CHANGES OF THE CONTENT OF DLL4 AND Jag-1 ANGIOGENESIS REGULATORS IN HUMAN DERMIS IN ONTOGENESIS

全文:

Одной из причин возрастных изменений кожи человека является прогрессивное уменьшение числа кровеносных сосудов в дерме [1, 10]. Однако механизмы этих изменений остаются во многом неизвестными. Их выяснению, вероятно, может способствовать изучение роли молекул, участвующих в регуляции ангиогенеза в онтогенезе [7]. Работы, направленные на исследование регуляции ангиогенеза, указывают на существенную роль в этом процессе сигнального пути Notch [2], представляющего собой комплекс рецепторов и лигандов, взаимодействие которых активирует процессы ангиогенеза [14]. Лигандами регуляторного пути Notch являются дельтаподобные лиганды 1, 2, 3 и 4 (Dll4), Jagged-1 (Jag-1) и Jagged-2 [5, 6]. В экспериментах на мышах показана противоположная функциональная роль Dll4 и Jag-1 в регуляции ангиогенеза [3]. Dll4 и Jag-1 являются важными участниками в Notch-пути и в образовании новых кровеносных сосудов. Однако остается открытым вопрос об участии Notch-лигандов - Dll4 и Jag-1 в кровоснабжении дермы человека в возрастном аспекте. Цель настоящего исследования - определить содержание регуляторов ангиогенеза Dll4 и Jag-1 в дерме у человека в различные возрастные периоды. Материал и методы. Объектом исследования служили кусочки кожи нижней части передней поверхности шеи, полученные при аутопсии плодов человека, и людей, умерших от различных причин. Из исследования были исключены люди с болезнями кожи. Образцы кожи брали в патологоанатомических отделениях больниц г. Чебоксары. Проведение исследования одобрено этическим комитетом медицинского факультета Чувашского государственного университета им. И. Н. Ульянова (протокол № 3/4 от 31.01.2014 г.). Кусочки кожи, не имевшие повреждений и патологических изменений, фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали в парафин. Из блоков изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Dll4 и Jag-1 выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [1]. В качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела к Dll4 (AHP1274, AbD Serotec, Великобритания) и поликлональные кроличьи антитела к Jag-1 (NBP1-90208, Novus Biologicals Inc., США) в разведении 1:50 на 0,05 М трис-буфере (рН 7,4) с добавлением 0,15 М натрия хлорида. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. Срезы докрашивали гематоксилином. В качестве контроля специфичности окрашивания применяли такую же процедуру обработки срезов, но вместо первых антител использовали нормальную кроличью сыворотку в конечной концентрации - 1%. Исследование проводили с использованием светового микроскопа Olympus CX-21, цифровой камеры Olympus Camedia 4040z (Olympus, Япония), персонального компьютера. Интенсивность реакции на Dll4 или Jag-1 оценивали по 4 степеням окрашивания: без него, со слабым, средним и сильным [11]. Степень окрашивания оценивали во всех сосудах дермы без разделения их на виды. Анализ интенсивности окрашивания сосудов при реакции на Dll4 и Jag-1 выполняли во всей толщине дермы без разделения на слои. Исследование препаратов проводили вслепую без исходного знания возраста и половой принадлежности субъекта. Затем данные об интенсивности окрашивания сопоставляли с возрастом и половой принадлежностью и определяли долю случаев с каждой степенью окрашивания во всех возрастных группах. 1-ю группу составили плоды 20-40 нед внутриутробного развития; 2-ю - люди 0-20 лет; 3-ю - 21-40 лет; 4-ю - 41-60 лет; 5-ю - 61-85 лет. Формирование групп было обусловлено тем, что в предыдущих исследованиях мы не установили принципиальных изменений числа кровеносных сосудов в дерме человека в пределах данных возрастных групп [1]. Для исследования Dll4 было использовано 150 кусочков кожи 72 женщин и 78 мужчин: в 1-й группе - 24 образца, во 2-й группе - 41 образец, в 3-й группе - 33 образца, в 4-й группе - 25 образцов, в 5-й группе - 27 образцов. Для исследования Jag-1 было использовано 120 кусочков кожи 58 женщин и 62 мужчин: в 1-й группе - 21 образец, во 2-й группе - 25 образцов, в 3-й группе - 21 образец, в 4-й группе - 25 образцов и в 5-й группе - 28 образцов. Был проведен анализ половых