CHANGES OF THE MORPHO-FUNCTIONAL STATE OF RAT TESTES UNDER THE INFLUENCE OF HYPERTROPHY OF THE MAJOR SALIVARY GLANDS

全文:

Большие слюнные железы у грызунов являются не только экзокринными, но и эндокринными. Наряду с синтезом и секрецией пищеварительных ферментов, они продуцируют факторы роста и гормоны [3]. Ряд работ посвящены изучению влияния частичной или полной сиалоаденэктомии на строение и функциональное состояние семенников грызунов [9-12]. Вместе с этим влияние гипертрофии больших слюнных желез на органы репродуктивной системы у самцов грызунов изучено недостаточно. Цель нашего исследования - изучение влияния гипертрофии больших слюнных желез, вызванной многократной ампутацией резцов (МАР) на структуру семенников неполовозрелых и половозрелых крыс. Материал и методы. В эксперименте использованы неполовозрелые (21 сут, 45±10 г) - 35 интактных животных (группа ИН1) и 35, подвергшихся МАР (группа АР1); а также половозрелые (2 мес, 150±20 г) - 35 интактных (группа ИН2) и 35 - подвергшихся многократной ампутации резцов (группа АР2), белые беспородные крысы-самцы. Крысам групп АР1 и АР2 в течение 2 нед моделировали гипертрофию больших слюнных желез путем МАР. Нижние резцы крыс подрезали до уровня 1-2 мм выше десневого края каждые 3 сут (всего 5 ампутаций) [3]. Животных выводили из эксперимента путем асфиксии углекислым газом через 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 12 нед после начала эксперимента (первой ампутации резцов). Для гистологического и иммуногистохимического исследования использовали околоушные, подъязычные, поднижнечелюстные слюнные железы и семенники крыс. Работа выполнена с соблюдением Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ № 755 от 12.08.1987 г.) и Федерального Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» (от 01.01.1997 г.). Протокол исследования одобрен решением локального этического комитета ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России № 4253 от 28.09.2015 г. Материал для гистологического и иммуногистохимического исследования фиксировали в 10% формалине (рН 7,4) и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином, а также использовали для постановки иммуногистохимической реакции. На срезах семенников измеряли диаметр извитых семенных канальцев при помощи программы ImageJ 1.48 и определяли индекс сперматогенеза (ИС) по формуле ИС=(4 × а4+3 × а3 + 2 × а2 + а1)/50, где а4 - число канальцев, содержащих 4 популяции сперматогенных клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды), а3 - 3 популяции (сперматогонии, сперматоциты и сперматиды), а2 - 2 популяции (сперматогонии и сперматоциты), а1 - 1 популяцию (сперматогонии); 50 - количество проанализированных канальцев. На срезах больших слюнных желез иммуногистохимически с использованием кроличьих антикрысиных поликлональных антител (ab77851, Аbcam, Великобритания) выявляли эпидермальный фактор роста (ЭФР). В семенниках с помощью кроличьих антикрысиных поликлональных антител (ab2430, Аbcam, Великобритания) выявляли рецептор ЭФР (ErbB- 1). Иммуногистохимическое исследование проведено непрямым пероксидазным методом с использованием визуализирующей системы Novolink Polymer Detection System (Leica, Великобритания). Отрицательный контроль проводили путем нанесения на срезы вместо первичных антител раствора для разведения антител (AbDiluent, Leica, Великобритания). Подсчитывали количество ЭФР-позитивных клеток на 1 мм2 среза поднижнечелюстных желез неполовозрелых и половозрелых крыс. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «SPSS 17.0». Проверку закона распределения на соответствие нормальному осуществляли по критерию Манна-Уитни. Результаты морфометрического исследования представлены в виде средней и стандартного отклонения (x-±σ). Использованы критерий Шапиро-Уилка, однофакторный дисперсионный анализ для независимых выборок и однофакторный дисперсионный анализ повторных измерений для зависимых выборок, критерий Крускала-Уоллеса. Результаты исследования. МАР приводила к увеличению площади ацинусов поднижнечелюстных желез у крыс группы АР1 на 3-6-й неделе, группы АР2 - на 3-, 6-й и 10-й неделе по сравнению с таковой у животных групп ИН1 и ИН2 соответственно. Площадь ацинусов околоушных и подъязычных желез у неполовозрелых и половозрелых крыс в результате МАР не изменялась. У неполовозрелых и половозрелых крыс ЭФР обнаруживался в гранулах эпителиоцитов гранулярных извитых трубочек - уникального отдела внутридольковых протоков поднижнечелюстных желез грызунов. Реакция на ЭФР не выявлялась в околоушных и подъязычных железах. В поднижнечелюстных железах крыс группы ИН1 единичные ЭФР-позитивные клетки определялись на 2-4-й неделе, их количество нарастало к концу эксперимента (табл. ). Количество ЭФР-позитивных клеток в поднижнечелюстных железах у животных группы АР1 на 3-4-й неделе было ниже, а на 6-12-й неделе - выше, чем в начале эксперимента (2-я неделя). Количество ЭФР-позитивных клеток у животных группы АР1 было меньше, чем у крыс группы ИН1 со 2-й по 12-ю неделю эксперимента (см. табл. 1). Иммунопозитивные клетки в поднижнечелюстных железах у крыс группы ИН2 определялись на протяжении всего эксперимента (рис. , а), их количество возрастало к 8-12-й неделе (см. табл. ). Количество иммунопозитивных клеток у крыс группы АР2 на 3-12-й неделе было значимо больше, чем на 2-й неделе, однако меньше аналогичных показателей у животных группы ИН2 на протяжении всего эксперимента (см. рис. , б; табл. ). В семенниках крыс группы ИН1 на 2-й неделе эксперимента просвет в извитых канальцах определялся в 43%, с 3-й недели - в 100%. Поздние сперматиды появлялись на 2-й, а сперматозоиды - на 3-й неделе эксперимента. В межканальцевой соединительной ткани периваскулярно и перитубулярно располагались интерстициальные эндокриноциты, которые на 2-й неделе имели веретеновидную форму, тогда как с 3-й недели эксперимента становились округлыми. В семенниках крыс группы АР1 просвет в 51% извитых семенных канальцев обнаруживался на 2-й неделе, в 89% - на 3-й неделе, в 100% - с 4-й недели эксперимента. Поздние сперматиды начинали выявляться на 4-й неделе, а сперматозоиды - с 6-й недели эксперимента. На 2-, 3-й и 4-й неделе эксперимента в извитых семенных канальцах присутствовали округлые оксифильные клетки с гиперхромными ядрами. Количество извитых семенных канальцев, содержавших клетки с морфологическими признаками гибели, было максимальным на 3-й неделе эксперимента и достигало 46%. Интерстициальные эндокриноциты на 2-3-й неделе эксперимента имели веретеновидную форму и гиперхромные ядра. Индекс сперматогенеза у крыс групп ИН1 и АР1 возрастал в ходе эксперимента. У крыс группы АР1 он был ниже, чем у животных группы ИН1 со 2-й по 10-ю неделю эксперимента (табл. 2). В сперматогенном пласте у животных группы ИН2 на протяжении всего эксперимента обнаруживались все клеточные популяции (рис. , в). В семенниках у крыс группы АР2 сперматозоиды выявлялись с 3-й недели эксперимента (см. рис. , г). Округлые оксифильные клетки с гиперхромными ядрами на 2-й неделе эксперимента обнаруживались в составе сперматогенного пласта в 31% извитых семенных канальцев и не выявлялись у крыс группы ИН2. Интерстициальные эндокриноциты в семенниках крыс группы ИН2 имеют вид крупных округлых клеток, что свидетельствует об их высокой функциональной активности. В семенниках крыс группы АР2 интерстициальные эндокриноциты приобретали такой вид с 4-й недели эксперимента. Индекс сперматогенеза у крыс группы АР2 был ниже, чем у животных группы ИН2 на 2-й и 3-й неделе эксперимента (см. табл. ). Диаметр извитых семенных канальцев у крыс групп ИН1 и АР1 увеличивался со 2-й по 12-ю неделю. МАР у неполовозрелых крыс приводила к снижению этого показателя с 3-й по 10-ю неделю эксперимента по сравнению с таковой у животных интактной группы (см. табл. ). Диаметр извитых