REPARATIVE OSTEOGENESIS AND ANGIOGENESIS UNDER THE CONDITIONS OF TRANSOSSEOUS OSTEOSYNTHESIS AND THE EXPOSURE TO LOW-INTENSITY LASER RADIATION

全文:

Достижения в области чрескостного остеосинтеза общеизвестны [3, 5, 14]. Этот метод широко используется при лечении больных с костными дефектами и укорочениями конечностей, однако он остается весьма трудоемким и включает длительные многоэтапные лечебные мероприятия. Поэтому разработка и применение немедикаментозных средств коррекции процессов репаративной регенерации при различных патологических состояниях костной ткани является актуальной задачей современной медицины. В клинической практике, в том числе в травматологиии и ортопедии при лечении повреждений и заболеваний опорно-двигательного аппарата, широко используются различные виды лазерной терапии, поскольку они оказывают обезболивающее, противоотечное, противовоспалительное и трофико-стимулирующее действие [1, 8, 10, 11]. При этом обеспечивается снижение медикаментозной нагрузки на организм пациента. Лечение, осуществляемое лучами лазера, комфортно, неинвазивно, асептично, безболезненно, безвредно и контролируемо [15, 17]. Известно, что низкоэнергетическое лазерное воздействие оказывает многофакторное влияние на организм [2, 13]. Повышается активность ферментных систем, увеличивается скорость потребления тканями кислорода, снижается уровень перекисного окисления липидов, активизируются окислительновосстановительные процессы, увеличивается концентрация адаптивных гормонов [16, 18]. Вместе с тем, механизмы терапевтических эффектов воздействия лазера во многом неясны, и дозы подбираются эмпирически. Экспериментальные работы в этой области немногочисленны [1, 8, 9]. Сведения о влиянии низкоинтенсивного инфракрасного лазера на морфологические особенности регенерата кости, формирующегося при заживлении перелома в условиях чрескостного остеосинтеза, отсутствуют, что при актуальности проблемы свидетельствует о необходимости проведения данного исследования. Цель настоящей работы - морфологический анализ влияния воздействия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на репаративный остеосинтез и ангиогенез в регенерате кости, формирующемся при заживлении перелома в условиях чрескостного остеосинтеза. Материал и методы. Исследование проведено на 32 половозрелых крысах линии Вистар обоего пола с массой тела 340-390 г, которые были разделены на 2 группы: контрольную и подопытную (по 16 животных в каждой группе). Уход, оперативные вмешательства и эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями Минздрава России и «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Под общим наркозом закрытым способом моделировали перелом в средней трети диафиза большеберцовой кости, осуществляли репозицию и фиксацию отломков разработанным нами устройством для чрескостного остеосинтеза [12]. В подопытной группе через 1 сут после операции животных подвергали воздействию низкоэнергетического импульсного инфракрасного лазерного излучения, используя лазерный терапевтический аппарат «УЗОР-А-2К» (ПКП БИНОМ, Россия), при длине волны в ближнем инфракрасном диапазоне - 0,89±0,02 мкм, частоте импульсов 150 Гц, мощности - 4 Вт, продолжительности импульса - 110-160 нс. Воздействие проводили локально на зону перелома в течение 10 мин. Расстояние между излучателем и кожей было 1 мм. Сеансы воздействия излучения повторяли через 1 сут и проводили на протяжении 7 и 14 сут после операции. В группе контрольных животных проводили имитацию воздействия при выключенном лазерном терапевтическом аппарате. Сразу после операции и в процессе лечения проводили рентгенографию. Эвтаназию животных осуществляли через 7 и 14 сут после операции. Использовали по 8 животных на каждую временную точку. Оперированные кости фиксировали в 2% растворе параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), кусочки регенерата для электронной микроскопии дополнительно фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. Образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, в 100% ацетоне и заливали в парафин (после декальцинации) и аралдит (без декальцинации). Парафиновые гистотопографические продольные срезы окрашивали гематоксилином - эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Морфологический анализ и микрофотосъемку гистологических препаратов проводили под световым микроскопом «Stemi 2000-C» в комплекте с цифровой камерой «AxioCam ERc 5s» и программным обеспечением «Zen blue» (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). Кости, залитые в аралдит, исследовали при помощи рентгеновского электронно-зондового микроанализатора INCA-200 Energy (Oxford Instruments Analycal, Великобритания) в характеристическом рентгеновском излучении кальция. Активность костеобразовательного процесса определяли по содержанию в интермедиарной зоне регенерата структур костной ткани. С использованием данных рентгеновского электроннозондового микроанализатора при помощи индекса компактности (отношение содержания костной ткани и неминерализованных структур) оценивали органоспецифичность и степень зрелости новообразованной костной ткани. Блоки в зоне регенерата распиливали на образцы для электронной