МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОМОЗГОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЛИМФОТОКА В РЕГИОНЕ ТРОМБИРОВАННОЙ ВЕНЫ

Полный текст

В последнее время постоянно растет количество пациентов с тромботическими поражениями сосудистой системы. В связи с этим одной из важнейших проблем современной медицины во всем мире является лечение флеботромбозов [4]. Восстановление микроциркуляции в тканях региона тромбированного сосуда проходит через развитие коллатеральных сосудов и реканализацию тромба. Имеются данные, что аутологичные мультипотентные стромальные клетки костномозгового происхождения (АМСККП) участвуют в ангиогенезе при экспериментальном флеботромбозе. Это приводит к более быстрому восстановлению кровотока в тканевом микрорайоне пораженной вены [2, 3]. Постепенно введенные АМСККП и структуры, сформированные с их участием, вытесняются собственными клетками организмареципиента [2, 3, 10]. Однако в научных публикациях полностью отсутствуют результаты исследований воздействия таких клеток на лимфатические сосуды, находящиеся в регионе тромбированной вены, хотя давно известны сопутствующие изменения лимфатической системы при недостаточности венозного оттока [6, 9, 11, 12, 16]. В связи с изложенным цель настоящего исследования - установление возможности использования АМСККП для восстановления нарушенного лимфотока в регионе тромбированной вены в эксперименте. Материал и методы. В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag массой 180-200 г в возрасте 6 мес. Все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г.; приказ Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13 ноября 1984 г.). АМСККП получали, культивировали и трансфицировали ДНК плазмиды, содержащей ген зеленого флюоресцентного белка (GFP) [2, 3, 10]: АМСККП 2-го пассажа, полученные от крысы указанной линии, трансфицировали ДНК плазмиды pЕGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., США), содержащей ген GFP под контролем промотора цитомегаловируса и ген устойчивости к неомицину под контролем промотора вируса SV40, необходимого для последующей селекции с использованием дженетицина G418 (pEGFP-N1; Clontech Laboratories Inc., США). Трансфекцию проводили в присутствии реагента для трансфекции TurboFect (Fermentas Lfe Siences, Inc, Канада) согласно рекомендациям производителя, применяли протокол для трансфекции суспензионных клеток. Трансфекцию проводили, используя 1×106 клеток в 1 мл суспензии, 4 мкг ДНК плазмиды и 10 мкл реагента для трансфекции TurboFect (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Для моделирования венозного тромбоза использовали метод S. Wessler и соавт. [15], который был подробно описан ранее [2]. Сущность метода заключается в лигировании v. femoralis как можно ближе к месту впадения в v.circumflexa ilium profunda. В нижнюю треть v. femoralis вводили раствор тромбина (0,5 ЕД/мл) до заполнения всего участка от места инъекции до места лигирования (0,03-0,05 мл). Место инъекции пережимали на 3 мин (до формирования тромба) для исключения ретроградного распространения и элиминации введенного препарата через инъекционное отверстие. Через 1 сут осуществляли повторный доступ к тромбированной вене и после удаления лигатуры вводили 50 мкл суспензии АМСККП в культуральной среде (1×106 клеток в 1 мл) непосредственно в тромбированную вену. Животных выводили из эксперимента через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после введения АМСККП. Контролем служили интактные крысы, животные с венозным тромбозом без введения АМСККП и с применением АМСККП без предварительного моделирования венозного тромбоза [3]. В экспериментальной и в каждой контрольной группах на каждую временную точку было использовано по 11-12 животных (всего n=226). V. femoralis с окружающими тканями и регионарные (паховые) лимфатические узлы с паранодальными тканями фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в пластифицированный парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином - эозином, изучали при увеличении светового микроскопа Axioimager M1 (Zeiss, Германия) до 1200 раз. Кроме того, неокрашенные