THYMUS STRUCTURE AFTER PERCUTANEOUS EXPOSURE OF BLOOD TO LASER IRRADIATION OF DIFFERENT WAVELENGTH

全文:

Результаты многочисленных рандомизированных контролируемых исследований доказывают многообразные лечебные свойства низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), которые определяются следующими основными эффектами: активация микроциркуляции и обезболивание, рефлекторное, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие, активация пролиферации и регенерации тканей [4, 9, 11]. Существуют инвазивные и неинвазивные методы лазерного облучения крови. К инвазивным методам можно отнести внутривенное облучение крови (ВЛОК) и экстракорпоральное облучение крови, к неинвазивным - чрескожное (надвенное, транскутанное, наружное) лазерное облучение крови (ЧЛОК) [2]. Главным преимуществом ЧЛОК является отсутствие болевых ощущений во время процедуры облучения; при этом методе можно также избежать внутривенных инъекций. Из данных литературы известно, что воздействие НИЛИ на организм обладает иммуностимулирующим действием и может быть использовано для коррекции иммунного ответа при различных патологических процессах, сопровождающихся развитием иммунодефицитного состояния [4]. Наиболее распространёнными в лазерной терапии спектральными диапазонами являются ультрафиолетовый, синий, красный и инфракрасный спектр, по мере увеличения длины волны глубина проникновения низкоинтенсивного лазерного излучения в ткани возрастает, но при этом отмечено, что эффект воздействия НИЛИ существует независимо от длины волны НИЛИ [7]. Целью настоящего исследования являлось выявление морфологических особенностей тимуса крыс в нормальных условиях жизнедеятельности при чрескожном лазерном облучении крови с различной длиной волны в наиболее распространённых в лазерной терапии спектральных диапазонах, что может дать возможность подбирать необходимые параметры НИЛИ в программах лечения и реабилитации заболеваний, сопровождающихся угнетением Т-клеточного звена иммунного ответа. Материал и методы . Для исследования в качестве экспериментального животного были выбраны 50 крыссамцов линии Вистар исходной массой тела 180-200 г в возрасте 3-4 мес (ФГБНУ «Институт цитологии и генетики РАН», г. Новосибирск). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.77 г. с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС). Животных разделили на 5 групп, по 10 животных в каждой: 1) контроль (интактные животные), группы 2-5 составили животные, подвергнутые ЧЛОК. В работе использовали низкоинтенсивное лазерное излучение различных частей оптического спектра: ультрафиолетовый (длинноволновый лазер на молекулярном азоте, длина волны 337 нм), видимый голубой (аргоновый лазер - 488 нм), видимый красный (гелий-неоновый лазер - 632,8 нм), инфракрасный (коротковолновый арсенид-галлиевый лазер - 950 нм). Проводили лазерное облучение проекции бедренной вены крыс в течении 7 сут по 10 мин ежедневно (плотность потока мощности составляла 25 мВт/см2 для каждой длины волны НИЛИ). После эвтаназии под эфирным наркозом для гистологического исследования забирали тимус и фиксировали в растворе Теллесницкого [8]. Материал заливали в парафин; продольные срединные срезы толщиной 5 и 7 мкм далее окрашивали гематоксилином - эозином по Майеру и азуром II - эозином по Нохт-Максимову. С помощью окулярной тестовой системы при увеличении 16,32,200 и 1000 раз в тимусе производили определение содержания основных компонентов коркового и мозгового вещества с учетом соединительнотканных компонентов (капсула, трабекулы - междольковые перегородки) [8]. Железистые эпителиальные образования тимуса (эпителиальные тяжи, эпителиальные канальцы) оценивали морфометрически на тех же срезах при увеличении в 200 раз, подсчитывали все тимусные тельца (Гассаля) на срезах целого органа, а затем рассчитывали их количество на стандартной площади 