AGE-RELATED CHARACTERISTICS OF OLFACTORY BULB ASTROCYTES REACTION TO THE ADMINISTRATION OF CAPSAICIN

Full Text

Введение. В последние десятилетия активно изучается так называемый «взрослый нейрогенез», происходящий в определенных участках центральной нервной системы [2, 9]. Традиционно зонами активного нейрогенеза считаются субвентрикулярная и субгранулярная зона гиппокампа [15, 18]. Однако ряд исследователей полагают, что при токсическом, травматическом или ишемическом воздействии нейрогенез активируется в так называемых «вторичных стволовых нишах», одной из которых является центральная часть обонятельной луковицы, где оканчивается ростральный миграционный поток, связывающий ее с субвентрикулярной зоной [2, 8, 18]. В этой связи актуальными являются исследования возрастных особенностей компенсаторноприспособительных реакций нейронов и глии потенциальных вторичных стволовых ниш. Помимо трофической и опорной функции, астроциты обеспечивают миграцию нейрональных предшественников из стволовых ниш к месту назначения и фагоцитоз погибших клеток, иными словами, являются морфологическим субстратом пластичности [2, 8, 10, 15, 16]. Исследования, посвященные реактивному глиозу, развивающемуся при ишемии или токсических воздействиях, довольно многочисленны [8, 13, 16]. Однако возрастные особенности реакции нейроглии и её зависимость от интенсивности нейрогенеза практически не изучены. В литературе традиционно описывается воздействие капсаицина на афферентные безмиелиновые волокна и нейроны ганглиев спинномозговых и черепных нервов [1, 5, 7, 12] путем блокировки выработки вещества P и кальцитонин-ген-связывающего белка, что ведёт к гибели чувствительных нейронов в первые 5-7 сут после эксперимента, а затем к нарастающей вторичной гибели нейронов. Явления длительной (до 180 сут после введения капсаицина) транснейрональной дегенерации обнаружены в области ядер спинного мозга, ядер продолговатого мозга, автономных узлов [1, 5, 7, 12, 17]. Выраженность нейродегенерации носит волнообразный характер и зависит, в первую очередь, от дозы капсаицина. Дозировки до 10 мг/ кг оказывают деафферентирующее, до 50-70 мг/ кг - аналгезирующее, а свыше 100 мг/кг - общетоксическое действие [1, 5, 7, 9, 12]. Эти особенности капсаицина позволяют использовать его для достижения цели исследования. Цель работы - сравнить реакцию астроцитов обонятельной луковицы на введение нейротоксина на различных этапах постнатального онтогенеза крыс с позиций оценки реактивного глиоза и миграции нейрональных предшественников. Материал и методы. Работа выполнена на 70 самцах крыс линии Вистар. Контроль включал 30 крыс в возрасте 30, 60, 90, 180, 210 и 240 сут по 5 особей в каждой возрастной группе. Согласно классификации И. П. Западнюка [4], 30-е сутки соответствуют инфантильному возрасту, 60-90-е сутки - ювенильному, 180-240-е сутки - зрелому возрасту. Последний взят в качестве контрольной точки для определения дефинитивных показателей в конце эволютивного периода. В экспериментальные группы вошли 20 крыс в возрасте 30 сут (1-я группа) и 20 крыс в возрасте 180 сут (2-я группа). Капсаицин вводили крысам трёхкратно с интервалом в 1 сут. Инъекцию производили подкожно в дозировке 30, 30 и 60 мг/ кг массы тела соответственно, суммарная доза составляла 120 мг/кг [6]. Выбор схемы обусловлен данными работы В. И. Филимонова и М. Н. Невзоровой [9], установивших, что подкожное введение таких доз капсаицина приводит к гибели части митральных клеток обонятельной луковицы, истончением ее слоев и изменениям стенки капилляров. Введение капсаицина тремя дозами обосновано тем, что быстрое введение больших доз капсаицина может вызывать отек легких, а также местный некроз из-за спазма капилляров. Первые две дозы по 30 мг/кг вводили под кожу бедра, третью (60 мг/ кг) - под кожу холки [1, 7, 9]. Такая схема введения позволяет избежать развития осложнений. Капсаицин растворяли в смеси 10 % ТВИН-80, 10 % этанола и 80 % изотонического раствора NaCl [1, 5, 7, 9, 12]. Животных выводили из эксперимента на 15-, 30-, 60-е сутки от начала эксперимента путём декапитации после уретанового наркоза в дозировке 300 мг/кг массы тела. На каждую временную точку в экспериментальной группе приходилось по 5-7 животных. Крысы содержались в стандартных условиях