семенных канальцев у крыс групп ИН2 и АР2 увеличивался со 2-й по 8-ю неделю. После МАР у крыс группы АР2 этот показатель был меньше, чем у интактных животных, со 2-й по 10-ю неделю (см. табл. ). Клетки, содержащие иммунопозитивный ЭФР-рецептор, обнаруживались на протяжении эксперимента в семенниках крыс всех изученных групп. У животных групп ИН1 и АР1 ЭФР-рецептор выявлялся на плазмолемме и в цитоплазме сперматогоний (см. рис. , д, е), тогда как у животных групп ИН2 и АР2 - поздних сперматид (см. рис. , ж, з). Обсуждение полученных данных. Взаимное влияние больших слюнных и половых желез грызунов показано в ряде работ [2, 3, 12]. Удаление больших слюнных желез вызывает морфологические изменения (снижение количества всех популяций половых клеток, индекса сперматогенеза, уменьшение диаметра извитых семенных канальцев и др.) в семенниках крыс [9-11]. Известно также, что у людей, больных гипогонадизмом и хроническим простатитом, обнаруживается увеличение околоушных желез [1, 7]. МАР способствует гипертрофии больших слюнных желез, которая проявляется увеличением площади ацинусов, главным образом, поднижнечелюстных и в меньшей степени околоушных и подъязычных желез [4-6]. В нашем эксперименте, в отличие от данных А. Г. Бабаевой и Н. В. Юдиной [4], МАР не сопровождается гипертрофией семенников. Напротив, наблюдается снижение диаметра извитых семенных канальцев по сравнению с таковым у интактных крыс со 2-й по 10-ю неделю в обеих группах, подвергшихся МАР. У животных групп АР1 и АР2 индекс сперматогенеза ниже, чем у интактных крыс. Наличие в составе сперматогенной популяции погибших клеток в ранние сроки после формирования модели гипертрофии больших слюнных желез свидетельствует о нарушении сперматогенеза. МАР у крыс вызывает гипертрофию ацинусов поднижнечелюстных желез, в то время как эпителиоциты внутридольковых протоков не изменяются [3]. Гранулярные извитые трубочки являются источником большого количества биологически активных факторов [3], в частности ЭФР, который оказывает существенное влияние на строение и функциональное состояние семенников грызунов, участвуя в регуляции пролиферации и дифференцировки сперматогенных клеток [10, 11]. МАР приводит к снижению количества ЭФР-позитивных клеток в поднижнечелюстных железах неполовозрелых и половозрелых крыс по сравнению с контролем. ЭФР действует непосредственно на половые клетки, его рецепторы обнаружены на плазмолемме и в цитоплазме сперматогоний и поздних сперматид. В отличие от Т.Yang и соавт. [13] мы не наблюдали экспрессии рецептора ЭФР в интерстициальных эндокриноцитах семенников крыс. Однако ингибирование рецептора ЭФР значительно снижает сывороточное содержание тестостерона у мышей-самцов, что свидетельствует о модуляции функционального состояния интерстициальных эндокриноцитов [8]. Кроме того, на органы репродуктивной системы самцов грызунов влияют и другие биологически активные вещества, например, сиалорфин и паротин, продуцируемые ацинусами больших слюнных желез. Комплексная оценка выработки и секреции биологически активных веществ при гипертрофии больших слюнных желез, вызванной МАР, является предметом дальнейших исследований. Таким образом, гипертрофия больших слюнных желез, вызванная МАР у крыс, сочетается со снижением индекса сперматогенеза, появлением в составе сперматогенного пласта погибших клеток. МАР вызывает гипертрофию, главным образом, поднижнечелюстных желез. Вероятно, изменение морфофункционального состояния семенников крыс в результате МАР обусловливают эндокринные факторы именно поднижнечелюстных желез. Однако неизвестно влияние подрезания резцов крыс на функциональную активность клеток ацинусов больших слюнных желез.

作者简介

V. Ivanova

Siberian State Medical University

Email: ivvera92@rambler.ru

I. Mil’to

Siberian State Medical University; National Research Tomsk Polytechnic University

I. Sukhodolo

Siberian State Medical University

参考

补充文件