ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ NO-СИНТАЗУ, ПРИ ХИМИЧЕСКОЙ ДЕАФФЕРЕНТАЦИИ КАПСАИЦИНОМ

Полный текст

Чувствительные ганглии содержат гетерогенную популяцию нейронов [2-5, 9], включающую 3 их группы: большие нейроны, малые, содержащие нейропептиды и малые, не содержащие нейропептидов. Пептид-содержащие нейроны иммунопозитивны к веществу Р или родственному пептиду, связанному с кальцитониновым геном. Малые не содержащиепептидовнейроны способны связывать изолектин Б4 Griffonia simplicifolia (ИБ4) и могут участвовать в различных болевых синдромах, в том числе - посттравматическом [2, 9]. При изучении механизмов боли как в клинических, так и в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных широко используется капсаицин [3, 4, 10]. Нейрофизиологические и нейрохимические исследования конца 80-90-х годов показали, что капсаицин, взаимодействуя со специфическими рецепторами плазмолеммы, вызывает возбуждение, последующую десенситизацию и морфологическую деструкцию в большой группе первичных афферентных С-и отчасти А-гамма-волокон. Нейротоксическое действие капсаицина объясняется избыточным внутриклеточным накоплением Са2+ и Na+, что ведеткгидратации,активациипротеаз,накоплению токсинов, дегенерации и гибели клеток [9]. Установлено, что введение новорожденным крысятам капсаицина вызывает гибель 20% клеток грудного узла спинномозгового нерва на 10-е сутки жизни. При этом гибнет популяция нейронов малых размеров, которые являются капсаицин-чувствительными, содержащими TRPV1-рецепторы. У более взрослых животных доля TRPV1-иммунопозитивных нейронов в узле также была меньше на 12-20% [3, 4, 6, 8]. К числу нейротрансмиттеров относятся также мелкие молекулы, в частности, оксид азота (NO). Нейроны, содержащие NO-синтазу (NOC), выявляются в чувствительных узлах у крысы, в частности в каудальном узле блуждающего нерва (КУБН), чувствительных узлах спинномозговых нервов (ЧУСН). В постнатальном онтогенезе доля NOC-позитивных нейронов изменяется. В первые 10 сут жизни в ЧУСН происходит увеличение доли NOC-позитивных нейронов с последующим ее снижением между 30-ми и 60-ми сутками. В КУБН в онтогенезе доля NOC-иммунопозитивных нейронов существенно не меняется [9]. Сведения о влиянии химической деафферентации на нейроны, содержащие NOC, в литературе отсутствуют. Поэтому целью настоящего исследования явилось определение локализации, относительного содержания и морфометрическая характеристика NOCиммунопозитивных нейронов в ЧУСН и КУБН при химической деафферентации, вызванной капсаицином, в постнатальном онтогенезе. Материал и методы. Исследование проведено на 50 белых крысах-самках линии Вистар в возрасте 3, 10, 20, 30 и 60 сут после рождения с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Животные были разделены на 2 группы: контрольную (n=25), подопытную (n=25). Крысам подопытной группы на 2-е сутки жизни проводили деафферентацию путем однократного подкожного введения капсаицина (N-vanillylonanamide, Sigma, США) в дозе 100 мг/кг в растворе, состоящем из 1 части 96% этилового спирта, 1 части Твин-80, 8 частей изотонического раствора NaCl. Эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг, внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии фосфатно-солевого буфера (PBS) с гепарином (5 ЕД/л), затем 4% раствора параформальдегда на 0,1М PBS. Для исследования брали чувствительные узлы второго грудного (ЧУСН ) и четвертого поясничного (ЧУСНТII) спинномозгового нерва, а также КУБН. Выделенные LIVузлы помещали на 2 ч в указанный фиксатор, после чего промывали 3-кратно в PBS в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы на 24 ч. Из фиксированного материала на криостате готовили серии срезов толщиной 14 мкм. С целью выявления нейронов, содержащих NOC, применяли мечение антителами козы (Abcam, США) при разведении 1:300. Срезы преинкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% сыворотки, 1% тритон X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% тимерозола. Затем срезы инкубировали с первичными антителами в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременного промывания в PBS срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флюоресцинизотиоцианатом (FITS) дающим зеленую флюоресценцию (Jackson, США, разведение 1:100) в течение 2 ч. Для расчета доли иммунопозитивных нейронов производили мечение всей нейронной популяции флюорохромом Neuro Trace Red (Molecular Probes, США) с красной флюоресценцией. После промывки в PBS срезы инкубировали в этом растворе в течение 20 мин (разведение 1:200). После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Анализ препаратов проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Olympus BX43 (Olympus, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD-камерой Tucsen TCH 5.0 (Tucsen, Китай) c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Tucsen, Китай). Для анализа размеров и относительного содержания иммунопозитивных нейронов брали 3 центральных среза каждого узла, сделанных с интервалом приблизительно 0,05 мм. При подсчете учитывали только нейроны с четко идентифицируемым ядром. Долю иммунопозитивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов на срезе, принятому за 100%. Площадь сечения нейронов определяли с использованием программы Image J (NIH, США). Для определения этого параметра в случайном порядке по методике, описанной Г. Г. Автандиловым [1], оценивали 100 нейронов, иммунопозитивных к каждому из исследованных маркеров в каждой возрастной группе. Статистический анализ включал определение среднего арифметического значения и его стандартной ошибки. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при P<0,05. Результаты исследования. В контрольной и подопытной группах у крыс всех исследованных возрастов NOС-позитивные нейроны выявлялись и в ЧУСН, и в КУБН (рисунок). У животных контрольной группы в ЧУСН доля NOС-иммунопозитивных нейронов увеличивалась в первые 10 сут жизни и уменьшалась между 30-ми и 60-ми сутками. В КУБН доля NOСиммунопозитивных нейронов в онтогенезе значимо не менялась (P>0,05, табл. 1). В каждой возрастной группе доля NOС-иммунопозитивных нейронов в КУБН была значимо меньше, чем в ЧУСН. Значимые различия доли NOС-иммунопозитивных нейронов между ЧУСН ТII и в контрольной группе отсутствовали (P>0,05). У животных подопытной группы в ЧУСН и КУБН доля NOС-позитивных нейронов резко снижалась в первые 20 сут жизни (см. табл. 1). Значимых различий доли NOС-иммунопозитивных нейронов в ЧУСН ТII и LIV не отмечалось, за исключением 10-суточного возраста, когда доля иммунопозитивных нейронов была значимо больше в ЧУСН ТII (P<0,05). Наиболее выраженное снижение числа NOС-содержащих нейронов отмечалось в ЧУСН по сравнению с КУБН. В КУБН к концу 2-го месяца жизни доля NOС-иммунопозитивных нейронов возрастала, тем не менее оставаясь значимо ниже, чем в группе контрольных животных (P<0,01) (см. табл. 1). Средняя площадь сечения NOС-иммунопозитивных и негативных нейронов в онтогенезе возрастала во всех исследованных узлах с момента рождения до 2-го месяца жизни в контрольной группе и до 1-го месяца жизни в подронов в ЧУСН становилась значимо меньше, чем NOС-иммунонегативных нейронов (P<0,05). Cредняя площадь сечения NOС-позитивных и негативных нейронов в ЧУСН и КУБН у подопытных 30-суточных крыс была значимо выше, чем у контрольных крыс (P<0,05). Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования установлено, что в раннем постнатальном онтогенезе у контрольных крыс доля NOС-иммунопозитивных нейронов в ЧУСН изменяется и достигает максимума на 30-е сутки жизни, что согласуется с ранее проведенными исследованиями [9]. При химической деафферентации под влиянием капсаицина происходит значительное снижение доли NOС-позитивных нейронов в первые 20 сут жизни. Однако в КУБН после 20-х суток доля NOС-иммунопозитивных нейронов вновь возрастает, хотя и остается ниже, чем у животных контрольной группы. Возможно, что висцеральные афферентные нейроны КУБН более устойчивы к химической деафферентации, чем ЧУСН, где имеется много соматических афферентных нейронов. При химической деафферентациикапсаицином на 30-е сутки жизни средняя площадь сечения NOС-позитивных и негативных нейронов у подопытных крыс становится значимо выше, чем у контрольных крыс. Это можно объяснить гибелью самых мелких нейронов, наиболее чувствительных к капсаицину [3, 4, 8], а также увеличением размеров нейронов при отеке вследствие токсического действия нейротоксина. К концу 2-го месяца жизни происходит восстановление размеров нейронов, и они вновь соответствуют морфометрическим показателям у контрольных крыс. Имеются довольно противоречивые данные, свидетельствующие о проноцицептивном и антиноцицептивном действии NO в сенсорных нейронах [11]. Многочисленные данные свидетельствуют о роли NO в развитии сенситизации при воспалительной и нейропатической боли [7, 11]. NO может играть роль в процессах сенситизации за счет синтеза цГМФ и последующего фосфорилирования специфических мембранных белков, опосредованного через протеинкиназу С. NO также может активировать различные типы TRP-каналов, включая TRPC5, TRPV1, TRPV3, TRPV4 и TRPA1 [11, 12]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о повреждающем действии капсаицина на NOC-позитивные нейроны, что подтверждает роль NO в механизмах ноцицепции. Вбóльшей степени токсическому действию капсаицина подвержены NOC-иммунопозитивные нейроны ЧУСН, чем таковые КУБН.

Об авторах

Константин Юрьевич Моисеев

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Валентина Вячеславовна Порсева

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра анатомии человека 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Виктория Павловна Смирнова

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Марина Борисовна Корзина

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Петр Михайлович Маслюков

Ярославская государственная медицинская академия

Email: mpm@yma.ac.ru
кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Список литературы

Дополнительные файлы