MORPHOLOGICAL STUDY OF THE THYMUS AND OF THE PELVIC LYMPH NODES IN EXPERIMENTAL PROSTATE TUMOR

全文:

При развитии злокачественной опухоли в организме происходит нарушение различных этапов иммунного ответа и возникает его несостоятельность, в том числе и инволюция центрального органа иммунитета - тимуса, которая может создавать основу для развития Т-клеточного иммунодефицита. Ключевым звеном генерализации злокачественного опухолевого процесса является метастазирование опухолевых клеток в лимфатические узлы [3]. Состояние подвздошных («сторожевых») лимфатических узлов при раке простаты остается одним из самых значимых факторов, определяющих прогноз заболевания [1], а выявление микрометастазов в лимфатических узлах - актуальной задачей определения стадии рака простаты [11]. Изучение центральных и периферических лимфоидных органов при трансплантационной индукции канцерогенеза, позволяет выявить характерные изменения их структурной организации, зависящие от стадии опухолевого процесса, динамики лимфогенного метастазирования, что, в свою очередь, играет важную роль в комплексной оценке действия известных и новых противоопухолевых цитостатических соединений. Целью настоящего исследования явилось выявление структурных преобразований в тимусе и регионарных лимфатических узлах в динамике формирования экспериментальной опухоли простаты. Материал и методы . В работе использовали 60 половозрелых самцов-мышей СВА массой 28-30 г (ФГБНУ «Институт цитологии и генетики СО РАН», г. Новосибирск). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.77 г., с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС). Экспериментальную модель злокачественной опухоли простаты создавали (при срединной лапаротомии под эфирным наркозом) путем инокуляции разведенного клеточного штамма трансплантируемой асцитной карциномы Эрлиха в паренхиму простаты: инъекциями вводили 0,2 мл асцитной жидкости, содержащей 500-550×103 атипичных опухолевых клеток. Результаты проведенного исследования показали, что на 5-е сутки индуцированного канцерогенеза в простате формируется опухолевый узел объёмом 2 мм3, состоящий из полиморфных атипичных клеток [2]. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактные животные; 2) и 3) - экспериментальные животные на 18-еи 28-е сутки роста опухоли простаты. Животных выводили из эксперимента в соответствующие сроки путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Для гистологического исследования забирали простату, тимус и тазовые лимфатические узлы, которые фиксировали в растворе Теллесницкого [7]. Материал заливали в парафин, на ротационном микротоме изготавливали продольные срединные срезы (толщиной 5 и 7 мкм), которые далее окрашивали гематоксилин - эозином по Майеру и азуром II-эозином по Нохт-Максимову [8]. С помощью окулярной тестовой системы при увеличении в 16, 32, 200 и 1000 раз методом точечного счёта производили морфометрию срезов и подсчет клеточных элементов в опухоли, структурных компонентах тимуса и тазовых лимфатических узлов. В тимусе производили морфометрию коркового и мозгового вещества, соединительнотканных компонентов (капсула, трабекулы - междольковые перегородки). Железистые эпителиальные образования тимуса (эпителиальные тяжи, эпителиальные канальцы) морфометрировали на тех же срезах при увеличении в 200 раз, подсчитывали все тимусные тельца (Гассаля) на срезах целого органа, а затем рассчитывали их количество на стандартную площадь 10 мм2. В тимусе подсчитывали также абсолютное количество клеток на стандартной площади 2025 мкм². Дифференцировали иммунобласты, средние и малые лимфоциты, митотически делящиеся клетки, клетки с пикнотическими ядрами, эпителиоретикулярные клетки, макрофаги, моноциты, тучные клетки. Клетки тимуса подсчитывали в субкапсулярной (подкапсульной) зоне коркового вещества, в кортико-медуллярной зоне и центральной части мозгового вещества. В тазовых лимфатических узлах определяли распространенность метастазов (локализацию атипичных опухолевых клеток); в опухоли простаты определяли соотношение паренхимы и стромы, ядра и цитоплазмы атипичных клеток, а также выраженность