SEROTONINERGIC SYNAPSES ON THE VENTRAL DENDRITE OF THE MAUTHNER NEURON (ULTRASTRUCTURAL STUDY WITH IMMUNOGOLD LABELING)

全文:

В результате морфофункциональных исследований обнаружено, что вентральный дендрит (ВД), на котором оканчиваются нервные волокна, идущие из ипсилатерального тектума, в свою очередь, иннервируемого зрительным нервом от контралатерального глаза [15], реципрокно влияет на интегральную функциональную активность маутнеровского нейрона (МН), выражающуюся в свободном поведении моторной асимметрией золотой рыбки [9]. На это указывает то, что односторонняя дисфункция сопровождается повышением функциональной активности контралатерального МН, уменьшением размеров его ВД и дегенерацией большого количества афферентных синапсов на этом дендрите [2, 9]. Хотя механизм реципрокной регуляции функции МН на уровне ВД остается невыясненным, имеются основания предположить, что он связан с возбуждающей серотонинергической передачей. Во-первых, потому что она выступает в роли главного участника влияния на ВД [6], во-вторых, потому что на уровне латерального дендрита и аксонного холмика именно благодаря ее опосредованному воздействию через глицинергические тормозные терминали реципрокно модулируется возбудимость МН [8]. Цель настоящей работы — идетнтифицировать серотонинергические синапсы и выяснить их ультраструктурную организацию на уровне ВД, не исследованном ранее с указанных позиций. Материал и методы. Для послезаливочной иммунозолотой электронной микроскопии использовали разработанную нами методику [1]. Головной мозг рыбок (молодь золотых рыбок Carassius auratus, Оранда, 3–5 см, 12 особей) в течение 12 ч фиксировали смесью 0,5% глутаральдегида и 4% формалина на 0,1 моль какодилатном буфере c добавлением диметилсульфоксида, отмывали буфером, дофиксировали 2% четырехокисью осмия на том же буфере, обезвоживали в этаноле и заливали в эпон-812. Ультратонкие срезы для электронной микроскопии изготовляли на микротоме EM UC6 (Leica, ФРГ). Иммуноцитохимическую реакцию проводили на ультратонких срезах, уложенных на электронномикроскопические палладированные сеточки без подложки, протравленных 2% натрийпериодатом и 1% перйодной кислотой и отмытых 3 раза по 3 мин в фосфатном буфере (ФБ, 16,7 ммоль Na2HPO4, 3,3 ммоль KH2PO4, 150 ммоль NaCl, pH 7,4) с 0,1% тритоном Х-100. Сеточки последовательно обрабатывали во влажной атмосфере соответствующими реактивами, приготовленными на ФБ и раскапанными на пленку из парафильма на дне чашки Петри: сначала — 30 мин в суперблоке (Superblock-TBS, Pierse, Rockford, США), после отмывки — 30 мин 5% фетальной сывороткой, а затем, не отмывая, — 12 ч при 4 °С специфическими кроличьими антителами к серотонину (Sigma, США) в разведении 1:4000 с добавлением 0,1% тритона Х-100. В качестве контроля специфические антитела заменяли ФБ. Вслед за этим после отмывки в ФБ с 1 моль NaCl, 0,1% тритоном Х-100 и 0,1 моль глицином обрабатывали 1 ч при комнатной температуре вторичными антителами (козьи антикроличьи антитела, Sigma, США), меченными коллоидным 10 нм золотом. После этого срезы последовательно отмывали ФБ, дистиллированной водой, контрастировали 4% уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе BS-500 (Tesla, Чехословакия). Съемку вели на фотопленку, негативы обрабатывали и анализировали после их оцифровки с помощью сканера Epson V700 (Seiko, Япония). Результаты исследования. Исследования ВД МН показывают, что в контрольных ультратонких срезах при замене специфических антител буфером неспецифического связывания меченных золотом антител со структурами нервной ткани практически не происходит (рисунок, а), что является свидетельством высокой специфичности иммуноцитохимической реакции. Изучение препаратов, обработанных антителами к серотонину и вторичными антителами, меченными коллоидным золотом, показало, что метка связывается не всеми синапсами, расположенными на ВД и вблизи от него (см. рисунок, б–ж). Такое дифференцированное связывание метки в пределах одного среза относительно небольшого участка дендрита с определенными синапсами и отсутствие ее в соседних синапсах другого строения также свидетельствует об избирательности и специфичности примененной нами иммуноцитохимической методики. На практике такая абсолютная специфичность взаимодействия метки с мишенью наблюдается не всегда. Чаще она имеет количественный характер: больше метки видно на одних типах синапсов, меньше — на других. В последнем случае она встречается и в дендроплазме, что свидетельствует о фоновой неспецифичности. Тем не менее, анализ большого количества электронно-микроскопических снимков позволил дифференцировать различия и получить однозначные результаты, пригодные для последующих обобщений. Видно, что метка, как правило, обнаруживается в синаптических пузырьках. Сами меченые аксонные окончания относятся к синапсам определенного типа, отличающимся от других ультраструктурными признаками. Первый из них — это обязательное наличие в синаптическом контакте рядом с активной зоной (АЗ) десмосомоподобного соединения (см. рисунок, б) — атрибута возбуждающего синапса с регулируемой проводимостью. Среди других признаков следует указать на присутствие в бутоне нескольких митохондрий, небольшое количество округлых синаптических пузырьков, относительно малый размер АЗ, которая располагается в месте прилегания синапса к своей мишени, а также довольно часто встречающиеся пузырьки с электронно-плотной сердцевиной (см. рисунок, б, в). Некоторые меченые синаптические окончания располагаются на небольшом расстоянии от поверхности дендрита, напрямую контактируют с немечеными синаптическими бутонами, которые, в свою очередь, взаимодействуют через АЗ уже прямо с дендритом (см. рисунок, б), т. е. можно говорить о «первом уровне» немеченых синапсов и «втором уровне» серотонинергических синапсов. Другие располагаются непосредственно на стволе ВД, но свои АЗ формируют на рядом расположенных немеченых синаптических окончаниях, имеющих иное строение и контактирующих напрямую со стволом ВД (см. рисунок, в). При этом среди таких иммунопозитивных серотонинергических синапсов обнаруживаются как чисто химические серотонинергические синапсы, так и синапсы, относящиеся к смешанному типу, среднего (см. рисунок, г) и крупного размера (см. рисунок, д). Кроме химического сигнала через АЗ, они осуществляют электротоническую передачу через щелевое соединение. Похожая организация взаимосвязи меченых и немеченых аксонных окончаний выявлена также на теле МН. Имея подобную топографию, серотонинергические стволовые синапсы химического типа формируют с ВД десмосомоподобные синаптические соединения, но их АЗ располагаются на стволовых, немеченых синаптических окончаниях, находящихся рядом, т. е. описанные стволовые серотонинергические синапсы, формирующие АЗ со смежными бутонами другого типа, тоже можно рассматривать как аксосоматические, поскольку они управляют пресинаптическими бутонами, а не дендритом. Следует особо остановиться на описании немеченых синаптических окончаний «первого уровня», на которых оканчиваются описанные выше возбуждающие серотонинергические синапсы. Своими АЗ они обращены к стволу дендрита, не имеют контактов вне этого участка и, главное, не проявляют иммунореактивности (см. рисунок, е, ж). Кроме того, они имеют некоторые ультраструктурные особенности, отличающие их от иммунореактивных синапсов, главной из которых является отсутствие десмосомоподобных соединений. К другим характерным для них структурным чертам относятся большое количество мелких пузырьков, весьма протяженные АЗ, часто распространяющиеся на инвагинации, так называемые гребешки, как правило, обнаруживаемые внутри бутонов в виде двухконтурных вакуолей с синаптическими пузырьками, расположенными по внешней стороне. Следует указать также на наличие протяженных субповерхностных цистерн в районе прилегания синапса к стволу и почти полное отсутствие митохондрий в бутонах. В тех редких случаях, когда они встречаются, число их не превышает 1–2 (см. рисунок, ж). По указанным признакам такие синапсы с полным основанием могут быть отнесены к тормозным (ГАМКергическим) афферентным аксонным окончаниям. Обсуждение полученных данных. При проведении работы нам пришлось встретиться с определенными трудностями в строгой ультраструктурной идентификации синапсов, связанными с частичной деструкцией ткани в срезе после достаточно сильных химических воздействий натрийпериодата и перйодной кислоты, усугубляющей и без того весьма редкое одновременное присутствие всех исследуемых признаков в каждом конкретном сечении бутона. Тем не менее, сопоставление многочисленных ультраструктурных данных между собой дает возможность сделать ряд обобщений, указывающих на то, что использованная нами методика вполне приемлема. С ее помощью удалось дифференцировать разные типы синапсов, выявляемые на электронно-микроскопическом уровне после иммуноцитохимического мечения серотонина коллоидными частицами золота. Показано, что синаптические окончания на ВД МН золотой рыбки, по ряду ультраструктурных признаков отличающиеся друг от друга, имеют и разную нейротрансмиттерную природу. Существование возбуждающих серотонинергических синапсов, являющихся окончаниями нервных волокон, приходящих из тектума, иннервируемого зрительным нервом, было предположено еще на основании данных по монокулярной хирургической депривации и унилатеральной зрительной стимуляции [2]. Ранее синапсы, содержащие специфические мембранные рецепторы серотонина, были идентифицированы на МН (в том числе и на ВД) цихлидовых рыб Astatotilapia burtoni под световым микроскопом с помощью иммуногистохимической окраски [1]. Также иммунореактивность к серотонину была показана на светомикроскопическом уровне в области ВД МН у рыбок Danio rerio [7] и золотых рыбок [5]. Высказывались предположения, что это синаптические окончания тормозных интернейронов [5, 11] или возбуждающих спинномозговых нейронов на ВД [4]. Тем не менее, есть основания полагать, что обнаруженные серотонинергические синапсы принадлежат возбуждающим нервным волокнам, приходящим из тектума, иннервируемого зрительным нервом от контралатерального глаза. Такой вывод можно сделать из сопоставления данных ультраструктурной идентификации серотонинергических синапсов с полученными ранее данными, указывающими на то, что после длительной оптокинетической стимуляции или энуклеации глаза именно синапсы с указанными ультраструктурными признаками претерпевают запустевание или дегенерацию [2]. Кроме того, предположение о зрительной природе исследуемых синапсов в полной мере согласуется с электрофизиологическими и иммуногистохимическими данными о существовании возбуждающих синаптических влияний на ВД МН со стороны ипсилатерального и, в меньшей степени, контралатерального тектума [12]. Также важным результатом, на наш взгляд, является четкое доказательство того, что серотонин-иммунопозитивными оказываются синапсы как химического, так и смешанного типа. Первые, более многочисленные, по нашему мнению, ответственны за реципрокные отношения между активностью нервных волокон, приходящих из тектума, управляемого зрительным нервом, и функциональной активностью МН [9]. Их опосредованное взаимоотношение с ВД через тормозные синапсы само по себе предусматривает реципрокность влияния на нейроны. Выявление такой организации было вполне ожидаемым, поскольку аналогичное взаиморасположение и реципрокный на уровне электрофизиологических реакций пресинаптический эффект на МН иммуноцитохимически идентифицированных серотонинергических и тормозных (глицинергических) синапсов уже были известны в области аксонного холмика и тела МН [8]. Смешанные серотонинергические синапсы, обнаруженные впервые на ВД, вероятно, ответственны за прямую и быструю передачу возбуждающего зрительного сигнала на нейрон. Мы предполагаем, что именно они индуцируют потенциал действия МН, вызванный пугающим зрительным импульсом и инициирующий реакцию страха (startle-reflex) рыбки, ее быстрый отскок с помощью С-изгиба хвоста [3, 10]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о необычной иерархической организации синаптических окончаний нервных волокон, приходящих из тектума, являющегося зрительным анализатором, и их влиянии на МН через ВД. Они показывают также, что в регуляцию зрительной сигнализации, приходящей на ВД, вовлечена серотонинергическая нейротрансмиттерная система. В комплексе они объясняют механизм реципрокного управления интегральной функции МН со стороны зрительного аппарата.

作者简介

I. Mikheyeva

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: mikheirina@yandex.ru

Ye. Grigoriyeva

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

G. Mikhailova

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

R. Shtanchayev

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

L. Pavlik

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

D. Moshkov

RAS Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: d_moshkov@mail.ru

参考

补充文件