ИЗМЕНЕНИЯ ОСТРОВКОВ И НЕРВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ У КРЫСЫ ПРИ СТАРЕНИИ (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Полный текст

В последние годы интенсивно проводятся исследования строения тканей поджелудочной железы (ПЖ) не только общегистологическими, но и иммуногистохимическими методами [11, 12, 15-18]. Продолжается выяснение топографии островков в различных частях ПЖ, уточняются их клеточный состав, природа и функции эндокриноцитов, взаимоотношения с окружающими структурами, включая ацинусы, микрососуды, нервные элементы как в нормальных условиях жизнедеятельности, так и при патологии органа [5-8, 16]. Морфологические особенности эндокринного аппарата в связи с иннервацией тканей ПЖ при нарушении ее функций еще недостаточно изучены. Важное значение для клинической практики имеют работы, посвященные изучению изменений строения эндокринного аппарата ПЖ при раз личных заболеваниях человека, таких как хронический панкреатит [7], сахарный диабет 1-го и 2-го типов [1, 6, 10], эндокринные опухоли [16]. Существенный интерес в практическом и теоретическом отношении представляют исследования, выполненные на лабораторных животных на моделях сахарного диабета, интоксикации или механической травмы. Имеются лишь единичные исследования иннервации ПЖ при старении, выполненные с применением современных иммуногистохимических маркеров [6]. Недостаточно изученными остаются вопросы нарушения автономной иннервации тканей ПЖ в норме, патологии и в онтогенезе. Цель настоящей работы - изучение изменений островков и нервного аппарата ПЖ крысы в процессе старения. Материал и методы. Работа проведена на крысах линии Вистар (n=24) без учета половых различий в возрасте 3-4 (молодые) и 19 мес (старые животные) в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Животных умерщвляли передозировкой паров этилового эфира, ПЖ брали целиком (вместе с окружающей жировой тканью) и фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [3]. После заливки в парафин из всех частей ПЖ готовили срезы толщиной 5 мкм. Часть срезов окрашивали толуидиновым синим по Нисслю и гематоксилином - эозином. Для выявления нервного аппарата применяли методы иммуногистохимии. Для селективного выявления синаптических терминалей и эндокринных клеток островков применяли поликлональные кроличьи антитела к синаптофизину (СФ) (1:250, DAKO, Дания) [8], для выявления симпатических нервных волокон - поликлональные кроличьи антитела к тирозингидроксилазе (ТГ) (1: 1000, Abcam, Великобритания) [3]. Для выявления парасимпатических структур и панкреатических островков (ПО) использовали поликлональные кроличьи антитела к белку PGP 9.5 (белковый генный продукт 9.5) (1:200, Spring Bioscience, США) [4]. В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection System (Bio Genex, США) и реактивы из набора EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания). Количественный анализ ПО осуществляли на цифровых изображениях, полученных с помощью микроскопа Leica DM 750 и цифровой камеры Leica ICC 50 (Leica, Германия). Подсчитывали число ПО при ув. 100, определяли площадь их сечения при ув. 400. У каждого животного подсчет проводили на 8 цифровых изображениях, общая площадь которых составила 10,4 мм2. Для подсчета числа ПО и измерения их площадей использовали программу ImageJ (NIH, США). Различия оценивали по t-критерию и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. На срезах, сделанных через все отделы ПЖ у молодых крыс при использовании реакций на СФ и PGP 9.5, на светлом фоне экзокринной части отчетливо выделяются не только крупные, средние и мелкие островки, но и небольшие группы эндокриноцитов и даже одиночные клетки (рис. 1, а). Размеры ПО и плотность их расположения в различных отделах ПЖ значительно варьируют. Большая часть крупных и средних ПО сосредоточены в области тела ПЖ, в то время как в головке и хвосте их размеры меньше и расположены они реже. При использовании PGP 9.5 все клетки ПО иммунопозитивны, но имеют разную степень интенсивности окраски. Мелкие клетки размером 6-9 мкм имеют интенсивно окрашенную мелкозернистую цитоплазму и различную форму: округлую, вытянутую, треугольную, часть из них снабжены короткими отросткам. Эти клетки располагаются, как правило, по периферии ПО (см. рис. 1, б, в). В некоторых местах можно видеть проникновение их отростков между тесно прилежащими к ним эндокриноцитами, составляющими основную массу клеток ПО. В этих клетках полигональной формы интенсивность реакции умеренная: от слабой до средней и не достигает такой интенсивности, как в клетках, располагающихся по периферии ПО. Они имеют более крупные размеры (до 10-15 мкм), а в их цитоплазме содержится диффузная зернистость. Обнаружено, что у старых крыс в возрасте 19 мес значимо снижается общее количество ПО по сравнению с таковым у молодых животных (рис. 2). Исследование распределения количества ПО по размерам у молодых и старых крыс показало, что с возрастом уменьшается число именно крупных ПО (рис. 3). Наблюдаются атрофия многих ПО, реорганизация и изменение их клеточного состава. В некоторых ПО, отделенных от экзокринной части железы тонкой соединительнотканной оболочкой, наблюдаются уменьшение числа мелких темных клеток и смещение некоторых из них в центр островка (рис. 4). Нередко можно видеть распад и фрагментацию ПО. На их месте образуются разрозненные клеточные скопления эндокриноцитов в виде тяжей, групп и отдельных клеток. У молодых животных выявлена обильная иннервация ПЖ, представленная тремя нервными сплетениями: одно - широкопетлистое, состоящее из нервных стволиков и пучков миелиновых и безмиелиновых нервных волокон, второе - из тонких пучков аксонов автономных нейронов и микроганглиев, третье - основное концевое, состоящее из безмиелиновых волокон с варикозными расширениями и синапсами типа en passant. С помощью реакции на PGP 9.5 в ПЖ у крыс иногда обнаруживаются мелкие парасимпатические ганглии. Их нейроны имеют многоугольную форму. Все клетки дают иммунопозитивную реакцию на PGP 9.5. Особенно интенсивно при этом окрашиваются в черный цвет отростки нейронов, которые в составе общего сплетения участвуют в иннервации тканей долек экзокринной части ПЖ и ПО. Внутри ПО ни в одном из исследованных нами случаев нейроны не удалось обнаружить. У старых крыс, в отличие от молодых, в составе пучков нервных волокон выявляются лишь отдельные небольшие группы нейронов (рис. 5). Наиболее крупные пучки PGP 9.5-позитивных волокон располагаются вблизи крупных магистральных артериальных и венозных сосудов (см. рис. 2, а). Отходящие от этих нервных стволиков тончайшие пучки нервных волокон, разветвляясь, образуют сплетения, иннервирующие гладкие миоциты в стенке сосудов различного диаметра (см. рис. 1, а; 5, а). Внутри долек ПЖ они встречаются вокруг артериол, венул, выводных протоков и многочисленных ацинусов. При реакции на СФ у молодых крыс, наряду с избирательной окраской эндокриноцитов ПО, во всех отделах ПЖ выявляется терминальное нервное сплетение, которое представлено СФ-позитивными претерминальными и терминальными аксонами с варикозными расширениями. Они образуют густую сеть, которая вплотную прилежит к гладким миоцитам стенки крупных и мелких артерий, артериол, вен, венул (см. рис. 1, а). СФ-позитивные терминали встречаются вокруг выводных протоков, но их расположение менее плотное, чем в артериях и венах. Сравнительный морфологичекий анализ показал, что у старых крыс отмечаются следующие изменения нервного аппарата. Уменьшается количество интрамуральных ганглиев. В нервных стволах наблюдается разрежение нервных волокон и увеличение количества нейролеммоцитов, отсутствуют миелиновые волокна. Наблюдается уменьшение или полное отсутствие СФ-позитивных терминалей вокруг кровеносных сосудов и выводных протоков. Это может приводить к ухудшению микроциркуляции крови в дольках ПЖ и ПО, ик нарушению функции выводных протоков. С возрастом наблюдается денервация как эндокринной, так и экзокринной частей ПЖ. У старых крыс в дольках между ацинусами и ПО, вокруг многих артериальных сосудов микроциркуляторного русла почти полностью отсутствуют характерные для ПЖ молодых крыс СФ-позитивные терминали, уменьшается и количество PGP 9.5-позитивных аксонов (см. рис. 4, а). С помощью реакции на ТГ в ПЖ выявлены пучки постганглионарных симпатических волокон, которые состоят из многочисленных ТГ-позитивных аксонов (см. рис. 5, б). По ходу следования пучки симпатических волокон истончаются, ветвятся и образуют на границе адвентиции и средней оболочки сосуда концевые сплетения из