срезы изучали с использованием того же микроскопа в режиме люминесценции с фильтром Alexa 488. Дифференцирование кровеносных и лимфатических сосудов проводили в соответствии с рекомендациями J. Casley-Smith [7] и J. R. Head, L. L. Seeling [8]. Результаты исследования. У интактных животных паравазально располагается жировая ткань с небольшими прослойками рыхлой волокнистой соединительной ткани, где находятся небольшие лимфатические сосуды с тонкими стенками и широким просветом, иногда оптически пустым, иногда со слабоэозинофильным гомогенным содержимым, там же встречаются единичные лейкоциты (рис. 1, а). У всех интактных крыс и животных после моделирования венозного тромбоза без последующего использования клеточных технологий при изучении тканей в отраженном ультрафиолетовом свете специфически флюоресцирующих структур обнаружено не было как в паравазальной соединительной ткани, так и в стенке всех кровеносных и лимфатических сосудов, а также и в паранодальных тканях (рис. 2, а, б). В просвете кровеносных сосудов за счет аутофлюоресценции светились эритроциты (см. рис. 2, а, б). Через 4 сут после создания венозного тромбоза без последующего использования клеточных технологий в соединительной ткани вокруг сосудистого пучка лимфатические капилляры имели тонкие стенки и были оптически пустыми. Иногда встречались сосуды с толстыми склерозированными стенками и также оптически пустым просветом. При внутривенном введении АМСККП без предварительного создания тромбоза в области сосудистого пучка лимфатические сосуды были с тонкими стенками и оптически пустым просветом. Флюоресцирующие объекты при использовании люминесцентной микроскопии отсутствовали. При тромбозе с последующим применением АМСККП в тканях рядом с сосудистым пучком были обнаружены множество лимфатических сосудов и капилляров со светящимися стенками. В некоторых случаях светился весь сосуд, в других - только отдельные клетки в его оболочках. Признаков тромбоза и непроходимости таких сосудов не было, но иногда имелись слабовыраженные склеротические изменения. Через 1 нед после моделирования венозного тромбоза без последующего применения клеточных технологий в значительно склерозированной соединительной ткани вокруг сосудистого пучка были расположены лимфатические сосуды с широким просветом, тонкой стенкой и гомогенным слабоэозинофильным содержимым. Там же присутствовали сосуды с более интенсивно окрашенным содержимым, оно уже не было гомогенным, а имело множество уплотнений, оптически пустых мест и перетяжек (см. рис. 1, б). Такой вид, вероятно, свидетельствует о тромбозе этих компонентов лимфатического русла в регионе. В группе крыс с введением АМСККП без тромбирования вены лимфатические сосуды в соединительной ткани не имели значительных изменений: были тонкостенными и с оптически пустым просветом. При тромбозе с последующим применением АМСККП в склерозированной соединительной ткани возле магистральных сосудов содержались множество расширенных лимфатических сосудов и капилляров, многие из сосудов имели толстые стенки с признаками склероза и эозинофильным содержимым (см. рис. 1, в). Такие объекты чаще всего не имели флюоресценции, но в редких случаях там содержались крупные лимфатические сосуды с клапанами, полностью построенные из клеток с ярко светящейся цитоплазмой и темными ядрами (см. рис. 2, в). В мышцах бедра иногда в тонких стенках расширенных лимфатических капилляров наблюдалась флюоресценция (см. рис. 2, г). После моделирования венозного тромбоза без последующего использования АМСККП к 2-недельному сроку склероз ткани в области сосудисто-нервного пучка оставался отчетливо выраженным. Там присутствовали разные по размерам лимфатические сосуды и капилляры со склерозированными стенками и признаками тромбоза: неоднородное интенсивно окрашенное содержимое. В результате применения АМСККП без сопутствующего венозного тромбоза соединительная ткань рядом с магистральными сосудами также была склерозирована и там располагались лимфатические капилляры и сосуды, некоторые из которых имели широкий просвет и признаки тромбоза. На фоне введения АМСККП в тромбированную вену в склерозированной