10 мм2. В тимусе на площади среза, равной 2025 мкм², подсчитывали абсолютное количество иммунобластов, средних и малых лимфоцитов, незрелых и зрелых плазматических клеток, митотически делящихся и гибнущих клеток, макрофагов, моноцитов, эпителиоретикулярных клеток. Клетки тимуса подсчитывали в центральной части коркового вещества, кортикомедуллярной зоне и центральной части мозгового вещества. Полученные результаты обрабатывали с использованием методов вариационной статистики, определяли значимость различий с помощью критерия Стьюдента, значимыми считали различия при P < 0,05 [6]. Результаты исследования . Строма тимуса представлена соединительнотканной капсулой, от которой вглубь отходят перегородки, делящие его на дольки. От капсулы и междольковых перегородок отходят трабекулы. В капсуле, междольковых перегородках и крупных трабекулах проходят кровеносные и лимфатические сосуды. Паренхима тимуса разделена на корковое и мозговое вещество. Цитологический состав коркового и мозгового вещества включает зрелые и незрелые лимфоидные клетки - иммунобласты, средние и малые лимфоциты, митотически делящиеся клетки, клетки с пикнотическими ядрами, кроме того присутствуют макрофаги с фагоцитированными остатками погибших лимфоцитов, а также эпителиоретикулярные клетки. У интактных животных эпителиальный компонент тимуса был представлен диффузной сетью эпителиоретикулярных клеток, железистыми эпителиальными структурами и тимусными тельцами, последние состоят из нескольких концентрически расположенных эпителиоретикулярных клеток. Железистые эпителиальные структуры встречались в виде тяжей и трубчатых образований, стенка которых образована одним слоем эпителиоретикулярных клеток. Результаты морфометрии структурных компонентов тимуса и их клеточный состав у интактных животных и при ЧЛОК представлены в табл. 1 и 2. Результаты морфометрического исследования тимуса при ЧЛОК гелий-неоновым лазером показали, что относительная площадь мозгового вещества тимуса уменьшилась на 8,9 %. Площадь соединительнотканных структур тимуса увеличилась на 33,8 %, в основном за счет отека и разрыхления трабекул и капсулы (см. табл. 1). Количество телец Гассаля значимо не увеличивалось (2,94±0,75) по сравнению с контрольными значениями (3,67±0,59), однако отмечена тенденция к увеличению размеров железистых эпителиальных образований. Центральная часть коркового вещества тимуса в данной экспериментальной группе характеризовалась увеличением количества иммунобластов в 3,6 раза и средних лимфоцитов в 4 раза на фоне уменьшения числа малых лимфоцитов на 34 %, эпителиоретикулярных клеток - на 27 %, макрофагов - на 90 %. Среди клеток кортико-медуллярной зоны возрастало число иммунобластов на 68 %, средних лимфоцитов - в 2,2 раза. Количество макрофагов уменьшалось на 90 %, эпителиоретикулярных клеток - на 87 %, малых лимфоцитов - на 6 %. В центральной части мозгового вещества количество иммунобластов увеличивалось в 21 раз, средних лимфоцитов - в 6 раз. Это сопровождалось уменьшением числа эпителиоретикулярных клеток на 96 %, малых лимфоцитов - на 37 %, макрофагов - на 82 %. В центральной части мозгового вещества тимуса экспериментальных животных, по сравнению с таковым у интактных животных, возрастало число нейтрофилов в 7,87 раза и повышалось количество моноцитов (см. табл. 2). Относительная площадь коркового вещества тимуса при ЧЛОК арсенид-галлиевым лазером уменьшалась на 4 % по сравнению с таковой у интактных животных, а мозгового - увеличивалась на 10 %. Площадь соединительнотканных структур тимуса (капсула, трабекулы) увеличивалась на 2 %. Корково-мозговое соотношение тимуса уменьшалось на 13 %, паренхиматозностромальное - на 2 % (см. табл. 1). Количество телец Гассаля значимо не изменялось по сравнению с контрольными значениями, отмечена тенденция к увеличению относительных размеров железистых