различий возрастных изменений исследованных параметров в дерме, для чего выполнен однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не установили значимого влияния пола на изменение степени окрашивания при реакции на Dll4 и Jag-1, что позволило объединить в одну группу образцы кожи мужчин и женщин. Значимость изменений оценивали с помощью критерия χ2. Результаты исследования. В сосудах микроциркуляторного русла дермы - артериолах, венулах и капиллярах - иммунореактивностью обладали в основном эндотелиоциты Dll4-иммунопозитивные сосуды были выявлены во всей толщине дермы как у плодов, так и у людей всех возрастных групп. Однако в изученные возрастные периоды количество случаев с разной степенью окрашивания сосудов было неодинаковым. В дерме у плодов (1-я группа) большинство исследованных кусочков кожи содержали сосуды со слабой степенью окрашивания при реакции на Dll4 (рис. 1; 2, а). Лишь небольшую часть составили образцы кожи без окрашивания кровеносных сосудов или со средней степенью выраженности их реакции на Dll4 (см. рис. 1; 2, а). В дерме у людей в возрасте 0-20 лет (2-я группа) доля образцов с сосудами, не дающих реакции на Dll4 и со слабым их окрашиванием, уменьшилась, а доля образцов, в которых сосуды имели среднюю степень окрашивания, в 1,5 раза увеличилась по сравнению с таковой в предыдущей группе (см. рис. 1; 2, а). В небольшом числе исследованных объектов в дерме выявлялись сосуды с сильной реакцией на Dll4 (см. рис. 1; 2, а). У людей 21-40 лет (3-я группа) преобладали образцы кожи с кровеносными сосудами, имеющими слабую реакцию на Dll4 (см. рис. 2, а). Доля случаев с сосудами без окрашивания, так же как и с сосудами с сильной реакцией на Dll4, снизилась по сравнению с таковой в возрасте 0-20 лет (см. рис. 2, а). В 4-й группе (41-60 лет) преобладали образцы кожи, в дерме которой сосуды имели слабую реакцию на Dll4. Доля образцов с такими сосудами была примерно в 2,6 раза больше, чем в 3-й группе (см. рис. 2, а). Лишь небольшую долю составляли образцы кожи с кровеносными сосудами, имеющими среднее и сильное окрашивание при реакции на Dll4 (см. рис. 2, а). В 5-й группе (61-85 лет), так же как в предыдущей возрастной группе, преобладали образцы, в которых сосуды имели слабую реакцию на Dll4 (см. рис. 1; 2, а). В небольшой доле образцов кожи кровеносные сосуды имели среднюю и сильную степень реакции на Dll4 (см. рис. 2, а). Таким образом, исследования продемонстрировали, что экспрессия Dll4 в кровеносных сосудах в дерме увеличивается от 20-40 нед внутриутробного развития до 20 лет. С дальнейшим увеличением возраста интенсивность реакции кровеносных сосудов на Dll4 снижается. Сосуды, дающие положительную реакцию на Jag-1, были выявлены во всей толщине дермы как у плодов, так и у людей всех исследованных возрастных групп. Однако в исследованных группах людей количество случаев с разной степенью выраженности реакции сосудов на Jag-1 было неодинаковым. У плодов (1-я группа) большинство образцов кожи содержали сосуды со слабой степенью реакции на Jag-1 (см. рис. 1; 2, б). У людей в возрасте 0-20 лет (2-я группа) в половине изученных кусочков кожи сосуды в дерме давали реакцию на Jag-1 (см. рис. 2, б). У людей 21-40 лет (3-я группа) почти в 2 раза снизилась доля образцов кожи, в которых кровеносные сосуды или не давали реакции, или обладали слабой реакцией на Jag-1 по сравнению с таковой в предыдущей возрастной группе (см. рис. 1; 2, б). Доля исследованных фрагментов кожи, содержащих кровеносные сосуды со средней интенсивностью реакции на Jag-1, напротив, увеличилась более чем в 2 раза. Лишь небольшую долю составили образцы, в которых кровеносные сосуды имели сильно выраженную реакцию на Jag-1 (см. рис. 2, б). В возрастной группе от 41-60 лет (4-я группа) доля кусочков кожи с сосудами, имеющими среднюю или сильную степень реакции на Jag-1, стала больше, чем в предыдущей возрастной группе (см. рис. 2, б). В 5-й группе (61-85 лет) большинство исследованных образцов кожи содержали сосуды со средней степенью выраженности реакции на Jag-1 (см. рис. 1; 2, б). У людей от 61 года до 85 лет наблюдалась максимальная доля образцов с сосудами, обладающими сильной степенью