соединительной ткани рядом с магистральными сосудами содержались лимфатические сосуды разного диаметра и капилляры со слабым свечением или вообще без флюоресценции их оболочек. Иногда в лимфатических сосудах имелись признаки лимфостаза. Наблюдалось слабое, но достаточно хорошо заметное специфическое свечение расширенных лимфатических сосудов, проходящих в толще мышц бедра. Полностью светились тонкие стенки сосудов, и иногда в светящихся клетках было видно темное ядро. Через 3 нед после моделирования тромбоза без последующей коррекции выраженность склероза в соединительной ткани вокруг магистральных сосудов несколько уменьшилась. Лимфатические сосуды также были менее склерозированы и не имели признаков тромбоза (см. рис. 1, г). В результате инъекции АМСККП без моделирования тромбоза склероз соединительной ткани сохранялся на уровне такового в предыдущий срок (см. рис. 1, д). Флюоресцирующих объектов в стенке лимфатических капилляров и сосудов обнаружено не было, однако, в жировой ткани вокруг лимфатических узлов было расположено множество различного размера кровеносных и лимфатических сосудов с ярким свечением во всех их оболочках. При этом флюоресценция была отмечена даже в структурах клапанов таких сосудов. Часто на фоне ярко светящейся цитоплазмы было видно более темное ядро (см. рис. 2, д). После введения АМСККП в тромбированную вену в склерозированной соединительной ткани присутствовали лимфатические капилляры и сосуды, стенки которых также имели признаки склероза (см. рис. 1, е). Иногда в таких сосудах было содержимое, но признаки тромбоза или лимфостаза уже отсутствовали: просвет не расширен, содержимого мало, оно гомогенное, окрашено не интенсивно. В основном рядом с магистральными сосудами были расположены компоненты лимфатического русла без специфического свечения. Иногда там содержались и сосуды с оболочками, в которых светились все клетки. Они имели ярко флюоресцирующую цитоплазму и более темное ядро (см. рис. 2, е). В мышцах бедра также были расположены крупные лимфатические капилляры с широким просветом и свечением стенок, но в основном оно было незначительно выше фона. Через 4 нед после моделирования венозного тромбоза без применения АМСККП в области сосудистого пучка были обнаружены только склеротические изменения. Лимфатические сосуды были тонкостенными и оптически пустыми. После инъекции АМСККП в вену без моделирования тромбоза выраженность склероза в соединительной ткани вокруг сосудисто-нервного пучка была меньше, чем у животных предыдущей группы. Лимфатические сосуды были оптически пустыми и имели тонкие стенки. Однако при изучении материала в отраженном ультрафиолетовом свете были обнаружены многочисленные лимфатические сосуды со светящимися стенками, проходящие как возле магистральных сосудов, так и между пучками волокон мышцы бедра (см. рис. 2, ж). Имелись также широкие капилляры с очень тонкими светящимися стенками. Однако, наряду со светящимися сосудами, были и сосуды без свечения в своих структурах. На фоне введения АМСККП в тромбированную вену паравазальная соединительная ткань сильно склерозирована. Лимфатические сосуды были оптически пустыми, с тонкими стенками и с незначительными признаками их склероза. Возле магистральных сосудов в лимфатических структурах светящихся объектов не было. Однако в толще мышц бедра были обнаружены многочисленные светящиеся лимфатические капилляры и сосуды с широким просветом и тонкими стенками (см. рис. 2, з). Через 5 нед в группах крыс после моделирования флеботромбоза без использования клеточных технологий, после введения АМСККП без предварительного тромбоза и при введении АМСККП в тромбированную вену выраженность склероза в области сосудистого пучка значительно уменьшилась. Лимфатические сосуды были оптически пустыми и имели тонкие, слегка склерозированные стенки. Специфически светящиеся объекты в оболочках компонентов лимфатического русла отсутствовали. Обсуждение полученных данных. Признаки непроходимости лимфатического русла при экспериментальном флеботромбозе появлялись только через 1 нед после операции и исчезали к 3-й неделе. Любой воспалительный процесс затрагивает