клеточного полиморфизма. В лимфатических узлах производили морфометрию капсулы, краевого и мозговых синусов, лимфоидных узелков, паракортикальной Т-зависимой зоны и мозговых тяжей. Рассчитывали отношение площади коркового и площади мозгового вещества (индекс К/М), площадь В-зависимой зоны лимфатических узлов. Подсчитывали абсолютное количество клеток в структурных компонентах лимфатических узлов при помощи окулярной сетки площадью 2025 мкм2. Выделение структурных компонентов и клеточных элементов в лимфатических узлах проводили согласно Международной гистологической терминологии. Результаты экспериментов обрабатывали с использованием методов вариационной статистики, определяли достоверности различий с помощью критерия Стьюдента, достоверными считали результаты при P < 0,05 [6]. Результаты исследования . На 18-е сутки роста опухоли выявлено практически полное замещение ткани простаты атипичными полиморфными клетками (паренхима опухоли - 82,3±0,6 %, строма опухоли - 17,7±0,4 %). Паренхима опухоли была представлена крупными полиморфными атипичными клетками овальной, вытянутой или полигональной формы с гиперхромными ядрами; ядерно-цитоплазматический индекс опухолевых клеток составлял 1,66±0,08. В тимусе увеличивались размеры коркового вещества на 8 %, площади соединительнотканных структур - на 29 %, железистых эпителиальных образований - в 2,8 раза. Это происходило на фоне уменьшения площади мозгового вещества на 16 % по сравнению с таковой у интактных животных (табл. 1). Количество телец Гассаля значимо увеличивалось (4,84±0,75) по сравнению с контрольными значениями (2,67±0,59), отмечена тенденция к увеличению размеров железистых эпителиальных образований. Во всех зонах тимуса уменьшалась численность иммунобластов, малых лимфоцитов, клеток на стадии митоза и макрофагов на фоне возросшего числа средних лимфоцитов и эпителиоретикулярных клеток по сравнению с таковыми у интактных животных (табл. 2). Исключение составляла кортикомедуллярная зона, в которой количество иммунобластов возрастало. На 18-е сутки опухолевого роста в краевом и мозговых синусах тазовых лимфатических узлов определялись метастазы опухоли - крупные атипичные клетки, отличающиеся выраженным полиморфизмом (III стадия канцерогенеза - стадия метастазирования). По сравнению с контрольными значениями в тазовых лимфатических узлах площадь паракортикальной зоны уменьшалась на 20 % (табл. 3), наблюдались структурные признаки выраженной узелковой реакции (площадь вторичных лимфоидных узелков увеличивалась в 2,7 раза). Выявлено увеличение размеров мозговых тяжей на 18,2 %, В-зависимой зоны - на 24,5 %. Площадь мозговых синусов в лимфатических узлах уменьшалась на 25 %, в них наблюдались признаки лимфостаза (белковые сгустки). В герминативных центрах лимфоидных узелков, в сравнении с таковыми у интактных животных, число иммунобластов возрастало на 48 %, макрофагов - на 40 %, а в мозговых тяжах количество иммунобластов увеличивалось в 4 раза, незрелых плазматических клеток - на 40 %, макрофагов - на 41 % (табл. 4). На 28-е сутки рост опухоли простаты можно определить как инфильтрирующий, клеточные тяжи опухоли разрушали окружающую жировую клетчатку и поперечнополосатую мышечную ткань, врастали в сосуды, формируя опухолевые эмболы (IV стадия канцерогенеза). Паренхима опухоли составляла на 72,1±1,0 %, строма - 27,9±0,73 %, увеличивался на 23,5 % ядерно-цитоплазматический индекс клеток опухоли в сравнении с таковым на 18-е сутки эксперимента. В тимусе уменьшались размеры коркового и мозгового вещества по сравнению как с таковыми у интактных животных, так и с 18-ми сутками эксперимента. Площадь соединительнотканных структур органа увеличивалась на 25 % по сравнению с таковой у животных на 18-е сутки эксперимента (см. табл. 1). Количество телец Гассаля в тимусе значимо увеличивалось (до 4,79±0,52) в сравнении с имеющимися у интактных животных, отмечена тенденция к увеличению размеров железистых эпителиальных образований. Во всех зонах тимуса уменьшалась численность иммунобластов, малых лимфоцитов, митотически делящихся клеток и клеток с пикнотическими ядрами, макрофагов. Это