микроскопии, готовили ультратонкие срезы толщиной 70-90 нм на ультрамикротоме LKB-8800 (LKB Bromma Ultratome Nova, Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали при помощи трансмиссионного электронного микроскопа JEM-2010 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Затем образцы обрабатывали 2% раствором этилата натрия (для удаления с поверхности аралдита), напыляли сплавом платины и палладия (в соотношении 1:3) в ионном вакуумном напылителе IB-6 (Eico, Япония) и изучали в сканирующем электронном микроскопе JSM-840 (Jeol, Япония) во вторичных электронах при ускоряющем напряжении 20 кВ. На сканирующих электронных микрофотографиях при инструментальном увеличении 1000 на единице площади среза 0,01 мм2 определяли количество сосудов и диаметр их просвета. Результаты количественных исследований обрабатывали методами вариационной статистики. Значимость различий сравниваемых параметров рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Через 7 сут после перелома у контрольной группы животных в оперированной кости рентгенологически наблюдается хорошо выраженный диастаз, у концов отломков появляются едва заметные облаковидные тени регенерата. Отмечаются первые признаки образования слабоконтрастных периостальных наслоений незначительной протяженности. При микроскопическом исследовании в области костных отломков выявляются очаги альтеративно-деструктивных изменений и участки организующейся гематомы, инфильтрированной лимфоцитами, нейтрофилами, моноцитами, тучными клетками, макрофагами. В интермедиарной и эндостальной зонах регенерата выявляются костные осколки и сгустки фибрина, образуется малодифференцированная соединительная ткань с признаками отека. Интермедиарная зона регенерата замещена, преимущественно, небольшими островками слабо васкуляризированной малодифференцированной и рубцующейся грануляционной тканью и пучками коллагеновых волокон. Структуры новообразованной костной ткани в интермедиарной зоне не выявляются. В регенерате располагаются одиночные синусоидные капилляры с умеренной эктазией, пристеночные микротромбы, отмечается диапедез эритроцитов и лейкоцитов. Периваскулярные клетки единичны (рис. 1, а). Вдоль эндостальной поверхности отломков формируется тонкий слой новообразованных костных трабекул. Эндостальное и периостальное костное сращение отсутствует. В подопытной группе животных через 7 сут после перелома рентгенологически выявляется костная мозоль, располагающаяся по всему поперечнику кости. Появляются контрастные периостальные наслоения. От концов отломков с периостальной и эндостальной поверхностей в диастаз направляются плотные тени регенерата. В регенерате выявляются многоядерные макрофагальные клетки, дегранулировавшие нейтрофилы и тучные клетки, сгустки фибрина кальцифицированы. Отмечается активный остеогенез, выражающийся в массовой пролиферации остеогенных клеток периоста и эндоста и образовании значительных по объему периостальных и эндостальных костных разрастаний, частично или полностью перекрывающих диастаз. В интермедиарной зоне регенерата располагаются новообразованные кровеносные сосуды и появляются многочисленные анастомозирующие трабекулы грубоволокнистой костной ткани, врастающие навстречу друг другу и образующие напластования на концах отломков с периостальной и эндостальной поверхностей. Грануляционная ткань, содержащая многочисленные капилляры, заполняет все пространство между новообразованными костными структурами и отломками. В сосудах микроциркуляторного русла имеются признаки повышенной проницаемости эндотелиального слоя: многочисленные микропиноцитозные пузырьки, разобщение контактов эндотелиоцитов и появление межэндотелиоцитарных пор и люков на люминальной поверхности. Одновременно с этим выявляются капиллярные почки в виде эндовазальных эндотелиальных выростов на различных этапах канализации с характерным черепицеобразным микрорельефом поверхности, сформированным плоскими маргинальными участками соседних эндотелиоцитов (см. рис. 1, в), и растущие капиллярные терминали (см. рис. б, г), что свидетельствует об активных процессах репаративного ангиогенеза. Результаты электронно-зондового микроанализа (таблица) свидетельствуют об активизации костеобразования и увеличении степени зрелости новообразованной костной ткани в регенератах у животных подопытной группы по сравнению с контрольной. Так, содержание костной ткани в регенератах на 177,09%, а индекс компактности - более чем вдвое превышают показатели в контрольной группе животных. В группе подопытных животных активизируется и ангиогенез, о чем свидетельствуют увеличение количества сосудов на 173,3% и уменьшение диаметра их просвета на 75,9% по сравнению с контролем. Через 14 сут после операции в контрольной группе животных формируется первичный костный регенерат, появляются признаки начальной стадии периостального сращения (рис. 2, а) с преобладанием между отломками волокнистого хряща, а также плотной волокнистой соединительной ткани. Сращение перелома протекает по вторичному типу с образованием, преимущественно, периостальной мозоли, которая представлена сетью переплетающихся костных перекладин различной степени зрелости, формирующихся