Изменения хроматофилии цитоплазмы и содержания РНК в нейронах поясной коры мозга крыс при подпечёночном холестазе

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ. Холестаз (застой желчи, при нарушении её оттока желчи из печени в двенадцатиперстную кишку) известен как осложнение многих заболеваний печени и желчевыводящих путей, особенно часто при жёлчекаменной болезни, которой страдает более 10% населения планеты [1]. Недостаточное поступление желчи в  двенадцатиперстную кишку приводит к нарушению переваривания и всасывания жиров и жирорастворимых соединений в кишечнике, а накоплению желчи в желчевыводящих путях ведёт к повреждению гепатоцитов и поступлению компонентов желчи (билирубин, холестерин, желчные кислоты) в кровь, а затем и в головной мозг [2].

При начальных стадиях холестаза клиницистами описаны так называемые «малые симптомы», в виде головных болей, головокружений, тяжести в голове, бессонницы ночью и сонливости днем, апатии, разбитости, невозможности длительного сосредоточения внимания, нарушения памяти. Затем могут проявляться более выраженные неврологические (психические) нарушения характерные для неврастении, энцефалопатии, энцефаломиелопатии и полинейропатии. Известно, что крысы с холестазом хуже справляются с прохождением водного лабиринта Морриса, у них отмечается пассивность и нарушение памяти узнавания [3; 4; 5]. При экспериментальном холестазе в головном мозге развиваются морфологические изменения [2].

Известно, что в выполнении многообразных функций мозга принимает участие поясная кора его больших полушарий, которая является переходной между изокортексом (молодой корой, неокортексом) и аллокортексом (старой корой, палеокортексом). Она является важной частью лимбической системы, которая отвечает за эмоции, обучение и память, и её нарушения могут быть связаны с когнитивным дефицитом, депрессией, бессонницей наблюдаемыми при холестазе [6]. Влияние экспериментального холестаза на неокортекс изучено в наших предыдущих исследованиях [7, 8, 9, 10]. При этом поясная кора осталась совершенно не изученной. Между тем её исследования могут помочь понять механизмы развития нейропсихических расстройств при этой патологии.

Целью настоящей работы явилась оценка содержания РНК и хроматофилии цитоплазмы нейронов поясной коры мозга крысы при холестазе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использованы 72 беспородные белые крысы самцы массой 225±25 грамм. Контрольных и опытных животных содержали в стандартных условиях вивария Гродненского государственного медицинского университета, в индивидуальных клетках со свободным доступом к воде и полноценной пище. Исследование проведено в соответствии с принципами биоэтики и требованиями Директивы Европейского Парламента и Совета № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей [Directive 2010]. Для моделирования подпеченочного холестаза использовали перерезку общего желчного протока (ОЖП) между двумя лигатурами на 2–3 мм ниже места слияния печеночных протоков по методу Л.С. Кизюкевича [11]. Выбор уровня перевязки/перерезки, обусловлен тем, что перевязка выше этого уровня может не приводить к полному холестазу, а ниже него в ОЖП впадают многочисленные протоки поджелудочной железы, перевязка которых приводит к развитию панкреатита и быстрой гибели всех животных [12]. Животным контрольной группы проводили ложную операцию (лапаротомию, с сохранением физиологического тока желчи. Тяжесть холестаза контролировали по результатам биохимического анализа крови животных (содержание билирубина, холестерина, жёлчных кислот) [13].

Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 суток после операции, в утренние часы опытных и контрольных животных синхронно выводили из эксперимента путем декапитации, предварительно усыпив парами эфира. Для исследования брали кусочки больших полушарий головного мозга, фиксировали их в жидкости Корнуа при +4ºС (на ночь), а затем обезвоживали и заключали в парафин. Фронтальные срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) и монтировали на предметные стекла. Препараты окрашивали по методу Ниссля (0,1 % водным раствором тионина) для анализа их цитоплазмы по степени хроматофилии, а также галлоцианин-хромовыми квасцами по методу Эйнарсона [15] для выявления содержания РНК. Для идентификации поясной коры использовали схемы стереотаксического атласа [16]. Морфометрию нейронов проводили в мелкоклеточном и крупноклеточном слоях поясной коры [17].

Для анализа цитоплазмы нейронов 2-го, мелкоклеточного и 5-го, крупноклеточного слоёв поясной коры по степени хроматофилии подсчитывали процент нормохромных (умеренная окраски цитоплазмы), гиперхромных (интенсивная окраска цитоплазмы), гиперхромных сморщенных (интенсивная окраска цитоплазмы и сморщенный перикарион), гипохромных (слабая окраска цитоплазмы) нейронов и клеток-теней (остатки цитоплазмы и ядра) [18].