происходило на фоне увеличения числа средних лимфоцитов и эпителиоретикулярных клеток (в подкапсульной зоне и в центральной части мозгового вещества) по сравнению с отмеченными у интактных животных. В сравнении с картиной на 18-е сутки эксперимента выявлены максимальные изменения цитоархитектоники кортико-медуллярной зоны тимуса и его мозгового вещества (уменьшение количества бластных форм лимфоидных клеток, митотически делящихся клеток и клеток с пикнотическими ядрами, эпителиоретикулярных клеток и макрофагов) (см. табл. 2). В синусной системе тазовых лимфатических узлов на 28-е сутки увеличивалось число опухолевых клеток, что свидетельствует об активации процесса лимфогенного метастазирования (крупные атипичные клетки с 2 или несколькими ядрами, значительное варьирование их формы и размеров). В мозговом веществе лимфатических узлов выявлены структурные признаки активации пролиферации клеток лимфоидного ряда: увеличивалось число иммунобластов, незрелых плазматических клеток (см. табл. 4). По сравнению с картиной на 18-е сутки опухолевой инвазии площадь паракортикальной (Т-зависимой) зоны уменьшалась на 11 %, а площадь мозговых синусов увеличивалась на 23,4 % (см. табл. 3), наблюдался выраженный лимфостаз. Обсуждение полученных данных . Известно, что рост злокачественных новообразований сопровождается продукцией ими веществ, вызывающих снижение либо полное блокирование противоопухолевого иммунного ответа [15]. Кроме подавления локального иммунного ответа, опухоль обладает прямым угнетающим влиянием на иммунные органы, что приводит к снижению ими продукции иммунокомпетентных клеток либо к выработке дефектных цитотоксических лимфоцитов, которые также могут служить источником происхождения иммуносупрессивных T-reg клеток [12, 14]. Результаты исследования ряда авторов показали, что при развитии опухолей инволюция тимуса и связанное с ней нарушение пополнения периферических Т-лимфоцитов лежат в основе развития Т-клеточного иммунодефицита [5]. Инволюция тимуса при росте опухоли у человека и экспериментальных животных изучается уже на протяжении нескольких десятков лет [5], при этом выявлены значительные различия в гистологических реакциях тимуса у человека и грызунов. Результаты проведенного нами морфологического исследования тимуса и регионарных к опухоли тазовых лимфатических узлов свидетельствуют, что в динамике развития экспериментальной опухоли простаты, в них происходят изменения структурной организации и цитоархитектоники, степень выраженности которых зависит от стадии злокачественной трансформации простаты. На 18-е сутки роста опухоли простаты (III стадия канцерогенеза, метастазы в регионарных лимфатических узлах) в тимусе выявлены признаки структурной дезорганизации (уменьшение размеров мозгового вещества, увеличение площади коркового вещества, железистых эпителиальных образований, соединительнотканных компонентов), сопровождающиеся уменьшением численности лимфоидных клеток в корковом и мозговом веществе при увеличении их количества в кортико-медуллярной зоне. Эти изменения можно расценить как проявления 2-й фазы акцидентальной инволюции органа [4]. Микроскопическое исследование тимуса обнаружило изменения в его эпителиальном компартменте: тенденцию к увеличению относительной площади железистых эпителиальных образований в сравнении с контрольными значениями, а также численности эпителиоретикулярных клеток. Данные литературы свидетельствуют, что железистые эпителиальные образования в тимусе являются функциональными структурами, присущими нормальному тимусу, значение которых заключается в усилении секреции тимусных гормонов при экстремальных воздействиях на организм [9]. Полученные нами результаты на 18-е сутки роста опухоли простаты сходны с данными других авторов, которые отмечали, что рост и формирование злокачественной опухоли приводит к акцидентальной инволюции тимуса и является следствием выраженной антигенной стимуляции [11], а также иммуносупрессивного действия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [13]. Данные нашего исследования тазовых лимфатических узлов показали, что на III стадии