в результате эндохондрального остеогенекортикального слоя кости. Заживление перелома происходит по типу первичного. Концы отломков соединены пластинчатой костной тканью с вторичными остеонами различной степени зрелости с явлениями компактизации. В межтрабекулярных пространствах располагаются многочисленные кровеносные сосуды, в просвете которых выявляются эндотелиальные выросты. В периваскулярном пространстве располагаются тучные клетки веретеновидной и отростчатой формы на различных этапах процесса дегрануляции. На периостальной и эндостальной поверхностях отломков локализуются функционально активные остеокласты и отмечаются значительные напластования новообразованных костных трабекул, окруженных многочисленными крупными остеобластами. По данным электронно-зондового микроанализа, через 14 сут после перелома и 6 сеансов воздействия лазерного излучения в регенератах содержание костной ткани возрастает на 202,86%, индекс компактности - на 347,5%, количество сосудов - на 294,5% с уменьшением их диаметра на 60,8% по сравнению с показателями в группе контрольных животных (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Клинические и экспериментально-морфологические исследования акад. Г. А. Илизарова и его учеников [3 5, 14] не только доказали возможность быстрого процесса восстановления костной ткани в условиях чрескостного остеосинтеза, но и заложили основы для дальнейшего поиска путей коррекции репаративных процессов в регенерате кости. Как показали проведенные исследования, одним из подходов к оптимизации репаративного остеогенеза и агиогенеза является метод воздействия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения. По данным литературы, лазерное излучение обладает широким спектром терапевтического воздействия [13]. Положительный эффект применения этого метода при различных патологических процессах показан во многих работах [1, 2, 8-11], что явилось основанием использования лазерного излучения для оптимизации процессов формирования регенерата кости при заживлении перелома в условиях чрескостного остеосинтеза. Установлена эффективность воздействия излучения низкоинтенсивного инфракрасного лазера, которое, по данным литературы, хорошо проникает в поврежденные мягкие ткани (на глубину до 5-7 см), достигает области костного перелома и формирующегося регенерата, непосредственно воздействуя на него [10]. Стимулирующее влияние лазерного излучения на репаративный остеогенез и ангиогенез может иметь и не прямой, а опосредованный характер и реализоваться с участием сложных систем аутокринной, паракринной, нейроэндокринной и иммунной регуляции. При этом первичной клеточной мишенью в регенерате кости, как и в поврежденных мягких тканях, по-видимому, являются тучные клетки, стимуляция секреторной активности которых является важным усилительным механизмом в системном отклике организма на воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения, что подтверждается литературными и нашими данными [6]. Выполненные исследования свидетельствуют, что процесс репаративного остеогенеза при заживлении перелома кости в условиях чрескостного остеосинтеза при воздействии инфракрасным лазерным излучением протекает значительно активнее, чем в контрольной группе. Это проявляется уменьшением выраженности воспалительного процесса, усилением микроциркуляции и фибриллогенеза, более ранним формированием регенерата и образованием костного сращения, ускорением процессов перестройки и компактизации новообразованной костной ткани, увеличением степени ее зрелости. Уже через 7 сут после операции и воздействия сеансов лазертерапии формируется интермедиарный регенерат, а через 14 сут - определяется периостальное, интермедиарное и эндостальное костное сращение. Заживление перелома происходит по типу первичного. Подобный эффект наблюдали ряд исследователей при регенерации костной ткани [8, 11] и хряща [16-18]. После сеансов лазертерапии в регенерате кости, формирующемся при чрескостном остеосинтезе, отмечается пролонгированный интенсивный капиллярогенез. При этом стимулируется формирование в просвете сосудов эндотелиальных выростов, образующих ростки капилляров, распространяющихся по ходу «материнских» сосудов на значительные расстояния, не встречая сопротивления периваскулярных тканевых структур. Такой способ образования и роста капилляров непосредственно в просвете предсуществующих сосудов, обозначенный нами как эндовазальный капиллярогенез, впервые описан при заживлении костных ран [4, 6, 7] и является одним из типов начального этапа регенерационного ангиогенеза, обеспечивающих ускоренную регенерацию и ориентированный рост новообразованных сосудов. Полученные данные раскрывают возможный механизм воздействия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на уровне целого организма и доказывают эффективность его применения в клинической практике на ранних этапах реабилитации больных в условиях чрескостного остеосинтеза.

作者简介

Yu. Iryanov

Russian G. A. Ilizarov Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: irianov@mail.ru
Laboratory of Morphology

N. Kiryanov

Izhevsk State Medical Academy

Email: kirnik@list.ru
Department of Pathological Anatomy

参考

补充文件