эпителиальных образований. В центральной части коркового вещества тимуса отмечено увеличение количества иммунобластов на 12 %, средних лимфоцитов - на 45 %, макрофагов - в 7,4 раза на фоне уменьшения числа малых лимфоцитов на 12 % и эпителиоретикуляных клеток - на 14 %. Среди клеток кортико-медуллярной зоны тимуса возрастало число иммунобластов (в 3,2 раза), средних лимфоцитов - в 2,6 раза, макрофагов - в 7,7 раза, эпителиоретикулярных клеток - в 8,6 раз, количество малых лимфоцитов уменьшалось на 28 %. В центральной части мозгового вещества динамика клеточного состава выражалась в увеличении численности иммунобластов в 9,5 раз, средних лимфоцитов - в 2,7 раза, макрофагов - на 43 %, эпителиоретикулярных клеток - на 20 %, что сопровождалось уменьшением количества малых лимфоцитов на 37 % (см. табл. 2). При ЧЛОК аргоновым лазером площадь коркового вещества тимуса уменьшалась на 4 %. Увеличивались на 32,6 % размеры соединительнотканных компонентов тимуса (капсула, трабекулы). Корково-мозговое и паренхиматозностромальное соотношения уменьшались в сравнении с контролем на 3 % и 27 % соответственно. Количество телец Гассаля значимо не изменялось (3,84±0,75) по сравнению с контрольными значениями, отмечена тенденция к увеличению размеров железистых эпителиальных образований. В центральной части коркового вещества тимуса выявлено увеличение числа иммунобластов на 23 %, средних лимфоцитов - в 2,5 раза, эпителиоретикулярных клеток - в 13 раз, макрофагов - в 5,2 раза. В корктико-медуллярной зоне тимуса встречались единичные иммунобласты, численность средних лимфоцитов увеличивалась на 64 %, эпителиоретикулярных клеток - в 2,7 раза, макрофагов в 7,7 раза. В центральной части мозгового вещества также возрастало число иммунобластов в 2,7 раза, средних лимфоцитов - в 2 раза, макрофагов - на 77 %, эпителиоретикулярных клеток - на 74 %. Увеличение числа макрофагов и эпителиоретикулярных клеток в зонах тимуса может свидетельствовать об активации ретикулоэндотелиальной системы в органе. При ЧЛОК лазером на молекулярном азоте отмечено резкое увеличение, по сравнению с показателями в контрольной группе, численности эпителиоретикулярных клеток и макрофагов в центральной части коркового вещества и кортикомедуллярной зоне органа. В центральной части коркового вещества тимуса число иммунобластов увеличивалось на 56 %, средних лимфоцитов - в 2,3 раза, макрофагов - в 7,7 раза, эпителиоретикулярных клеток - в 19 раз, а в корктикомедуллярной, или пограничной, зоне тимуса, численность иммунобластов увеличивалась на 21 %, средних лимфоцитов - в 3,5 раза, эпителиоретикулярных клеток - в 6,8 раза, макрофагов - в 10,4 раза. В центральной части мозгового вещества увеличивалось количество иммунобластов в 13,4 раза, средних лимфоцитов - в 3,1 раза, макрофагов - на 82 %. По сравнению с интактными животными и животными экспериментальных групп, у которых периферическую кровь облучали лазерами с другими длинами волн, при облучении крови лазером на молекулярном азоте в структуре тимуса наблюдалось максимальное увеличение доли соединительнотканного компонента и уменьшение площади коркового вещества. Так, площадь коркового вещества тимуса уменьшилась на 9 %, а мозгового - увеличилась на 6,6 %. Площадь соединительнотканных компонентов тимуса (капсула, трабекулы) увеличилась на 43 %. Корково-мозговое и паренхиматозностромальное соотношения уменьшились в сравнении с контролем на 15 % и 33 % соответственно. Количество телец Гассаля значимо возрастало (4,84±0,35) по сравнению с контрольными значениями, отмечена тенденция к увеличению размеров железистых эпителиальных образований. Обсуждение полученных данных . Результаты исследования макро-и микроанатомического строения и клеточного состава тимуса у контрольных животных, полученные в нашей работе, в целом согласуются с классическими представлениями о структуре