экспериментального канцерогенеза простаты (18-е сутки) с появлением в краевом и мозговых синусах лимфатических узлов крупных атипичных опухолевых клеток (метастазов), в них происходят характерные изменения структурной организации. Они, по-видимому, обусловлены инволютивными процессами в тимусе и свидетельствуют о нарушении их транспортной функции. В корковом веществе лимфатических узлов нами выявлены структурные признаки неполноценности местного иммунного ответа - уменьшение площади паракортикальной (Т-зависимой) зоны, увеличение размеров В-зависимой зоны, узелковая реакция (увеличение площади вторичных лимфоидных узелков). В мозговом веществе лимфатических узлов определялась характерная синусная реакция на метастазирование - сокращение размеров мозговых синусов, что показательно для поздних стадий канцерогенеза. Показано, что при раке простаты изменения в цитоархитектонике регионарных лимфатических узлов происходят еще до их колонизации опухолевыми клетками: уменьшается плотность расположения антигенпрезентирующих дендритных клеток, размеры паракортикальной зоны лимфатических узлов, число Т-лимфоцитов [10]. На заключительном этапе эксперимента (28-е сутки, IV стадия канцерогенеза - инвазия опухоли простаты за пределы капсулы) в тимусе выявлены характерные структурнофункциональные преобразования, свидетельствующие о прогрессировании процессов инволюции: уменьшались размеры коркового и мозгового вещества, значимо сокращалось количество бластных форм лимфоидных клеток, малых лимфоцитов, митотически делящихся клеток и клеток с пикнотическими ядрами, эпителиоретикулярных клеток и макрофагов. Эти данные согласуются с результатами других авторов, которые констатировали, что спустя несколько недель после инокуляции опухоли мышам происходит снижение массы тимуса, сопровождающееся опустошением коркового вещества с уменьшением количества малых и больших лимфоцитов [5]. Инвазия опухоли за пределы простаты на 28-е сутки эксперимента (IV стадии канцерогенеза) сопровождается увеличением числа метастазов в регионарные лимфатические узлы и характерными структурными преобразованиями, свидетельствующими об угнетении их иммунной и транспортной функций, что выражается в нарастающей гипоплазии паракортикальной зоны и узелковой реакции в корковом веществе. Как показали проведенные нами ранее исследования [2], окончательный этап опухолевой трансформации тканей простаты (28-е сутки) характеризуется увеличением количества кровеносных и лимфатических сосудов в строме опухоли. Содержание лимфатических сосудов нарастало как по сравнению с контролем (на 33,3 %), так и в сравнении с их числом на 18-е сутки роста опухоли. Существенным является и то, что параллельно происходило увеличение размеров мозговых синусов регионарных лимфатических узлов, по-видимому, обусловленное нарастанием объема лимфы, поступающей из опухолевой ткани, следствием чего является активация лимфогенного метастазирования. Таким образом, результаты проведенных нами исследований показали, что экспериментальная злокачественная опухоль простаты вызывает характерные преобразования цитоархитектоники центральных (тимус) и периферических иммунных органов (лимфатический узел), степень выраженности которых зависит от стадии канцерогенеза простаты. Морфологические преобразования в тимусе при экспериментальном канцерогенезе простаты свидетельствуют о его акцидентальной инволюции, которая сопровождается параллельными структурными преобразованиями регионарных лимфатических узлов.

作者简介

A. Lomshakov

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

Email: a.lomshakov@gmail.com

V. Astashov

Russian University of People’s Friendship

Email: vastashov3@gmail.com

Yu. Borodin

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

V. Kozlov

Russian University of People’s Friendship

Email: akvi13@yandex.ru

Yu. Antsyreva

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

Email: juliaaaster@gmail.com

O. Zayko

Russian University of People’s Friendship

Email: oleg.zayko@bk.ru

O. Kazakov

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

Email: kazakoff_oleg@mail.ru

参考

补充文件