микроциркуляторное русло. В тканях происходит увеличение лимфопродукции на фоне блокады как кровеносных, так и лимфатических сосудов. Эта реакция направлена на ограничение участка воспаления и предотвращение распространения антигенов, токсинов и инфекционных агентов по всему организму посредством системы микроциркуляции. Наиболее вероятно, что явления лимфостаза у животных с венозным тромбозом связаны как с действием тромбина, так и с воспалением вследствие хирургических манипуляций. Видимо, часть тромбина из лигированной вены попадает в ткани, например, через инъекционное отверстие, оттуда всасывается в лимфатическую систему и приводит к тромбозу некоторых лимфатических сосудов. Воспалительная реакция, даже асептическая, также может являться причиной лимфостаза, и признаки блокады лимфатических сосудов, пусть и не значительно выраженные, наблюдались и в группах животных с введением АМСККП без предшествующего тромбоза - с однократной операцией. Рядом с сосудисто-нервным пучком при использовании АМСККП на фоне тромбированной вены уже через 4 сут, когда еще не было морфологических признаков лимфостаза и тромбоза, присутствовали сосуды с флюоресцирующими клетками в оболочках. Исчезают светящиеся объекты в стенке таких сосудов к 4-й неделе. Недостаточность лимфотока при блокаде лимфатических сосудов, по-видимому, компенсируется ростом новых сосудов в регионе. Введенные АМСККП участвуют в ангиогенезе, причем не только кровеносных сосудов [2, 3, 10], но и лимфатических. Об этом свидетельствует яркое свечение как отдельных клеток в стенках лимфатических сосудов и капилляров, так и всех их оболочек, в том числе и клапанов. Доказательством того, что лимфатические сосуды в соединительной ткани вокруг сосудистонервного пучка были сформированы именно в результате введения АМСККП и из них, является частичное или полное свечение стенки этих сосудов. Ген GFP, введенный в ДНК этих клеток, неизмененным передается дочерним клеткам и клеткам следующих поколений и позволяет найти структуры, сформированные из них, которые точно также светятся в отраженном ультрафиолетовом свете [5, 13, 14]. В случае тромбоза вены без последующего введения АМСККП объекты с ярким свечением в окружающих тканях отсутствуют. Свечение оболочек сосудов, обнаруженное в наших исследованиях, указывает еще и на то, что именно введенные АМСККП прямо, а не опосредованно (через цитокины или другие клеточные сигналы) участвуют в формировании сосудов. По-видимому, введение АМСККП ускоряет процесс развития (восстановления) лимфатической сети за счет привнесения в место повреждения клеточных элементов, способных к дифференцировке в любом, в том числе эндотелиоцитарном и перицитарном, направлениях. На деление и миграцию собственных стволовых клеток к месту лимфангиогенеза требуется какое-то время. Введение АМСККП непосредственно в регион с недостаточностью лимфотока способствует их быстрому включению в процессы формирования сосудов. Таким образом экономится время, необходимое для пролиферации и миграции собственных стволовых клеток данного организма. Не исключено, что нарушения микроциркуляции при воспалении (прямое повреждение сосудов, отек, тромбоз и пр.) и соответствующие изменения тканевого обмена вызывают дифференцировку введенных АМСККП в направлении клеток-предшественников эндотелиоцитов и перицитов лимфатических сосудов, а ускорение роста сосудов приводит к улучшению питания поврежденных тканей и способствует их более быстрой репарации. В норме появление лимфатических сосудов взамен поврежденных (лигирование) или тромбированных (тромбин и тканевый детрит с фибрином после операций) происходит как за счет роста уже существующих сосудов в данном регионе, так и путем формирования их de novo. Тот и другой процесс проходят при участии собственных стволовых клеток, которые находятся в красном костном мозгу и могут быть выделены из циркулирующей крови и других тканей. Со временем ангиогенез в поврежденных тканях завершается, и введенные АМСККП (клетки и структуры, сформированные из введенных АМСККП), взятые у генетически идентичной (линейные крысы), но все-таки другой особи, постепенно