вивария [14]. Эксперимент был одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО ЯГМА Минздрава России и выполнен в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г. Взятие гистологического материала осуществляли после фиксации 10 % забуференным формалином в течение 24 ч при 4 ºС. Исследование проводили на парафиновых парасагиттальных серийных срезах мозга крыс, проходящих через центральную часть обонятельной луковицы. Маркер зрелых нейронов NeuN выявляли с помощью поликлональных кроличьих антител (ab177487, UK, разведение 1:500) [3]. Данную реакцию использовали в качестве критерия эффективности нейротоксического воздействия [1, 3, 7, 17]. Маркер зрелых астроцитов GFAP выявляли с помощью поликлональных кроличьих антител (ab16997, UK, разведение 1:200) [6]. Использовали вторичные антитела (Goat anti Rabbit IgG, ab97051, UK, разведение 1:1000). Детекцию пероксидазы производили диаминобензидиновым хромогеном DAB Substrate Kit (ab64238). Срезы докрашивали гематоксилином Майера. Анализ срезов производили при помощи светового микроскопа Optica DM-20 (Italy, 2015) со встроенной камерой. На каждом срезе в 50 полях зрения оценивали численную плотность (ЧП) распределения зрелых нейронов, ЧП астроцитов (шт./мм2) и среднюю площадь отростков (ПО) астроцитов (мкм2). NeuN выявляли в перинуклеарной цитоплазме и ядре зрелых интактных нейронов [3], кислый фибриллярный белок астроцитов GFAP - в цитоплазме и отростках астроцитов [6, 8, 10, 13]. Астроциты определяли как клетки округлой или полигональной формы со светлым ядром и с 3-5 извитыми ветвящимися отростками. ЧП астроцитов, учитывая выраженные различия их распределения в слоях, оценивали отдельно в каждом слое обонятельной луковицы и ростральном миграционном потоке (РМП). Статистическую обработку полученных количественных данных выполняли с применением программы Microsoft Excel 2010, вычисляя для каждого измеряемого параметра среднюю величину и ее стандартное отклонение. Значимость различий при нормальном распределении данных в выборке оценивали, применяя критерий Стьюдента. При распределении, отличном от нормального, использовали непараметрический критерий Уилкоксона. Различия считали значимыми при p<0,05. Результаты исследования. В обонятельной луковице (ОЛ) выделяют шесть концентрически расположенных слоёв: волокон обонятельного нерва, гломерулярный (клубочковый), наружный плексиформный (сетчатый), митральный, внутренний плексиформный и гранулярный (зернистый), а также центральную часть ОЛ, которая является дистальным окончанием РМП. ЧП NeuN-позитивных нейронов имеет свои топографические и возрастные особенности, но, в целом, стабилизируется к зрелому возрасту (180-е сутки) (рис. 1, табл. 1). У интактных животных в РМП астроциты распределены на всем протяжении среза, их отростки направлены по ходу движения нейрональных предшественников и образуют многочисленные контакты (рис. 2, а). ЧП астроцитов у крыс 30 сут составляет 422±42,5 шт./мм2, затем с 30-х по 90-е сутки уменьшается в 2,3 раза, с 90-х по 180-е сутки - увеличивается до 325±31,4 шт./мм2, далее не изменяется (табл. 2). В зернистом слое астроциты располагаются между группами нейронов, их отростки проникают как внутрь таких групп, так и ветвятся в пространстве между ними. ЧП астроцитов у крыс в возрасте 30 сут равна 269±20,2 шт./ мм2, с 30-х по 60-е сутки - уменьшается на 40 %, к 90-м суткам - не изменяется, ак 180-м суткам - увеличивается до 173±16,6 шт./мм2, оставаясь на этом уровне до 240-х суток (см. рис. 2, в). В наружном плексиформном слое астроциты распределены равномерно (см. рис. 2, д). С 30-х по 60-е сутки их ЧП уменьшается с 295±35,33 шт./ мм2 в 2 раза (p<0,05), ак 90-м суткам увеличивается до значений, близких к исходным, и не изменяется до конца наблюдения (p<0,05). В гломерулярном слое астроциты можно чётко разделить на пери-и юкстагломерулярные. Отростки перигломерулярно расположенных глиальных клеток проникают вглубь клубочка, их тела встроены в слои клубочков. Тела юкстагломерулярных глиальных клеток расположены между клубочками, отростки ветвятся между клубочками и проникают в них. Показатель численной плотности астроцитов на 30-е сутки составляет 269±20,2 шт./ мм2, до 60-х суток достоверно не изменяется, к 90-м суткам снижается на 30 %, к 180-м суткам возрастает до 375±32,2 шт./мм2, в 2 раза, и остается на этом уровне до 240-х суток (см. табл. 2). В слое волокон обонятельного нерва астроциты не определяются. Показатель площади распределения отростков зависит от возраста животного и слоя ОЛ. Так, медианная площадь распределения отростков в РМП с 30-х по 180-е сутки увеличивается на 43 % до 583,2 мкм2. В гранулярном слое с 30-х по 90-е сутки медианная площадь максимальна, на 180-е сутки происходит уменьшение площади распределения отростков почти в 2 раза до 339,7 мкм2. В наружном плексиформном слое c 30-х по 60-е сутки наблюдается увеличение площади на 36 % до 513,4 мкм2, а на 180-е сутки - уменьшение на 16 % (p<0,05). Площадь распределения отростков в гломерулярном слое увеличивается с 30-х до 90-х суток в 2 раза, пик увеличения приходится на 90-е сутки, когда медианная площадь достигает 544,8 мкм2. На 180-е сутки площадь уменьшается в 1,4 раза, после чего стабилизируется и к 240-м суткам не изменяется. В целом, площадь распределения отростков астроцитов и их ЧП с возрастом изменяются разнонаправленно. Показатели ЧП и ПО достигают дефинитивного уровня к 180-м суткам и в последующие сроки стабилизируются. В обеих экспериментальных группах после введения капсаицина ЧП NeuN-позитивных нейронов в сравнении с контрольной группой уменьшается во всех слоях ОЛ (см. рис. 1, табл. 1). Пик токсического повреждения приходится на 15-30-е сутки эксперимента. Более всего снижение выражено в гранулярном слое и составляет до 70 % по отношению к возрастной норме у 30-суточных животных и до 20 % по отношению к возрастной норме у 180-суточных животных. Снижение ЧП зрелых нейронов в эксперименте у взрослых крыс выражено значительно меньше, чем у крыс в инфантильном возрасте (20 % против 70 %). В экспериментальных группах характер распределения GFAP в астроцитах не изменяется (см. рис. 2). Сохраняется позитивность к GFAP как в телах астроцитов, таки вих отростках. При введении нейротоксина в 1-й группе животных на 30-е сутки эксперимента ЧП GFAP-позитивных астроцитов в РМП увеличивается в 1,5 раза, превышая возрастной контроль в 4,5 раза. К 60-м суткам эксперимента она значимо снижается по сравнению с показателем на 45-е сутки, но остается в 4 раза больше в сравнении с контрольной группой (см. рис. 2, а, б). В гранулярном слое ЧП астроцитов к 30-м суткам эксперимента увеличивается в 1,3 раза и до 60-х суток не изменяется. В конце наблюдения на 60-е сутки она остается в 2,3 раза большей, чем в контрольной группе (см. рис. 2, в, г). В наружном плексиформном слое к 30-м суткам эксперимента ЧП возрастает в 1,5 раза (становится в 2 раза больше, чем в контроле), ак 60-м суткам уменьшается до значений в контрольной группе (см. рис. 2, д, е; табл. 2). В гломерулярном слое к 30-м суткам эксперимента ЧП астроцитов увеличивается в 1,4 раза по сравнению с начальным уровнем и превосходит контроль в 1,5 раза, ак 60-м суткам уменьшается, но остаётся на 22 % больше, чем в контроле. Введение капсаицина животным зрелого возраста (180-е сутки) приводит к гибели до 20 % зрелых нейронов (см. табл. 1), а также - астроцитов. В РМП ЧП астроцитов увеличивается к 30-м суткам эксперимента в 1,8 раза, к 60-м суткам - уменьшается, при этом оставаясь больше возрастной нормы на 54 %. В гранулярном слое ЧП астроцитов к 30-м суткам эксперимента увеличивается на 77 %, не изменяется до 60-х суток, сохраняясь на уровне, в 1,5 раза превосходящем контроль (см. табл. 2). В наружном плексиформном слое к 30-м суткам эксперимента ЧП астроцитов также возрастает в 2 раза, к 60-м суткам не изменяется и превышает нормальный возрастной показатель в 2 раза. В гломерулярном слое к 30-м суткам эксперимента ЧП астроцитов увеличивается в 1,8 раза, к 60-м суткам не изменяется, оставаясь на 70 % больше по сравнению с контролем (p<0,05) (см. табл. 2). Динамика ЧП астроцитов в слоях ОЛ при введении капсаицина зрелым крысам однотипна. ЧП астроцитов максимально увеличивается к 30-м суткам эксперимента, что соответствует длительности острой фазы реактивного глиоза (4-5 нед), когда астроциты выступают, в том числе, и в роли макрофагов. Описанные изменения устойчивы, сохраняются и на 60-е сутки без значимой динамики. ПО астроцитов в экспериментальных группах изменяется разнонаправленно с ЧП как