Цитофотометрическое исследование содержание РНК проводили, определяя оптическую плотность полученного осадка хромогена в цитоплазме нейронов мелкоклеточного и крупноклеточного слоёв поясной коры, на максимуме поглощения окрашенных продуктов реакций. Относительное содержание вещества выражали в единицах оптической плотности.

Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование и морфометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), встроенной цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения Image Warp (BitFlow, США).

В результате морфометрических исследований получены количественные непрерывные данные. Их обрабатывали с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный номер AXAR207F394425FA-Q) с применением описательной статистики. Так как в эксперименте нами использовались малые выборки, которые не всегда имели нормальное распределение, анализ проводили методами непараметрической статистики [19]. Для каждого показателя определяли значение медианы (Me), значение нижнего квартиля (LQ), значение верхнего квартиля (UQ) и интерквартильного диапазона (IQR). Объекты исследования набирали в группы независимо друг от друга, поэтому сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test) [Реброва, 2003]. Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5 % (p<0,05; где р – критическое значение уровня значимости) [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ

У крыс при холестазе в мелкоклеточном слое поясной коры отмечается снижение количества нейронов с нормальной хроматофилией цитоплазмы (нормохромных) и увеличение количества патологических форм нейронов (гиперхромных, гиперхромных сморщенных, гипохромных и клеток-теней) (рис. 1). При этом встречаются случаи сателлитоза и нейронофагии.

 

1	1
7   3	5   5   4   5
1   4	6   2
Рис. 1. Нейроны 2-го (мелкоклеточного) слоя поясной коры мозга крысы на 5-е сутки (А) и 10-е сутки в контрольной группе (Б); 5-е сутки холестаза (В-Д), на 10-е сутки холестаза (Г-Е). 1-нормохромные; 2-гиперхромные; 3-гиперхромные сморщенные нейроны; 4-гипохромные нейроны, 5-клетки-тени, 6- сателлитоз, 7- нейронофагия. Окраска по методу Ниссля; х1000.
Fig. 1. Neurons of the 2nd (small cell) layer of the cingulate cortex of the rat brain on the 5th day (A) and 10th day in the control group (Б); 5th day of cholestasis (В-Д), on the 10th day of cholestasis (Г-Е). 1-normochromic; 2-hyperchromic; 3-hyperchromic shriveled neurons; 4-hypochromic neurons, 5-shadow cells, 6- satellitosis, 7- neuronophagy. Staining using the Nissl method; x1000.

 

При количественной оценке числа нейронов с разной хроматофилией цитоплазмы установлено, что в мелкоклеточном слое поясной коры на 2-е сутки после перевязки/перерезке ОЖП количество нормохромных нейронов достоверно уменьшается на 4,8 %. На 5-е сутки количество нормохромных нейронов мелкоклеточного слоя уменьшается на 14,0%, но при этом достоверно растет число гиперхромных (на 33,3%), гиперхромных сморщенных (на 53,8%), гипохромных (на 39,1%), клеток-теней (на 90%) (p≤0,05, при сравнении с опытной группой) (рис. 1 рис. 2).

На 10-е сутки холестаза в мелкоклеточном слое поясной коры наблюдается максимальное снижение нормохромных нейронов (на 17,5%). При этом увеличивается количество гиперхромных (на 73,5%), гиперхромных сморщенных (на 44,4%), клеток-теней на 90% (p≤0,05), при сравнении с контролем (рис. 1, рис. 2).

На 20-е сутки после перерезки ОЖП

1

происходит уменьшение нормохромных нейронов (на 16,6%), при этом возрастает количество гиперхромных (на 66,7%), гипохромных (на 38,1%), а клеток теней (на 69,2%) (p≤0,05, при сравнении с опытной группой).

Сутки	Контроль	Опыт
2-е
5-е
10-е
20-е
45-е
90-е

 

Рис. 2. Процентное содержание числа нейронов с разной хроматофилией цитоплазмы во 2-м, мелкоклеточном слое поясной коры.

Fig. 2. Percentage of the number of neurons with different cytoplasmic chromatophily in the 2nd, small cells layer of the cingulate cortex.

 

Через 45 суток после перевязки ОЖП гистологические изменения в нейронах поясной коры мелкоклеточного слоя частично, а через 90 суток - полностью нормализуются (рис. 2).

Через 2, 5, 10 и 20 суток после перевязки/перерезки общего желчного протока (ОЖП) обнаружено уменьшение содержания РНК в цитоплазме нейронов мелкоклеточного слоя поясной коры на 13,3%, 19,4%, 25,8% и 28,1%, соответственно, при сравнении с контрольными группами тех же сроков) (рис. 3, табл. 1).

 

Рис. 3. Содержание РНК в нейронах 2-го (мелкоклеточного) слоя поясной коры мозга крысы на 10-е сутки после операции в контрольной (А) и опытной группе (Б). Окраска по Эйнарсону; х1000.
Fig. 3. RNA content in neurons of the 2nd (small cell) layer of the rat cingulate cortex on the 10th day after surgery in the control (A) and experimental group (B). Einarson staining; x1000.

 

 Таблица 1. Изменения содержания РНК в нейронах мелкоклеточного 2-го слоя поясной коры крыс в динамике холестаза

Сутки	Контроль	Опыт
2-е	0,30 (0,29; 0,31)	0,26 (0,21; 0,31)***
5-е	0,31 (0,27; 0,34)	0,25 (0,21; 0,29)***
10-е	0,31 (0,28;0,34)	0,23 (0,20; 0,27)***
20-е	0,32 (0,30; 0,35)	0,23 (0,21; 0,25)***
45-е	0,29 (0,23; 0,34)	0,29 (0,23; 0,35)
90-е	0,28 (0,25; 0,32)	0,28 (0,23; 0,34)

Примечание: * – р < 0,05, ** – р < 0,01 *** – р < 0,001, при сравнении контролем того же срока.

 

При изучении 5-го, крупноклеточного слоя поясной коры при холестазе отмечено увеличение числа патологических форм нейронов, сателлитоз и нейронофагия (рис. 4).

 

1	1
2   3	5   4
54	6   4
Рис. 4. Нейроны 5-го (крупноклеточного) слоя поясной коры мозга крысы на 10-е сутки (А) и 20-е сутки в контрольной группе (Б); на 10-е (В-Д) и 20-е сутки холестаза (Г-Е). 1 – нормохромные; 2 -гиперхромные; 3 - гиперхромные сморщенные нейроны; 4- гипохромные нейроны, 5-клетки-тени, 6 - сателлитоз. Окраска по методу Ниссля. Увеличение Х 1000. Fig. 4. Neurons of the 5th (magnocellular) layer of the cingulate cortex of the rat brain on the 10th day (A) and on the 20th day in the control group (Б); on the 10th (В-Д) and 20th day of cholestasis (Г-Е). 1 – normochromic; 2 - hyperchromic; 3 - hyperchromatic shriveled neurons; 4 - hypochromic neurons, 5 - shadow cells, 6 - satellitetosis. Staining using the Nissl method. x 1000.

 

Число нейронов крупноклеточного слоя поясной коры с разной хроматофилией цитоплазмы при холестазе значительно меняется (рис. 5).

 

Сутки	Контроль	Опыт
2-е
5-е
10-е
20-е
45-е
90-е

Рис. 5. Процентное содержание числа нейронов с разной хроматофилией цитоплазмы в 5-м слое поясной коры.

Fig. 5. Percentage of the number of neurons with different cytoplasmic chromatophily in the 5th layer of the cingulate cortex.

На 5-е сутки холестаза количество нормохромных нейронов достоверно снижается на 14,0%, а количество гиперхромных сморщенных достоверно возрастает на 40% и гипохромных на 55,5% (рис. 5).

На 10-е сутки холестаза число нормохромных нейронов в этом слое уменьшено на 22,1% (рис. 5), при этом возрастает количество гиперхромных (на 78,8%), гиперхромных сморщенных (на 60%), гипохромных (на 83,3%) и клеток теней (на 75%) (p≤0,05, при сравнении с контролем) (рис. 5). На 20-е сутки холестаза число нормохромных нейронов крупноклеточного слоя снижено на 21,1%, а количество патологических форм увеличено: гиперхромных - на 47,5%, гиперхромных сморщенных - на 78,3%, гипохромных - на 75%, а клеток теней - на 92,3% (p≤0,05, при сравнении с контрольной группой) (рис. 5).

На 45-е сутки после перевязки/перерезки общего желчного протока количество нормохромных клеток достоверно снижено только на 9,5% (p≤0,05, при сравнении с контрольной группой), а число нейронов с нарушенной хроматофилией не отличается от контроля.

Через 90 суток после перевязки ОЖП гистологические изменения в нейронах поясной коры нормализуются, что хорошо заметно и при подсчете числа нейронов с различной хроматофилией цитоплазмы (рис. 5).

В цитоплазме нейронов крупноклеточного слоя поясной коры при холестазе установлено достоверное снижение содержания РНК: 5-е сутки - на 15,6%, на 10-е сутки - 27,3%, на 20-е сутки - на 23,3%,  на 45 сутки -  на 10,7% (рис. 6, табл. 2).

Через 90 суток после холестаза достоверных изменений в изученных нейронах 5-го крупноклеточного слоя поясной коры не выявлено (табл. 2).

 

Рис. 6. Содержание РНК в нейронах 5-го (крупноклеточного) слоя поясной коры мозга крысы в контрольной группе (А) и опытной группе (Б) на 20-е сутки опыта. Окраска по Эйнарсону. Увеличение х1000. Fig. 6. RNA content in neurons of the 5th (magnocellular) layer of the cingulate cortex of rats in the control group (A) and the experimental group (B) on the 20th day of the experiment. Einarson staining; x1000.