вытесняются собственными клетками организма-реципиента. Тем более, что введенные АМСККП содержали в геноме чужеродную ДНК, кодирующую синтез GFP. После введения АМСККП в тромбированную вену было отмечено свечение лимфатических сосудов и капилляров в мышце бедра с 1-й недели. Исчезли светящиеся объекты у этой группы крыс к 5-й неделе. Как было показано ранее [2], при моделировании венозного тромбоза по методу S. Wessler и соавт. [15] вместе с магистральными кровеносными сосудами тромбируются и мелкие сосуды, проходящие в толще мышц бедра. Это происходит в результате того, что после введения тромбина он присутствует не только в самом сосуде, но и распространяется ретроградно (вследствие перевязки магистрального сосуда и нарушения оттока) на его ветви, осуществляющие сбор крови от тканей. Видимо, каким-то образом повреждаются и лимфатические сосуды, проходящие рядом с кровеносными. Восстановление лимфотока в тканевом регионе тромбированной вены также происходит с участием введенных АМСККП, которые встраиваются в формирующиеся сосуды или полностью образуют их оболочки. При внутривенном введении АМСККП могут продвигаться ретроградно по ветвям вены или по периваскулярным пространствам и быстро оказываться в мышечной ткани. В бедренных мышцах АМСККП формируют не только кровеносные [2], но и лимфатические сосуды. Свечение сосудов паранодальной ткани и капсулы паховых лимфатических узлов было отмечено через 3-4 нед. Исчезновение светящихся объектов из стенки сосудов жировой ткани вокруг лимфатических узлов и их капсулы произошло к концу наблюдения, к 5-й неделе. Вместе с блокадой лимфатического русла в области сосудистого пучка, причиной которой являются тромбин и постоперационное воспаление, блокируются и лимфатические сосуды на протяжении, наиболее вероятно, вследствие этих же факторов. В том числе происходит блокада лимфотока на уровне паранодальных тканей и даже капсулы лимфатических узлов, где имеется своеобразный клапанный аппарат, регулирующий ток лимфы из афферентных сосудов в субкапсульный синус [1]. Сначала лимфангиогенез начинается в месте применения АМСККП, но затем или из-за их миграции, или даже прорастания сосудов, полностью построенных из введенных АМСККП, появляются светящиеся объекты в тканях рядом с регионарными лимфатическими узлами - по ходу лимфотока. Видимо, именно поэтому ангиогенез на таком отдалении начинается несколько позже, спустя 3-4 нед. При лигировании магистральной вены с последующим введением раствора тромбина, кроме тромбоза кровеносных сосудов, происходит блокирование регионарного лимфотока. Введенные в тромбированную вену АМСККП с трансфицированным геном GFP принимают прямое участие в формировании новых лимфатических сосудов в соединительной ткани вокруг вены, ее тканевом регионе и в области регионарных лимфатических узлов. На это указывает яркое специфическое свечение как отдельных клеток в стенке лимфатических сосудов, так и всех их оболочек вместе с клапанами.

Об авторах

Игорь Валентинович Майбородин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория стволовой клетки; Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Виталий Валерьевич Морозов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория инвазивных медицинских технологий; Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Вера Александровна Матвеева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория стволовой клетки; Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Наталья Валентиновна Оноприенко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория стволовой клетки; Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Геннадий Анатольевич Частикин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория стволовой клетки; Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Юлия Валерьевна Серяпина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория инвазивных медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Сергей Васильевич Мошак

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

лаборатория стволовой клетки 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

Список литературы

Дополнительные файлы