ТГ-позитивных варикозных аксонов. Наибольшая плотность их расположения отмечена в области дихотомического ветвления междольковых и внутридольковых артерий среднего и малого диаметра, в то время как артериолы, приносящие кровь в экзокринную часть ПЖ и к ПО, окружены слабо выраженной сеточкой истончающихся ТГ-позитивных варикозных аксонов. Отдельные терминальные веточки прослеживаются вплоть до периферически расположенных эндокриноцитов ПО. Внутри самих ПО между эндокриноцитами и капиллярами ТГ-позитивные терминали отсутствуют. Симпатические нейроны в ПЖ нами не обнаружены. Это свидетельствует о том, что ТГ-позитивные аксоны терминального сплетения, выявленного вокруг артериальных сосудов, принадлежат постганглионарным симпатическим нейронам, находящимся вне ПЖ. Сравнительный анализ иммуногистохимической реакции выявления ТГ у молодых и старых крыс показал резкое уменьшение ТГ-позитивных эфферентных симпатических терминалей вокруг артериальных сосудов и полное отсутствие их в ПО и вокруг выводных протоков у старых крыс. Обсуждение полученных данных. Согласно нашим предыдущим исследованиям [7, 8] и данным других исследователей [4, 16]. СФ и PGP 9.5 являются маркерами, обладающими высокой селективностью выявления эндокриноцитов ПО. Они позволили исследовать топографию и плотность расположения ПО во всех отделах ПЖ у молодых и старых крыс. При сравнении ПЖ у этих групп животных оказалось, что число наиболее крупных ПО с возрастом снижается. Эти данные, полученные на ПЖ у крыс, отличаются от таковых у человека [6]. Авторы показали, что у человека с возрастом и при заболевании сахарным диабетом количество ПО увеличивается. Однако их клеточный состав значительно изменяется: резко уменьшается количество инсулиноцитов по сравнению с глюкагоноцитами [6]. Известно, что в ПО у млекопитающих насчитывается более 5 типов эндокриноцитов. Основные из них - А-клетки - синтезирующие глюкагон, B- - инсулин, D- - соматостатин, РР- - панкреатический полипептид, Е- - грелин [2, 9, 13, 14, 16]. Однако при использовании СФ в качестве маркера все клетки ПО окрашиваются одинаково, с помощью реакции на PGP 9.5 в ПО удается идентифицировать клетки с разной интенсивностью окраски. В клетках, располагающихся по периферии ПО, отмечается более интенсивная реакция на PGP 9.5. В соответствии с данными литературы [13, 14, 16], в центральной части сформированного ПО у молодых крыс преобладают в основном B-и РР-клетки, а по периферии - А-и немногочисленные D-клетки. Описанная цитоархитектоника видоспецифична для крыс [13]. Таким образом, выявленные по периферии ПО интенсивно окрашенные при реакции на PGP 9.5 клетки по своему положению в ПО соответствуют А-клеткам, что отмечено и другими авторами [14, 16]. На фоне нарушения иннервации в некоторых дольках ПЖ у старых крыс наблюдались мелкоочаговые воспалительные инфильтраты вблизи сосудов и в области устья главного выводного протока. Важно отметить отсутствие в ПЖ у старых крыс процессов гиперплазии соединительной ткани, которая имеется при хронических панкреатитах у человека [7]. Таким образом, в настоящей работе с помощью иммуногистохимических реакций на СФ, ТГ и PGP 9.5 показано, что с возрастом в ПЖ у крыс наблюдаются существенные изменения в эндокринном отделе и нервном аппарате. У старых крыс выявлены снижение общего количества ПО, главным образом, крупных, а также атрофия и реорганизация их клеточного состава. У них отмечены также денервация тканей ПЖ, уменьшение числа нейронов интрамуральных ганглиев, нервных стволов и пучков, а также СФ-и ТГ-позитивных эфферентных парасимпатических и симпатических терминалей вокруг кровеносных сосудов и выводных протоков. Эти данные свидетельствуют о снижении нейротрофического влияния симпатической и парасимпатической нервной системы на ткани ПЖ при старении.

Об авторах

Евгений Иванович Чумасов

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Email: ua1ct@mail.ru
Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы; кафедра биологии, экологии, гистологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Елена Сергеевна Петрова

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: iemmorphol@iem.spb.ru
Лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы; кафедра фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы