Симпатобласты и их злокачественные потомки: клеточная мозаика нейробластомы

Полный текст

Резюме

Литературный обзор представляет собой комплексный анализ современных знаний о нейробластоме в контексте эмбрионального развития симпатоадреналовой системы. В работе прослеживается эволюция научных представлений о данной опухоли, начиная с первых описаний нейробластомы во второй половине XIX века и до наших дней. Обзор детально освещает концептуальные основы современного понимания нейробластомы как результата нарушения нормальной дифференцировки клеток нервного гребня. Особое внимание уделяется эмбриологическим аспектам развития симпатоадреналовой системы, включая процессы миграции клеток нервного гребня, их дифференцировки под влиянием внешних сигналов и формирования бипотенциальных симпатобластов, способных генерировать как нейрональные, так и мезенхимальные клеточные линии. Значительная часть обзора посвящена анализу клеточной гетерогенности нейробластомы, проявляющейся в существовании нейрональных клеток H-типа (адренергических) и адгезивных клеток C-типа (мезенхимальных). Авторы анализируют результаты современных исследований, сложности идентификации опухолевых клеточных популяций и говорят о необходимости использования валидированных видоспецифичных маркеров. Работа подчеркивает важность интеграции знаний о ключевых этапах эмбриогенеза с современными геномными технологиями для разработки более эффективных терапевтических стратегий лечения этой агрессивной опухоли у детей.

Ключевые слова

Нейробластома, нервный гребень, эмбриогенез, клеточная гетерогенность, симпатобласт.

 

Симпатобласты и их злокачественные потомки: клеточная мозаика нейробластомы

Нейробластома - наиболее распространенная экстракраниальная солидная опухоль у детей, и у большинства пациентов она диагностируется в возрасте до 10 лет [1, 2]. Возраст на момент постановки диагноза обратно коррелирует с прогнозом. Младенцы (<18 месяцев) имеют общую выживаемость 88%, а у некоторых наблюдается спонтанная регрессия (нейробластома стадии 4S) без терапевтического вмешательства [3, 4]. Общая выживаемость детей в возрасте от 18 месяцев до 12 лет составляет 49%, у подростков и молодых людей (старше 12 лет) этот показатель падает ниже 10%.

 

Исторические вехи

В качестве самостоятельной нозологической единицы нейробластома была описана в работах 1864–1865 годов [5]. А уже к 1910 г. было установлено её нейрогенное происхождение на основании наличия и гистологического сходства фибрилл опухолевых клеток с фибриллами симпатических ганглиев. Концепция дифференцировки появилась в 1920-х годах, благодаря работам, в которых была описана способность клеток нейробластомы дифференцироваться в зрелые нейроны [6]. Сравнивая нейрональные особенности первичных нейробластом и в рецидиве у одних и тех же пациентов, Cushing и Wolbach постулировали, что факторы окружающей среды влияют на дифференцировку опухолевых клеток [7]. Прямая связь между нейробластомой и дифференцировкой нейронов симпатического ганглия затем была установлена Potter и Parrish, которые сообщили о различных стадиях дифференцировки диссеминированной нейробластомы у мертворожденного ребенка [8]. Вышеизложенные ранние наблюдения особенно впечатляют, учитывая наше современное понимание нейробластомы как опухоли симпатоадреналовой системы. В наши дни накопленный массив данных свидетельствует о том, что прекращение нормальной дифференцировки по симпатоадреналовому пути некоторых участков нервного гребня способствует возникновению и развитию нейробластомы. Нарушение развития симпатоадреналовых клеток-предшественников объясняет многие биологические особенности нейробластомы, в том числе клеточную гетерогенность, спектр мутаций, спонтанную регрессию и реакцию на препараты, которые способны индуцировать дифференцировку опухолевых клеток [9]. Более века назад патологоанатомы впервые отметили, что в большинстве случаев опухолевые клетки напоминают незрелые клетки развивающихся тканей. В дальнейшем, идея о возможной связи между возникновением опухоли и задержкой дифференцировки клеток-предшественников легла в основу концепции возникновения неоплазий [10]. В настоящий момент для большого количества опухолей установлена обратная зависимость между дифференцировкой опухолевых клеток и прогнозом, что привело к разработке схем лечения, индуцирующих дифференцировку опухолевых клеток [11]. А многочисленные обширные исследования опухолевого генома, проведенные за последнее десятилетие, лишь укрепили утверждение о том, что некоторые виды опухолей являются результатом нарушения развития нормальных предшественников. Так, например, соматические мутации, нарушающие факторы транскрипции или сигнальные пути, важные для нормального развития, часто сочетаются с мутациями в онкогенах и генах-супрессорах. Точно так же широко распространены мутации в эпигенетических регуляторах, и считается, что они вносят дополнительный вклад в изменения эпигенетического ландшафта, что блокирует дифференцировку и способствует онкогенезу. Связь между нарушением дифференцировки и онкогенезом особенно распространена среди опухолей у детей [12]. Многие виды опухолей, характерные для детей, не встречаются у взрослых, поскольку возникают на определенной стадии развития. Например, ретинобластому обнаруживают только у детей младше 5 лет, поскольку она возникает во время внутриутробного развития сетчатки [13]. Кроме того, геномный ландшафт опухолей у детей менее сложен, чем у взрослых [14]. Этот факт позволяет предположить, что остановка дифференцировки в сочетании с онкогенными мутациями в соответствующей среде развития лежит в основе онкогенеза у младенцев, детей, подростков и молодых взрослых. И нейробластома является одним из наиболее ярких примеров, иллюстрирующих данную концепцию.

 

Эмбриогенез и нейробластома

Более века исследований молекулярных и клеточных механизмов эмбриогенеза заложили прочную основу для установления происхождения нейробластомы в процессе развития организма [15].  Как известно, симпатоадреналовый клон происходит из клеток нервного гребня, которые мигрируют из дорсальной части нервной трубки на ранних стадиях эмбриогенеза [16]. Клетки нервного гребня являются пролиферирующими плюрипотентными клетками-предшественниками, чьи варианты дальнейшей клеточной дифференцировки определяется расположением клеток вдоль ростро-каудальной оси развивающегося эмбриона (Рис. 1А). Так, например, в норме краниальный отдел нервного гребня дает начало хрящам и костям, тогда как крестцовый отдел дает начало кишечным нейронам. На дифференцировку клонов, происходящих из нервного гребня, могут влиять внутренние программы клетки, однако путь клеточной дифференцировки регулируется главным образом внеклеточными автономными сигналами [17]. Это подтверждается тем фактом, что при трансплантации клеток-предшественников из туловищного отдела нервного гребня в краниальный они будут давать начало клеткам мезенхимального (МЕЗ) происхождения, тогда как в обычных условиях эмбриогенеза клетки-предшественники туловищного отдела не продуцируют вышеописанные типы клеток [18]. И наоборот, клетки краниального отдела нервного гребня, которые никогда не образуют нейроны в обычных условиях, могут продуцировать весь симпатоадреналовый клон (симпатические нейроны, хромаффинные клетки, шванновские клетки, меланоциты) при их трансплантации в туловищный отдел нервного гребня [19]. Специализация нейронов, происходящих из нервного гребня, на холинергические и адренергические также может регулироваться внешними сигналами [20]. Как уже упоминалось выше, клетки симпатоадреналового клона продуцируются туловищным отделом нервного гребня, и их путь миграции коррелирует с дальнейшей специализацией клеток (Рис. 1Б), что еще раз подчеркивает важность внешних сигналов [21]. Это утверждение наглядно иллюстрирует процесс инициации специализации симпатоадреналового клона под действием костного морфогенетического белка (BMP; bone morphogenetic protein) путем усиления экспрессии SOX10, ASCL1, HAND2, GATA3, PHOX2B и др. транскрипционных факторов [22]. Наряду с этим, исследования прошлого десятилетия показали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), находящиеся в нише костного мозга, инициально происходят из клеток-предшественников туловищного отдела нервного гребня [23]. Все приведенные выше данные указывают на то, что симпатобласты из туловищного отдела нервного гребня бипотенциальны и могут генерировать как нейрональные, так и мезенхимальные типы клеток (Рис.2.). Миграция клеток нервного гребня завершается на 10,5 день эмбрионального развития (ДЭР) у мышей и на 40-й день после зачатия (ДПЗ) у людей. В туловищном отделе нервного гребня есть две перекрывающиеся волны миграции клеток, и симпатоадреналовая линия возникает во время первой волны (8,5–9,5 ДЭР у мышей и 27–30 ДПЗ у людей) [24]. Это важно, потому что большинство исследований по специализации и дифференцировке симпатоадреналовых клонов сосредоточено на стадиях развития уже после миграции симпатобластов из нервного гребня (Рис. 2). Например, исследование Furlan et al., которое показало, что предшественники шванновских клеток (ПШК) дают начало хромаффинным клеткам, было проведено на 11,5–15,5 (ДЭР) у мышей, а аналогичное исследование Jansky et al. было выполнено на надпочечниках плода человека на 50–120 (ДПЗ) [25, 26]. Вегетативная нервная система состоит из холинергических преганглионарных нейронов, происходящих из ЦНС, холинергических постганглионарных нейронов и адренергических нейронов, происходящих из нервного гребня. Стоит отметить, что хромаффинные клетки мозгового вещества надпочечников также являются адренергическими клетками, происходящими из нервного гребня, но они не формируют дендриты или аксоны, как другие вегетативные нейроны. Хромаффинные клетки стимулируются либо кратковременным и высоким уровнем ацетилхолина, либо постоянным воздействием полипептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза (PACAP), кодируемого геном ADCYAP1. Несмотря на то что для нейробластом характерны высокие уровни ферментов биосинтеза катехоламинов, в части случаев обнаруживаются ферменты биосинтеза нейропептида PACAP и ацетилхолина. Таким образом, остается открытым вопрос, отражает ли эта изменчивость секреции нейротрансмиттеров симпатоадреналовое или хромаффинное происхождение нейробластом. Помимо периферических вегетативных нейронов симпатобласты нервного гребня способны давать начало предшественникам шванновских клеток [15, 25]. ПШК – это мультипотентные клетки-предшественники, которые способны дифференцироваться в шванновские клетки, а также меланоциты и мезенхимальные клетки (фибробласты и миофибробласты) (Рис.2) [27]. Иными словами, симпатобласты способны продуцировать как нейрональные, так и мезенхимальные клетки во время нормального эмбрионального развития [25]. Лабораторные исследования, направленные на изучение генетического происхождения клеточных популяций у мышей, показали, что основным источником хромаффинных клеток в мозговом веществе надпочечника является предшественники шванновских клеток и этот процесс происходит в конце эмбрионального развития (11,5 – 14,5 ДЭР). Аналогичные результаты были получены в ходе РНК-секвенирования одиночных клеток надпочечников плода человека [26, 28]. Таким образом, хромаффинные клетки имеют два источника: ранний – из симпатобластов, поздний – из ПШК [15, 25]. Дифференцировка хромаффинных клеток из ПШК сопровождается нарастающим подавлением экспрессии генов ПШК (SOX10 и FOXD3) и активацией экспрессии генов хромаффинных клеток (PHOX2B, ASCL1 и TH) в «мостовом» клеточном состоянии [25]. В то же время процесс развития хромаффинных клеток из симпатобластов начинается с эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) и заканчивается мезенхимально-эпителиальным переходом (МЭП) с восстановлением клеточной полярности и клеточных контактов [16]. Это особенно актуально для нейробластомы, так как ЭМП и МЭП, связанные с нормальным развитием симпатоадреналовой системы, могут играть роль в меж- и внутриопухолевой гетерогенности, в способности к метастазированию, влиять на прогноз.

 

Нейрональные и мезенхимальные особенности нейробластомы

Первое упоминание, что нейробластома демонстрирует клеточную неоднородность, отражающую гетерогенность симпатоадреналовой системы, было опубликовано после исследований на клеточных линиях нейробластомы. В начале 1980-х годов были разработаны методы получения первичных клеточных культур из образцов опухоли пациента и генерации иммортализованных клеточных линий [29]. Но несмотря на ограниченную доступность молекулярных методов уже в то время было установлено, что в культурах нейробластомы присутствуют по меньшей мере 2 клеточных фенотипа. Нейрональные клетки (Н-тип) нейробластомы имеют черты нейронов симпатоадреналовой линии – начиная от экспрессии специфичных нейрофиламентов и заканчивая клеточной дифференцировкой и секрецией нейротрансмиттеров. Адгезивные к субстрату (С-тип) клетки нейробластомы первоначально были определены на основе их уплощенной формы и способности прикрепляться к субстрату в культуре. Позднее было обнаружено, что эти клетки экспрессируют гены и белки (например, виментин), обнаруженные в мезенхимальных производных нервного гребня [29]. В течение последующих десятилетий исследования клеточных линий нейробластомы продолжались, и сообщалось, что клетки С-типа имеют молкулярные признаки шванновских клеток, меланоцитов, производных эктомезенхимы и гладких мышц [30-33]. Однако было неизвестно, отражают ли эти различные клеточные фенотипы внутри- или межопухолевую гетерогенность или же это артефакт, возникающий в результате изменений микроокружения при культивации клеточной линии из опухоли. Равным образом, было трудно доказать, что клетки С-типа в опухолях пациентов были злокачественными, поскольку в нейробластоме часто присутствуют незлокачественные шванновские клетки и мезенхимальные клетки микроокружения опухоли. Сложность разделения незлокачественных клеток микроокружения опухоли от злокачественных клеток с мезенхимальным фенотипом остается проблемой [27]. Данные многочисленных исследований клеточных линий нейробластомы указывают на то, что существует по крайней мере два типа клеток нейробластомы. Клетки с нейрональным фенотипом, относящиеся к H-типу или адренергическому (АДР) типу, и клетки, которые не являются нейрональными и относятся к С-типу или мезенхимальному типу. Точная клеточная идентичность последнего типа клеток до сих пор остается неясной, однако они имеют сходство с рядом ненейрональных производных нервного гребня. Оба типа клеток могут существовать в пределах одной опухоли, к тому же он могут взаимно преобразовываться в культуре in vivo [34, 35]. Подобное взаимное преобразование может отражать как процесс образования разных типов клеток из шванновских клеток-предшественников на поздних этапах эмбриогенеза, так и возможную бипотенциальность симпатобластов нервного гребня. Также имеются сообщения о клетках промежуточного типа, которые могут быть предшественниками как для АДР-клеток, так и для МЕЗ-клеток во время нормального развития [29].

 

Связь клеточной гетерогенности нейробластомы и симпатоадреналового развития

 

Несмотря на важные достижения и открытия в понимании клеточной гетерогенности нейробластомы, нельзя отрицать, что могут существовать дополнительные популяции клеток, которые еще только предстоит идентифицировать. Анализ суммарной РНК из разных образцов нейробластомы показал, что большинство опухолей имеют смешанные клеточные популяции, однако пока не очень ясно, какая часть этих популяций приходится на неопухолевое микроокружение. Точно так же невозможно разделить клеточные популяции с экспрессией генов МЕЗ- и АДР-клеток от популяции с гибридным профилем экспрессии генов МЕЗ/АДР. Наконец, неизвестно, смешаны ли эти популяции внутри опухоли или же они имеют некие четкие компартменты [9]. Чтобы ответить на некоторые из этих вопросов, независимые группы исследователей провели оценку профиля экспрессии генов отдельных клеток нейробластомы и симпатоадреналовых клеток у эмбрионов [19, 28, 36 - 38]. На сегодняшний день было проведено параллельное исследование профиля экспрессии генов в образцах опухоли, человеческих эмбрионов, фетальных и постнатальных надпочечников. В одной из работ, проведённой Dong et al., исследователи выполнили РНК-секвенирование единичных клеток (scRNA-seq) на эмбрионах человека (4 недели после зачатия), надпочечниках плода (8–14 недель после зачатия) и образцах нейробластомы, локализованных рядом с надпочечниками. При сравнении данных, полученных в результате РНК-секвенирования всех образцов, исследователи пришли к выводу, что большинство опухолевых клеток напоминают развивающиеся хромаффинные клетки [36]. Однако независимый повторный анализ данных показал, что авторы ошиблись, поскольку не учли межвидовые различия [18, 39, 40]. В частности, Dong et al. на основе данных о развитии надпочечников у мышей использовали в качестве маркера симпатобластов ген CARTPT, который экспрессируется в симпатобластах у мышей, а у человека в хромаффинных клетках [36, 41]. Этот опыт подчеркивает важность использования хорошо проверенных и надежных видоспецифичных маркеров для идентификации типов клеток.

