МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ИНТЕНСИВНОСТИ ГИСТОХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ НА СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ В ТКАНЯХ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ КРЫС

Полный текст

В ряде исследований [8, 9] показано, что слой гликозаминогликанов (ГАГ) на поверхности эпителия мочевого пузыря обеспечивает защиту слизистой оболочки от агрессивных компонентов мочи и, тем самым, препятствует развитию воспалительного процесса. Ранее с помощью методов гистохимической идентификации ГАГ в тканях мочевого пузыря крыс на модели химического цистита была обнаружена более интенсивная реакция у животных, получавших препараты ГАГ [5], чем у интактных животных. Однако визуальная оценка гистохимической реакции не позволяет сделать заключение о концентрации ГАГ в тканях мочевого пузыря. В этой связи в настоящей работе нами предлагается метод количественной оценки интенсивности гистохимической реакции на сульфатированные ГАГ в тканях мочевого пузыря крыс с использованием градуировочных стандартов красителя альцианового синего (АС). Методика приготовления градуировочных стандартов АС адаптирована на основании рекомендаций Т. А. Силантьевой, Е. Н. Горбач [3, 4]. Из насыщенного водного раствора АС известной концентрации при температуре 37 ºС готовили серии двукратных разведений на основе коллоидного раствора желатина с конечной концентрацией 20% (таблица). Растворы разливали в пластиковые контейнеры объемом 1 см³ и помещали для полимеризации в холодильную камеру бытового холодильника. Через 1 сут из блоков, имеющих консистенцию плотного геля, лезвием вырезали образцы размером 5×5×5 мм, замораживали их в жидком азоте для предотвращения кристаллизации воды и помещали на охлажденные блокодержатели микротома-криостата Slee Mainz (Medical GmbH, Германия). При температурном режиме -20 ºС изготавливали срезы толщиной 7 и 9 мкм и монтировали на маркированные с указанием конечных концентраций красителя предметные стекла, высушивали на воздухе и заключали под покровные стекла в среду для заключения препаратов BioMount® (BioOptica, Испания). Далее полученные срезы, содержащие градуировочные стандарты АС, фотографировали при увеличении 50, 100, 200, 400. На полученных цифровых изображениях в программе «ВидеоТест» 5.0 для Windows XP методом случайного отбора при помощи инструмента «окружность» выбирали не менее 10 участков, в которых с помощью программы автоматически оценивали показатель оптической плотностив относительных единицах (рис. 1). Полученные значения оптической плотности градуировочных стандартов использовали для построения графикакалибровочной функции, которая представляла собой зависимость между концентрацией красителя в градуировочном стандарте (ось абсцисс) и полученным значением оптической плотности (ось ординат). Построение калибровочных кривых выполняли в приложении MS Excel 2007 (рис. 2). Гистологические криостатные срезы мочевого пузыря толщиной 7 и 9 мкм получали с помощью микротома-криостата Slee MEV (Slee Medical, Германия). Помещали в раствор АС (рН 2,5) на 10 мин, после чего промывали в проточной воде в течение 2 мин, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации, просветляли орто-ксилолом или в растворе BioClear® (Bio Optica, Испания) в течение 2 мин и заключали в среду BioMount® (Bio Optica, Испания) под покровное стекло, фотографировали, а затем с помощью программы «ВидеоТест» 5.0 методом случайного отбора проводили оценку оптической плотности окрашенных участков поверхности эпителиоцитов и собственной пластинки слизистой оболочки. Далее с использованием графика калибровочных стандартов АС вычисляли концентрацию красителя на поверхности переходного эпителия и в собственной пластинке слизистой оболочки мочевого пузыря. В результате оценки интенсивности окрашивания срезов мочевого пузыря толщиной 7 мкм установлено, что концентрация красителя в слизи, покрывающей поверхность эпителиального слоя, составляет 2,2±1,3 мг/см3. Концентрация АС в тканях собственной пластинки несколько выше и составляет 2,5±1,0 мг/см3 (рис. 3). Подобные методы количественной оценки интенсивности гистохимических и иммуногистохимических реакций, основанные на измерении оптической плотности участков гистологических срезов, в настоящее время привлекают внимание исследователей [1, 2, 4, 10]. Методы количественной или полуколичественной оценки более точно отражают содержание исследуемых веществ, чем традиционной полуколичественной (балльной) оценки, основанной на субъективном восприятии исследователя [4]. Ранее с использованием иммуногистохимических методов было показано присутствие на поверхности эпителия мочевого пузыря у животных гепарансульфат-протеогликанов, а в собственной пластинке слизистой оболочки мочевого пузыря - хондроитин-4сульфата и гиалуроновой кислоты [7]. Гистохимический метод, позволяющий идентифицировать в тканях мочевого пузыря сульфатированные ГАГ с помощью АС, в настоящее время продолжает использоваться в экспериментальной медицине и биологии в связи с простотой постановки реакции и достаточно высокой специфичностью [6]. В нашей работе впервые предпринята попытка количественной оценки интенсивности окрашивания тканей мочевого пузыря АС, позволяющая судить о содержании в них сульфатированных ГАГ. Полученные в настоящем исследовании результаты дополняют имеющуюся информацию о распределении и содержании ГАГ в тканях, а метод количественной оценки интенсивности окрашивания тканей мочевого пузыря может быть использован в экспериментальной и практической деятельности специалистов в области нормальной и патологической морфологии.

Об авторах

Владислав Евгеньевич Соболев

Федеральное медико-биологическое агентство России

Email: vesob@mail.ru
лаборатория молекулярной токсикологии и экспериментальной терапии, Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека 188663, Ленинградская обл, Всеволожский р-н, п. Кузьмоловский, к. 93

Леонид Петрович Тельцов

Мордовский государственный университет

Email: kafedra_mfzh@agro.mrsu.ru
кафедра морфологии и физиологии животных 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68

Список литературы

Дополнительные файлы