IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE NEURONS OF RAT VENTROMEDIAL AND DORSOMEDIAL HYPOTHALAMIC NUCLEUS

全文:

Введение. Гипоталамус является наиболее важным интегратором вегетативной и эндокринной регуляции и отвечает за рост, развитие, репродуктивную функцию и метаболизм. Вентромедиальное (ВМЯ) и дорсомедиальное (ДМЯ) ядра гипоталамуса являются критичными для регулирования трофики и поддержания гомеостаза энергии всего тела [3, 10]. В составе ВМЯ выделяют периферическую (shell) и центральную (core) зоны, которую, в свою очередь, подразделяют на дорсомедиальную (ВМДМ), центральную (ВМЦ), вентролатеральную (ВМВЛ) области. ДМЯ подразделяют на дорсальную (ДМД), компактную (ДМК) и вентральную (ДМВ) области [8]. Оксид азота (NO) представляет собой внутри-и межклеточный медиатор, который выполняет различные функции сигнализации [2, 5]. Как у взрослых, так и у новорожденных мышей экспрессия фермента синтеза NO - нейрональной синтазы оксида азота (nNOS) в значительной степени ограничивается областями гипоталамуса, которые участвуют в контроле таких функций организма, как энергетический баланс и размножение [3, 4]. Кальбиндин массой 28 килодальтон (КБ) является кальций-связывающим белком, а также кальциевым сенсором [9]. КБ селективно выявляется в отдельных популяциях центральной и перферической нервной системы, в том числе и в гипоталамических ядрах [6]. Цель работы - определение локализации, процентного содержания и морфометрических характеристик иммунопозитивных (ИП) нейронов к nNOS и КБ в ВМЯ и ДМЯ ядрах гипоталамуса крысы при помощи иммуногистохимических методов. Материал и методы. Работа выполнена на пяти 3-4-месячных крысах-самках линии Вистар. Исследование проводилось с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На проведение исследования получено разрешение этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (№ 29 от 21.02.2019 г.). После введения летальной дозы уретана (3 г/кг внутрибрюшинно) животных перфузировали транскардиально раствором стандартного фоcфатноcолевого буфеpа (PBS, 0,01М, pH 7,4) (БиолоТ, Россия), затем 4 % pаcтвоpом паpафоpмальдегида (Sigma, США) на PBS. После перфузии головной мозг извлекали и иссекали участок гипоталамуса, содержащий ВМЯ и ДМЯ согласно координатам атласа мозга крыс [9], после чего помещали в ту же фиксирующую смесь, в которой производили перфузию, на 1-2 ч. Серии срезов толщиной 12 мкм изготовляли на криостате. Для выявления нейронов, содержащих nNOS, использовали первичные антитела козы (Abcam, США, разведение 1:300), для идентификации КБ - антитела кролика (Abcam, США, разведение 1:500), вторичные антитела осла против козы или кролика были конъюгированы с флюорохромом флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC, разведение 1:100, Jackson Immunoresearch, США), дающим зеленую флюоресценцию. Негативные контроли проводили с отсутствием первичных или вторичных антител. Для расчета доли иммунопозитивных нейронов производили мечение всей нейронной популяции красителем Neuro Trace Red, который является селективным красителем нейронального вещества Ниссля (Molecular Probes, США, разведение 1:500) с красной флюоресценцией. Анализ препаратов проводили на флюоресцентном микроскопе Olympus BX43 (Токио, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCDкамерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Для анализа размеров и процентного соотношения иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Долю иммунопозитивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов, которое принимали за 100 %. Анализу подлежали нервные клетки, в которых срез прошел через ядро. Для определения площади сечения нейронов в случайном порядке брали 100 нейронов, иммунопозитивных к каждому из исследованных маркеров в каждой возрастной группе. Проводили количественную оценку интенсивности флюоресценции. Она определялась в условных единицах яркости от черного (0) до белого цвета (255) также при помощи программы Image J. Математическая обработка данных проведена с использованием пакета прикладных программ Sigma Plot (StatSoft, USA). Все величины представлены как средняя арифметическая ± ошибка среднего (М±m). Значимость различий средних величин определяли по методикам ANOVA, критериям Вилкоксона и Манна-Уитни. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты исследования. Результаты показали, что ВМЯ и ДМЯ являются гетерогенными по нейрохимическому составу. Иммунофлюоресценция к КБ и nNOS различалась в отдельных областях ВМЯ и ДМЯ (рисунок). Интенсивно флюоресцирующие КБ-ИП-нейроны выявлялись во всех областях ДМЯ. Наибольший процент интенсивно флюоресцирующих КБ-ИП-нейронов обнаруживался в ДМЯ в вентральной области ядра (табл. 1, 2). В ВМЯ КБ-ИП-нейроны имели слабую флюоресценцию (см. табл. 1). При этом их наибольшее процентное содержание отмечалось в вентролатеральной области (p<0,05). В дорсомедиальной и центральной областях процент КБ-ИП был очень низким. nNOS-ИП-нейроны определялись во всех областях ДМЯ и ВМЯ с низкой интенсивностью флюоресценции (см. табл. 1, 2, рисунок). При этом в обоих ядрах процент nNOS-ИП-нейронов был выше по сравнению с КБ-ИП. Нейроны ВМЯ и ДМЯ ядер имели небольшие размеры, на срезах тела нейронов имели круглую и овальную форму. Средняя площадь сечения КБ-ИП-и nNOS-ИП-клеток в ВМЯ и ДМЯ не отличалась от иммунонегативных нейронов (p>0,05, табл. 3). Обсуждение полученных данных. В результате проведения настоящего исследования получены данные о локализации и морфологических особенностях КБ-ИП-и nNOSИП-нейронов в ВМЯ и ДМЯ. КБ-ИП-и nNOSИП-нейроны выявлялись в обоих ядрах, при этом степень отличалась в различных областях ядер. Наибольший процент КБ-ИП-нейронов отмечался в ВМЯ в вентролатеральной области, а в ДМЯ - в вентральной. В обоих ядрах процент nNOS-ИП-нейронов был значимо выше по сравнению с КБ-ИП. Полученные нами результаты соответствуют литературным данным, полученным на мышах [4, 6]. Ионы Ca2+ и NO являются универсальными внутриклеточными посредниками и играют важную роль в регуляции разнообразных нейрональных процессов. NO является универсальной сигнальной молекулой, которая может модулировать активность нейронов различными способами: как внутриклеточный мессенджер, работающий на уровне отдельного синапса, или передача сигнала диффузного типа [2, 5]. КБ выполняет функцию не только кальциевого буфера, но и кальциевого сенсора [9]. Среди факторов, регулирующих развитие синапсов и их пластичность, важное значение имеет поддержание определенной концентрации ионов Ca2+, которое может изменяться в пространстве и во времени, и важная роль в этом отводится КБ [1, 7]. Заключение. Таким образом, нейроны ядер гипоталамуса ВМЯ и ДМЯ, ответственные за регуляцию обмена веществ и энергии в организме, содержат КБ и nNOS. В свою очередь, ВМЯ и ДМЯ являются гетерогенными по своему нейрохимическому составу. Источник финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 19-15-00039). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: П. М. М. Сбор и обработка материала: К. Ю. М. Статистическая обработка данных: А. И. Е. Анализ и интерпретация данных: А. И. Е. Написание текста: П. М. М. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

作者简介

K. Moiseev

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

A. Emanuylov

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

P. Maslyukov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: mpm@ysmu.ru
Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

参考

补充文件