В работе других авторов были применены сразу несколько подходов для сравнения данных РНК-секвенирования единичных клеток образцов нейробластомы и надпочечников плода человека. Было обнаружено, что опухолевые клетки (всего было проанализировано 3396 клеток) больше всего напоминают АДР клетки. В мозговом веществе фетального надпочечника авторы идентифицировали ПШК, переходные клетки, хромаффинные клетки и симпатобласты [28]. Дальнейший анализ массива данных РНК-секвенирования 650 нейробластом методом TARGET (therapeutically applicable research to generate effective treatments - терапевтически применимое исследование для разработки эффективных методов лечения) подтвердил наличие экспрессии маркеров, характерных для АДР клеток, во всех опухолях. В третьем исследовании, опубликованном лабораторией Schlisio, было проанализировано 11 нейробластом (около 3212 клеток) с использованием технологии SMART-seq2 [18]. В исследуемой когорте авторы идентифицировали две отдельные группы опухолевых клеток. Клетки первой группы экспрессировали PDGFRA и профилем экспрессии напоминали МЕЗ-клетки клеточных линий нейробластомы, вторая группа напоминала АДР-клетки. Причем было установлено, что образцы нейробластомы высокого риска характеризовались меньшей экспрессией нейрональных маркеров. Хотя в исследовании были обнаружена популяция, напоминающая МЕЗ-клетки, авторы пришли к выводу, что не существует опухолевых клеток, имитирующих ПШК эмбриона. Это подчеркивает проблему в области точной идентификации МЕЗ-клеток [19]. Наконец, в последнем исследовании, проведенном в лаборатории Westermann, был выполнен транскриптомный анализ ПШК, хромаффинных клеток, переходных клеток и симпатобластов, выделенных из фетального надпочечника человека. Наибольшую пролиферативную активность имели ПШК и симпатобласты. Все 14 нейробластом, проанализированных в этом исследовании, имели злокачественные клетки с АДР-профилем, а 3 образца помимо этого дополнительно имели субпопуляцию клеток с МЕЗ-профилем. Авторы предположили, что опухолевые МЕЗ-клетки нейробластомы больше всего напоминают переходные клетки [26]. Однако эти факты не позволяют однозначно оценить опухолевые популяции и понять динамику их развития. Возможно, ожидание, что опухолевые клетки будут точно воспроизводить генетические программы нормальных клеток, является ошибочным. Поскольку известно, что в других опухолях нейронального происхождения клетки могут иметь гибридный профиль экспрессии генов, который не существует в норме [42].

Заключение

Представленный анализ демонстрирует фундаментальную роль нарушений эмбрионального развития в патогенезе нейробластомы, подтверждая концепцию онкогенеза как следствия блокированной дифференцировки клеток-предшественников. Понимание эмбриологических основ формирования симпатоадреналовой системы и механизмов клеточной гетерогенности нейробластомы открывает новые перспективы для разработки таргетных терапевтических подходов, основанных на индукции дифференцировки опухолевых клеток. Современные методы одноклеточного анализа позволяют более точно охарактеризовать клеточные популяции нейробластомы, однако остаются нерешенными вопросы идентификации всех субпопуляций опухолевых клеток и понимания динамики их взаимопревращений. Дальнейшие исследования молекулярных механизмов, контролирующих дифференцировку симпатоадреналовых предшественников, критически важны для разработки более эффективных стратегий лечения этой агрессивной педиатрической опухоли. Интеграция знаний о нормальном эмбриогенезе с современными геномными технологиями представляет наиболее перспективное направление для углубления понимания биологии нейробластомы и трансляции этих знаний в клиническую практику.

Об авторах

Дмитрий Михайлович Коновалов

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия; Федеральное государственное дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия.

Email: dmk_nadf@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7732-8184
SPIN-код: 4037-8636

кандидат медицинских наук, доцент, заведующий патологоанатомическим отделением

Россия, Российская Федерация, 117198,г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1; Российская Федерация, 125993, г. Москва, ул. Баррикадная, дом 2/1, строение 1

Анастасия Сергеевна Шарлай

Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева

Email: stacysharlay@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5354-7067
SPIN-код: 9720-5686

врач-лабораторный генетик патологоанатомического отделения 

Россия, 117198, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.

Павел Евгеньевич Трахтман

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: pavel.trakhtman@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-0231-1617
SPIN-код: 8135-1761

доктор медицинских наук, доцент, заведующий отделением трансфузиологии, заготовки и процессинга гемопоэтических стволовых клеток (Группа заготовки компонентов крови). 

Россия, 117198, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.

Список литературы

Дополнительные файлы