реакции на Jag-1 (см. рис. 2, б). Таким образом, с возрастом происходило увеличение доли образцов, в дерме которых находились сосуды с большой интенсивностью реакции. Это свидетельствует об увеличении экспрессии Jag-1 в кровеносных сосудах дермы у человека с возрастом. Обсуждение полученных данных. Нами выявлены иммунопозитивные сосуды микроциркуляторного русла в дерме у плодов и людей различных возрастных групп. Исследованные в работе Notch-лиганды Dll4 и Jag-1 синтезируются в эндотелиоцитах и после связывания с рецепторами могут влиять на транскрипцию в лигандэкспрессирующих клетках и рост кровеносных сосудов [9]. Исследования продемонстрировали, что экспрессия Dll4 в сосудах дермы увеличивается от 20-40 нед внутриутробного развития до 20 лет. С дальнейшим увеличением возраста интенсивность реакции кровеносных сосудов на Dll4 снижается. Существует мнение, что Dll4 играет особую роль именно в период эмбрионального развития [3]. Однако, скорее всего, низкий уровень экспрессии Dll4, выявленный в этот период, недостаточен для того, чтобы стимулировать или блокировать ангиогенез у плодов. Вместе с тем, высокое содержание этого лиганда в возрасте от 0 до 20 лет может индуцировать ингибирование ангиогенеза, которое проявляется с возрастом [4]. Это предположение о роли Dll4 в качестве тормозного сигнала для ангиогенеза в дерме согласуется с наблюдениями изменения численности сосудов в дерме в возрастном аспекте. Установлено, что именно в 20 лет происходит резкое уменьшение количества сосудов микроциркуляторного русла в дерме [1], но не установлены причины этих изменений. Некоторые механизмы, связанные с зависимым от возраста ухудшением кровоснабжения, были изучены при действии ультрафиолетового (УФ) света. Было показано, что УФ-облучение приводит к повышению активности ангиогенных факторов, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [12]. Эти наблюдения послужили основанием считать, что VEGF, выделяемый кератиноцитами, является главным источником ангиогенной активности в коже. Взаимодействия между VEGF и его рецепторами второго и третьего типов модулируют Notch-сигнализацию и ее влияние на ангиогенез [3, 6]. Таким образом, показано, что сигнальный путь Notch играет решающую роль в функционировании эндотелиоцитов [14]. Полагают, что Dll4-Notch-сигнализация действует в качестве выключателя ангиогенеза путем снижения чувствительности эндотелиальных клеток к VEGF [8]. Синтез Dll4 в эндотелиоцитах индуцируется VEGF, что приводит к формированию так называемых tip-клеток, которые располагаются в терминальном участке вновь формируемого сосуда [13]. Затем Dll4, продуцируемый в tipклетках, действует на Notch 1 и 4, расположенные на соседних эндотелиоцитах. В результате этого в них резко уменьшается количество рецепторов второго типа VEGF. Эти клетки превращаются в так называемые stalk-клетки, которые локализуются позади tip-клеток и формируют эндотелиальную выстилку ствола нового кровеносного сосуда. Jag-l в stalk-эндотелиоцитах активирует синтез Notch 3 в залегающих глубже клетках [13]. По всей видимости, постепенное повышение содержания Jag-1 в дерме у человека с возрастом от 20 нед внутриутробного развития и до 85 лет также оказывает ингибирующее влияние на формирование новых кровеносных сосудов. Таким образом, экспрессия Dll4 в кровеносных сосудах дермы увеличивается от 20-40 нед внутриутробного развития до 20 лет, после чего постепенно снижается. Экспрессия Jag-1 увеличивается от 20 нед внутриутробного развития до 85 лет. Эти данные демонстрируют роль лигандов Dll4 и Jag-l в регуляции ангиогенеза в возрастном аспекте.

作者简介

N. Golubtzova

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Email: golubnata@list.ru
Department of General and Clinical Morphology and Forensic Medicine

O. Vasiliyeva

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Email: olkin-mouse@ya.ru
Department of Obstetrics and Gynecology

V. Petrov

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Email: vadim2304@yandex.ru
Department of Obstetrics and Gynecology

A. Gunin

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Email: drgunin@mail.ru
Department of Obstetrics and Gynecology

参考

补充文件