тимуса [13, 14]. В нашем исследовании при выполнении чрескожного лазерного облучения крови происходило облучение близлежащих тканей, включая все слои кожи, возможные акупунктурные точки, нервные волокна, лимфатические узлы и сосуды, а также ткани мышц и костей. Экспериментальными исследованиями установлено, что проникающая способность излучения от ультрафиолетового до оранжевого диапазона увеличивается от нескольких микрометров (1-20 мкм) до 20-30 мм, с пиком проникающей способности в ближнем инфракрасном (при λ = 950 нм - 70 мм) [7]. Из четырех длин волн лазерного излучения, используемого в нашей работе, в полной мере воздействие на кровь оказывал инфракрасный (длина волны - 950 нм) и гелий-неоновый (632,8 нм) лазеры, а излучение лазера на молекулярном азоте (ультрафиолетовый диапазон) и аргонового лазера (видимый синий диапазон) лишь частично достигало крови, за счет воздействия на кровеносное и лимфатическое микроциркуляторное русло кожи и подлежащих мягких тканей. Лазерное излучение в ультрафиолетовой области (180-400 нм) преимущественно поглощается молекулами белков, липидов, наиболее сильно воздействуя на азотистые основания нуклеиновых кислот, поэтому они в большей мере подвергаются фотохимическим превращениям, что может привести к мутациям и гибели клеток [3]. Возможно, это и является причиной, почему при облучении тканей лазером на молекулярном азоте (длина волны - 337 нм) выявлены выраженные структурные преобразования в тимусе. В частности, мы обнаружили максимальное уменьшение размеров коркового вещества и увеличение доли соединительнотканных компонентов в тимусе. Это согласуется с данными литературы, свидетельствующими, что уменьшение размера или массы тимуса часто является одним из первых проявлений воздействий различной природы на тимус, характеризующих его как орган-мишень [10]. При воздействии НИЛИ с данной длиной волны обращало на себя внимание увеличение численности эпителиоретикулярных клеток и макрофагов в корковой и кортико-медуллярной зоне органа, что, по данным литературы, может свидетельствовать о функциональном напряжении тимуса и активации его гормональной функции [13]. Известно, что основная функция эпителиоретикулярных клеток состоит в создании специфической внутренней среды тимуса, в которой пролиферируют и созревают лимфоциты, а также выделение гормонов, синтезируемых в мозговом веществе и оказывающих системное действие [12]. Энергия фотонов аргонового лазера достаточна для нарушения сильных внутримолекулярных связей при терапевтической плотности потока [3]. Результаты исследования тимуса при воздействии излучения аргонового лазера (длина волны 488 нм) выявили в центральной части коркового и мозгового вещества выраженное увеличение числа митотически делящихся клеток в сравнении с аналогичным показателем в экспериментальных группах, где производили облучение иными лазерами. Это, вероятно, является специфическим морфологическим проявлением действия именно данной волны НИЛИ, поскольку, как свидетельствуют данные литературы, корковые лимфоциты (тимоциты) особенно восприимчивы к воздействию эндогенных кортикостероидов [10], стимуляция выработки которых наблюдается при низкоинтенсивном лазерном облучении крови [4]. Увеличение числа эпителиоретикулярных и делящихся клеток в тимусе при воздействии аргонового лазера может свидетельствовать об активации его гормональной функции, поскольку хемокины, которые вырабатываются стромальными клетками тимуса, имеют ключевую роль в локализации развивающихся Т-клеток [15]. Глубина проникновения излучения гелий-неонового НИЛИ (длина волны - 632,8 нм) составляет от 3 до 10 мм, поэтому при его воздействии происходит облучение не только кожи и прилегающих к ней тканей, но и крови внутри сосуда (бедренная вена). Полученные нами данные указывают, что ЧЛОК гелий-неоновым лазером вызывало значимое