REACTION OF PAROTID GLAND MAST CELLS TO CHRONIC ALCOHOL INTOXICATION

全文:

Известно, что хронические интоксикации, в частности алкогольная, вызывают разнообразные изменения структуры и функции органов полости рта, однако основное внимание при их изучении было уделено распространенности и интенсивности заболеваний слизистой оболочки полости рта, кариеса зубов, болезней пародонта [15, 18, 19, 23]. Получены также отдельные сведения о том, что употребление алкоголя сопровождается нарушением функции слюноотделения, а также структуры слюнных желез, однако эти данные разрознены, неоднозначны, а иногда противоречивы [6, 9, 13, 15, 17, 20]. В частности, состояние тучных клеток (ТК) в крупных слюнных железах в условиях хронической алкогольной интоксикации организма остается практически неизученным, несмотря на установленную роль этих клеток в регуляции различных физиологических и патологических процессов, влияние на кровеносные сосуды, иммунную и нервную систему [1, 4, 8, 11, 14]. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение воздействия алкоголя на состояние ТК в околоушной железе на модели хронической алкогольной интоксикации крыс. Материал и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах-самцах массой 170-200 г, которые были разделены на 2 группы: контрольную - интактные животные (n=10) и подопытную (n=15). Крысы подопытной группы в качестве источника питья получали 20% раствор этилового спирта в течение 2 мес. Все действия, предусматривавшие контакт с лабораторными животными, осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) и Федерального Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. На проведение настоящего исследования получено разрешение этического комитета университета (протокол № 3 от 16.11.2015 г.). Животных выводили из эксперимента путем декапитации под общим эфирным ингаляционным наркозом. Объектом исследования была околоушная слюнная железа. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином - эозином. Для люминесцентногистохимического выявления серотонина, из материала, замороженного до -15 ºС в микротоме-криостате МК-25 (Технолог, СССР), получали срезы толщиной 10 мкм. Далее срезы, смонтированные на предметных стеклах, обрабатывали по методу Фалька-Хилларпа [10]. Метод основан на реакции конденсации серотонина парами формальдегида в течение 1 ч при 80 ºС, при котором образуется 1,2,3,4,-тетрагидро-βкарболин, люминесцирующий в желто-оранжевой области (λmax=525 нм), светофильтр № 8 измерительной насадки ФМЭЛ-1А (ЛОМО, Россия). Содержание серотонина количественно оценивали с помощью цитоспектрофлуориметрии на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-4 (ЛОМО, Россия) с насадкой при об. 40, ок. 10; диаметр рабочего зонда - 0,5 мм. В каждом срезе производили не менее 20 измерений интенсивности свечения в области секреторных клеток концевых отделов и междольковых выводных протоках; результаты выражали в условных единицах люминесценции (усл. ед.) по шкале регистрирующего прибора-усилителя. В последующем криостатные срезы использовали для окраски по Унна, заменив полихромный метиленовый синий полихромным толуидиновым синим. Этот метод использован для качественной и количественной характеристики ТК. Препараты изучали при об. 40, ок. 10 с помощью микроскопа «Биомед-1» (ЛОМО, Россия). В указанном поле зрения производили подсчет ТК. При этом определяли также индекс дегрануляции (А) по формуле: А=С/В, где С - количество дегранулирующих клеток, В - общее число проанализированных ТК. Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием стандартного программного обеспечения «Statistica 6.0» на персональном компьютере. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. При исследовании срезов околоушной железы животных контрольной группы наблюдается нормальная структурная организация органа, образованного железистыми дольками и междольковыми соединительнотканными прослойками, содержащими междольковые выводные протоки, а также междольковые кровеносные сосуды (артерии и вены), лимфатические сосуды и небольшие нервные стволы. Основной объем долек занят компактно расположенными концевыми секреторными отделами (ацинусами), имеющими сравнительно одинаковые размеры. Концевые отделы образованы железистыми эпителиоцитами (сероцитами) пирамидной формы сходных размеров с центрально расположенным ядром, по периферии окруженными уплощенными миоэпителиальными клетками. Внутридольковые выводные протоки в околоушной железе у крыс развиты умеренно и включают вставочные и исчерченные. Междольковые протоки выстланы однослойным многорядным столбчатым эпителием, местами - двухслойным эпителием. Их просветы не расширены. При окраске гематоксилином - эозином и полихромным толуидиновым синим по Унна отмечаются нормальные тинкториальные особенности концевых секреторных отделов и выводных протоков. На срезах, окрашенных по Унна, отчётливо выявляются ТК за счет интенсивного метахроматического окрашивания их цитоплазматических гранул толуидиновым синим в ярко-фиолетовый цвет. Данные клетки в основном сосредоточены группами вблизи междольковых протоков и кровеносных сосудов в количестве 4,5±0,7 в поле зрения. Клетки характеризуются довольно крупными размерами - около 10-25 мкм. Выявляемые ТК - преимущественно без признаков дегрануляции, они имеют овальную или удлиненную форму, края их четко контурируются, цитоплазма заполнена плотно расположенными метахроматическими гранулами, ядро не прослеживается. Встречаются также клетки с признаками частичной дегрануляции. Они имеют нечеткие границы, разную величину, неправильную форму. Цитоплазма менее интенсивно окрашена за счет рыхло расположенных хорошо различимых гранул. За пределами данных клеток содержится большое количество гранул. Индекс дегрануляции составляет 0,3. Внутри долек около концевых отделов, вставочных и исчерченных протоков встречаются единичные ТК в количестве 1-2 (в среднем - 1,20±0,13) в поле зрения. Их цитоплазма плотно заполнена метахроматическими гранулами, а ядро неразличимо. Индекс дегрануляции составляет 0,4. При люминесцентно-гистохимическом исследовании срезов на серотонин выявляется светлозеленое свечение. Его содержание практически одинаково в области концевых секреторных отделов и зоне междольковых протоков, составляя 1,52±0,22 и 1,57±0,17 усл. ед соответственно. У подопытных животных, подвергнутых хронической алкогольной интоксикации, значительных нарушений общей структурной организации концевых секреторных отделов и выводных протоков не выявлено. Между тем, часто отмечались изменения формы концевых отделов и вариабельность размеров образующих их железистых клеток, среди которых встречались и очень крупные. В цитоплазме многих клеток наблюдались круглые неокрашенные вакуоли, которые предположительно соответствуют жировым включениям. В кровеносных сосудах отмечается застой крови. Междольковые выводные протоки неравномерно расширены, их клетки имеют разную высоту. Содержание ТК в железе увеличено. В соединительнотканных перегородках около междольковых протоков они образуют группы, где их число достигает 8,7±0,7 в поле зрения. ТК без признаков дегрануляции единичны, основная их часть находятся в стадии дегрануляции, соответственно индекс дегрануляции достигает 0,6. Наблюдается также увеличение числа ТК, дегранулирующих с тотальным распадом цитоплазмы. Полностью разрушенные ТК со светлой цитоплазмой и небольшим количеством разбросанных метахроматически окрашенных гранул составляют до 1/3 от числа дегранулированных. Несколько повысилось также и содержание ТК, расположенных внутри долек, около концевых отделов, вставочных и исчерченных выводных протоков (до 1,50±0,16 в поле зрения), причем все они характеризуются высокой степенью активности, под которой подразумевается усиленное созревание и выделение гранул ТК. Индекс дегрануляции в указанной зоне составляет 0,8. Примечательно, что при хронической алкогольной интоксикации наблюдается существенное повышение содержания серотонина в зоне концевых секреторных отделов, вставочных и исчерченных протоков до 2,50±0,18 усл. ед., что значимо (Р<0,01) превышает уровень в контрольной группе. В то же время, в области междольковых протоков этот показатель равен лишь 1,64±0,08 усл. ед., причем его значение значимо не отличается от такового в контроле (Р>0,05). Обсуждение полученных данных. Как известно, ТК обнаружены практически во всех органах, они особенно многочисленны около кровеносных и лимфатических сосудов, периферических нервов и нервных волокон [1-7]. Результаты наших исследований полностью согласуются со сведениями о преимущественной локализации этих клеток в тканях и органах. Так, установлено, что большее число ТК в виде групп располагаются в непосредственной близости от исчерченных, междольковых выводных протоков околоушной слюнной железы, и практически всегда прослеживается их дегрануляция. Единичные клетки встречаются во внутридольковых прослойках соединительной ткани между концевыми секреторными отделами. Как известно, ТК весьма чувствительны к действию различных гормонов, токсинов, ионов, продуктов перекисного окисления липидов: они восприимчивы к незначительным изменениям их концентрации в сыворотке крови и межклеточном веществе [5]. ТК реагируют на изменения микроокружения, при этом они способны не только самостоятельно синтезировать биологически активные вещества [2, 8], но и захватывать извне и накапливать нейромедиаторы эффекторных окончаний автономного отдела нервной системы. Тем самым ТК определяют направленность и интенсивность биохимических процессов, запуская механизмы адаптации структурных компонентов органа. Дегранулирующие клетки выбрасывают в межклеточное пространство большое количество биологически активных веществ, таких как гепарин, гистамин, серотонин, цитокины, факторы роста, протеазы и др., благодаря чему они являются основными регуляторами тканевого гомеостаза [2, 3, 8, 11]. Многообразие медиаторов обусловливает участие данных клеток не только в физиологических адаптационных механизмах регенерации, ангиогенеза, дифференцировки клеток, но и в патологических процессах, причем их дисфункция способствует дистрофическим и воспалительным изменениям органов [2-4]. Воздействуя на эндотелий сосудов, ТК совместно с автономной нервной системой [16], в частности холин-и адренергическими нервными волокнами, по-видимому, играют важную роль в регуляции секреторной функции околоушной железы. При хронической алкогольной интоксикации выявляется отчетливая тенденция к увеличению числа ТК в околоушной слюнной железе, особенно в соединительнотканных прослойках возле выводных протоков, что согласуется с данными литературы, которые указывают на увеличение содержания этих клеток в различных органах при воздействии алкоголя [14]. Увеличение популяции ТК и усиленное созревание молодых ТК в местах их локализации в основном регулируются цитокинами [2, 3]. Между тем, известно, что этанол способен индуцировать выработку ряда цитокинов, таких как интерлейкин-6 и -10, фактор некроза опухолей [14, 21, 22]. Слюнные железы являются органами, экскретирующими этанол и его метаболит ацетальдегид. Воздействие данных неспецифических раздражителей на ТК, видимо, ускоряет процесс их дегрануляции и выброса медиаторов, в частности, серотонина. Учитывая параллельное увеличение количества дегранулирующих и тотально распадающихся ТК, можно предположить, что в данном случае именно они являются источником серотонина в тканях. Можно предположить, что повышенное содержание медиатора в области концевых отделов указывает на то, что в железе под влиянием алкогольной интоксикации активируются дополнительные паракринные механизмы регуляции, которые способствуют повышению ее функциональной активности, направленной на ускоренное выведение из организма этанола и токсических продуктов его метаболизма. На основе полученных данных можно заключить, что этанол оказывает токсическое действие на популяцию ТК околоушной железы. В результате клетки формируют микроокружение с повышенным содержанием медиаторов. Значимое увеличение содержания серотонина в области концевых секреторных отделов, вставочных и исчерченных протоков, вероятно, связано с его накоплением и сравнительно низким уровнем метаболического распада. Меньшее накопление серотонина, отмеченное нами около междольковых выводных протоков и кровеносных сосудов, объясняется, предположительно, тем, что серотонин, выделяемый ТК при дегрануляции, активно взаимодействует с многочисленными расположенными здесь волокнами и терминалями автономной нервной системы и быстро захватывается ими. Возможно также, что это связано с большей скоростью метаболизма серотонина в этой зоне. Как известно, в метаболическом распаде серотонина участвует не только моноаминоксидаза, но и алкогольдегидрогеназа [12, 13]. Очевидно, при алкогольной интоксикации активность последней в значительной степени направлена на разрушение этанола, в связи с чем возникает ее конкурентная недостаточность при метаболической деградации серотонина, и это сопровождается накоплением медиатора возле концевых отделов. При активном участии ТК паракринное воздействие серотонина, вероятно, провоцирует развитие дисфункции сероцитов и миоэпителиальных клеток слюнной железы. Это подтверждается как собственными наблюдениями, так и данными литературы, поскольку при хронической алкогольной интоксикации в слюнных железах отмечена гиперплазия ацинусов, расширение протоков, дистрофия их эпителия [6]. Получены также данные, что хроническое алкогольное воздействие непосредственно вызывает усиление выработки фактора некроза опухолей и апоптоз клеток слюнных желез [21]. Подводя итог проведенному исследованию и рассматривая полученные результаты с учетом данных литературы, можно заключить, что ТК являются важным звеном, опосредующим влияние различных воздействий на структуру и функцию органов и тканей при любых формах адаптации и патологических процессах. Таким образом, изменение цитофизиологического состояния ТК при хронической алкогольной интоксикации представляется важной составляющей неспецифического адаптивного ответа слюнной железы.

作者简介

L. Yakovleva

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Email: 28Lybov@mail.ru

O. Sorkina

I. N. Ulyanov Chuvash State University

参考

补充文件