в эксперименте, так и в контрольной группе (табл. 3, см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. При анализе возрастной динамики ЧП астроцитов отмечается зависимость этого показателя от слоя ОЛ и возраста. В целом, отмечаются высокие показатели в начале наблюдения, их снижение в ювенильный период и в период полового созревания. В зрелом возрасте (180 сут) во всех слоях ЧП астроцитов увеличивается и стабилизируется на достигнутом уровне до конца наблюдения (240 сут). Исключение составляет гранулярный слой с противоположной динамикой. Как известно, астроциты направляют поток нейрональных предшественников как в РМП, так и в ОЛ [8, 10, 13, 15]. Пик интенсивности нейрогенеза, установленный в наших предыдущих исследованиях по уровню экспрессии даблкортина (маркер дифференцирующихся астроцитов) [8], приходится на 60-90-е сутки. Возможно, что именно из-за движущейся из центральной зоны ОЛ волны мигрирующих радиально клеток расстояние между астроцитами увеличивается. По мере ослабления интенсивности нейрогенеза в период полового созревания астроциты снова сближаются. Эта динамика подтверждается полученными данными: в центральном и гранулярном слоях ОЛ отмечаются наиболее выраженные возрастные колебания параметров, а именно, в этих слоях продвигаются основная масса прогениторов, ибóльшая часть их здесь гибнут. Введение капсаицина в инфантильном возрасте приводит к развитию выраженного глиоза в центральной зоне и гранулярном слое ОЛ. На периферии ОЛ значимые изменения отмечаются только в острую фазу на 30-е сутки эксперимента. Сравнение с данными по экспрессии других маркеров показывает, что на этом же сроке отмечается наиболее выраженное уменьшение ЧП зрелых нейронов [7, 8] и нейрональных предшественников [8]. Такая массовая гибель клеток обусловлена воздействием инъекции токсической дозы капсаицина на TRPV1-каналы (специфические ванилоидные рецепторы), широко представленные у разных типов нейронов в ОЛ [11]. Эти рецепторы напрямую связаны с кальциевыми каналами, и их активация ведет к поглощению Ca2+ и Na+. Это, в свою очередь, приводит к гипергидратации клетки и разрушению цитоскелета [5], в том числе и в ОЛ [9, 17]. По-видимому, наблюдаемая реакция астроцитов связана с их фагоцитарными функциями переработки погибших капсаицин-чувствительных клеток [5, 8, 10, 13, 16]. На 60-е сутки отмечается нормализация ЧП астроцитов в ОЛ за исключением зоны РМП, где низкие значения этого показателя отражают снижение количества мигрирующих предшественников. Глиоз у зрелых крыс не имеет выраженной специфики по слоям и менее выражен в РМП, чем в эксперименте на 30-суточных животных. Заключение. Таким образом, введение капсаицина в инфантильном и зрелом возрасте вызывает гибель как нейрональных предшественников, что подтверждается изменениями в клеточном составе дистального отдела рострального потока (центральная зона ОЛ), так и зрелых нейронов во всех слоях. Динамика ЧП астроцитов в слоях ОЛ при введении капсаицина однотипна, но выраженность её различна. ЧП астроцитов максимально увеличивается к 30-м суткам эксперимента, что соответствует длительности острой фазы реактивного глиоза (4-5 нед). При введении токсина в инфантильном возрасте через 60 сут ЧП астроцитов во всех слоях ОЛ снижается вследствие развития компенсаторных процессов. Введение токсических доз капсаицина в зрелом возрасте приводит к устойчивому глиозу без тенденции к компенсации, что подтверждает меньшую пластичность и адаптивность ткани мозга взрослых крыс к нейротоксическому воздействию. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. А. П. Сбор и обработка материала: Д. А. П., А. В. М., К. К. П. Статистическая обработка данных: Д. А. П., А. В. М., К. К. П. Анализ и интерпретация данных: Д. А. П. Написание текста: Д. А. П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

D. A. Pozhilov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: dmitry.oldman@yandex.ru
Department of Human Anatomy 5 Revolutionnaya St., Yaroslavl 150000

A. V. Moskalenko

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Human Anatomy 5 Revolutionnaya St., Yaroslavl 150000

K. K. Pshenisnov

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Human Anatomy 5 Revolutionnaya St., Yaroslavl 150000

References

Supplementary files