увеличение площади соединительнотканного компонента тимуса, преимущественно за счет разрыхления и отека капсулы и трабекул, способствовало активации процессов лимфопоэза в тимусе - значимо увеличивалось количество незрелых лимфоидных клеток во всех структурно-функциональных зонах, приводило к увеличению числа макрофагов и эпителиоретикулярных клеток. Сходные данные были выявлены при воздействии на область тимуса экспериментальных животных НИЛИ инфракрасного диапазона в импульсном режиме, которые свидетельствуют о развитии в тимусе активных компенсаторных процессов, состоящих в активации генома его клеток [5]. Можно предположить, что выявленные изменения обусловлены воздействием гелий-неонового лазерного излучения на неспецифические фотоакцепторы - биополимеры (белки, ферменты, биологические мембраны, фосфолипиды, пигменты и др.) и биологические жидкости (лимфа, кровь, внутриклеточная жидкость), которые достаточно хорошо изучены [7]. Возможно, что при воздействии данной длины волны лазерного излучения играет роль и известный эффект усиления проницаемости стенок сосудов [4], что в определенной степени подтверждалось увеличением количества клеток крови (нейтрофилов и моноцитов) в мозговом веществе тимуса. Излучение арсенид-галлиевого лазера (длина волны - 985 нм) наиболее глубоко проникает в ткани организма, воздействуя на глубоко расположенные кровеносные сосуды, что, по-видимому, и обусловливает выраженное фотобиостимулирующие действие. При воздействии этого лазера в тимусе выявлено выраженное увеличение размеров мозгового вещества по сравнению с таковыми у интактных животных и с полученными в других экспериментальных группах. Клеточный состав тимуса характеризовался значительным увеличением численности незрелых форм лимфоидного ряда в кортико-медуллярной области и в центральной части мозгового вещества, что может свидетельствовать об активации процессов пролиферации и миграции лимфоидных клеток [13]. Наши данные подтверждают результаты исследований других авторов, которые свидетельствуют, что под влиянием инфракрасного лазерного излучения происходит миграция клеток из коркового вещества тимуса в мозговое [1]. Показано также, что в качестве первичного действующего фактора при воздействии НИЛИ в инфракрасном диапазоне выступает термодинамический сдвиг, приводящий к высвобождению ионов кальция из депо с последующей активацией кальцийзависимых биохимических и физиологических процессов [3, 4, 7]. В целом можно заключить, что НИЛИ при чрескожном облучении проекции бедренной вены приводит к преобразованиям клеточного состава тимуса, степень выраженности которых зависит от длины волны лазерного излучения. Поскольку лазерное излучение в ультрафиолетовом (337 нм) и в видимом синем (488 нм) диапазонах поглощается в коже и подкожно-жировой ткани, не достигая крови в магистральных сосудах, можно предположить, что морфологические преобразования в тимусе происходят за счет реализации эффекта фотобиостимуляции, воздействия на специфические и неспецифические фотоакцепторы, попадающие в область облучения. При воздействии лазерным излучением в видимом красном (632,8 нм) и инфракрасном (985 нм) диапазонах спектра за счет увеличения глубины проникновения излучения происходит комплексное облучение тканей и крови в бедренной вене животных, что, по-видимому, путем подключения неспецифических механизмов фотоактивации крови приводит к характерным преобразованиям строения тимуса.

作者简介

V. Astashov

Russian University of Peoples’ Friendship

Email: vastashov3@gmail.com

V. Kozlov

Russian University of Peoples’ Friendship

Email: akvi13@yandex.ru

Yu. Borodin

Institute of Clinical and Experimental Lymphology

Yu. Antsyreva

Institute of Clinical and Experimental Lymphology

Email: juliaaaster@gmail.com

O. Zayko

Russian University of Peoples’ Friendship

Email: oleg.zayko@bk.ru

参考

补充文件