимуса, с уверенностью можно сказать, что развивающееся иммунодефицитное состояние у крыс-самок до беременности приводит к серьезным морфофункциональным изменениям тимуса у потомства. Вероятно, в связи с этим развивающаяся опухоль быстро ускользает от иммунного надзора, по-видимому, за счет факторов иммунорезистентности опухоли и становится более агрессивной с развитием ранних отдаленных метастазов. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: О. Ю. К. Сбор и обработка материала: Е. Г. Д. Статистическая обработка данных: М. Н. М. Анализ и интерпретация данных: Л. М. М., Г. Ю. С. Написание текста: Г. Ю. С. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Глеб Юрьевич Стручко

Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова

Email: glebstr@mail.ru
Кафедра нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией 428015, г. Чебоксары, Московский пр., 15

Елена Геннадьевна Драндрова

Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова

Email: drandrov@yandex.ru
Кафедра нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией 428015, г. Чебоксары, Московский пр., 15

Лариса Михайловна Меркулова

Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова

Email: merkulova192@mail.ru
Кафедра нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией 428015, г. Чебоксары, Московский пр., 15

Ольга Юрьевна Кострова

Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова

Email: evkbiz@yandex.ru
кафедра инструментальной диагностики с курсом фтизиатрии; Кафедра нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией 428015, г. Чебоксары, Московский пр., 15

Марина Николаевна Михайлова

Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова

Email: mar3007@mail.ru
Кафедра нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией 428015, г. Чебоксары, Московский пр., 15

Список литературы

Дополнительные файлы