 

 

 

 

 

 

Таблица 2. Изменения содержания РНК в нейронах крупноклеточного, 5-го слоя поясной коры крысы в динамике холестаза

Сутки	Контроль	Опыт
2-е	0,30 (0,27; 0,33)	0,29 (0,26; 0,32)
5-е	0,32 (0,25; 0,37)	0,27 (0,23; 0,33)***
10-е	0,33 (0,29; 0,36)	0,24 (0,22; 0,29)***
20-е	0,30 (0,27; 0,32)	0,23 (0,20; 0,25)***
45-е	0,28 (0,25; 0,31)	0,25(0,24; 0,29)**
90-е	0,31 (0,24;0,37)	0,32(0,27; 0,36)

Примечание: * – р < 0,05, ** – р < 0,01 *** – р < 0,001, при сравнении показателей контрольную группу сравнивали с опытной того ж срока

ОБСУЖДЕНИЕ

У крыс с холестазом отмечается снижение числа нормохромных и увеличение числа патологических форм нейронов (гиперхромных, гиперхромных сморщенных, гипохромных и клеток-теней) в мелкоклеточном и крупноклеточном слоях поясной коры. Эти изменения достигают максимума на 10-20 сутки после перерезки ОЖП. Возрастание количества гиперхромных нейронов свидетельствует о функциональном напряжении и гиперфункции нейронов [18]. Появление гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней в изучаемых слоях поясной коры, отражает тяжесть их повреждения при холестазе, ведущем к необратимым нарушениям и их гибели, что было показано для неокортекса [2, 10].  

Нарушения морфофункционального состояния нейронов поясной коры крыс при холестазе проявляются в снижении содержания РНК на 2-е - 20-е сутки после перерезки ОЖП в мелкоклеточном слое и на 5-45 сутки в крупноклеточном слое. Это может приводить к снижению синтеза белков в клетке и свидетельствует об ограничении функциональных возможностей изучаемых нейронов в условиях холестаза. Возможно, выявленные изменения  нейронов поясной коры могут приводить к известным нарушениям функций головного мозга наблюдаемых при холестазе.

У выживших животных, в сохранившихся нейронах поясной коры на 45 - 90-е сутки после перевязки ОЖП хроматофилия цитоплазмы и содержание в ней РНК постепенно нормализуются. Это, вероятно, связано с устранением холестаза (что подтверждается биохимическим анализом крови животных), в связи с прорастанием обходных желчных протоков и восстановлением оттока желчи в 12-перстную кишку [2, 13]. Вместе с тем, это отражает высокие адаптационные возможности выживших нейронов поясной коры.

По изученным параметрам нейроны 2-го, мелкоклеточного слоя быстрее реагируют на холестаз и быстрее нормализуются после его исчезновения, по сравнению с нейронами 5-го, крупноклеточного слоя поясной коры. Такая закономерность не была обнаружена нами ранее, в нейронах разных слоёв неокортекса [2, 10].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

После перерезки ОЖП у крыс, по мере развития холестаза, среди нейронов мелкоклеточного и крупноклеточного слоя поясной коры уменьшается число нормохромных клеток и возрастает число нейронов с нарушениями хроматофилии цитоплазмы (гиперхромных, гиперхромных сморщенных, гипохромных и клеток-теней). Параллельно, в цитоплазме этих нейронов происходит снижение содержания РНК. Эти нарушения появляются на 2-5 сутки после операции, достигают максимума на 10-20 сутки, а затем постепенно нормализуются к 90 суткам.

Нейроны мелкоклеточного слоя (по изученным параметрам) быстрее реагируют на холестаз и раньше нормализуются после его исчезновения, по сравнению с нейронами крупноклеточного слоя поясной коры.

Об авторах

Татьяна Викторовна Климуть

Гродненский государственный медицинский университет, Гродно, Беларусь;

Автор, ответственный за переписку.
Email: klimuts@yandex.ru

аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии

Белоруссия, 230009, Республика Беларусь, г. Гродно, ул. Горького, 80

Анастасия Викторовна Заерко

Гродненский государственный медицинский университет

Email: wersall_91@mail.ru

кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии

Белоруссия, 230009, Республика Беларусь, г. Гродно, ул. Горького, 80

Сергей Михайлович Зиматкин

Гродненский государственный медицинский университет, Гродно, Беларусь;

Email: smzimatkin@mail.ru

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии

Белоруссия, 230009, Республика Беларусь, г. Гродно, ул. Горького, 80

Сергей Владимирович Емельянчик

Гродненский государственный университет имени Янки Купалы, Гродно, Беларусь

Email: semel@grsu.by
Белоруссия

Список литературы

Дополнительные файлы