STRUCTURAL CHANGES OF THE ADRENAL CORTEX IN EXPERIMENTAL GENITAL HERPES VIRUS INFECTION

全文:

В многочисленных исследованиях сообщается о повреждающем влиянии вирусов простого герпеса 1-го и 2-го типов на клетки надпочечников, сопровождающемся репликацией вирионов. Однако в одних случаях исследователи наблюдали апоптоз клеток надпочечников [1, 5, 6], в других — в разной степени выраженные очаги некроза [8, 11]. Помимо трактовки способов патогенного влияния вирусов простого герпеса на клетки надпочечников, авторы расходятся и в оценке зон поражения: приводятся факты о репликации вируса и разрушении мозгового вещества [1, 13], пучковой и сетчатой зон коры [18]. Практически все исследования имеют вирусологический характер и посвящены анализу репликации вирусов. Способ заражения — чаще внутривенный или интраперитонеальный. В качестве инфектов применяют разные штаммы и концентрации вирусов. В совокупности это не соответствует естественному пути инфицирования и развития острого генитального герпеса у человека. Вместе с тем, существуют более адекватные модели, разработанные на половозрелых самках морских свинок. Эти экспериментальные животные высокочувствительны к возбудителю генитального герпеса, и острый период заболевания клинически проявляется у них, как и у человека, в виде специфического вульвовагинита с последующим формированием хронической рецидивирующей инфекции [16, 17]. Это позволяет использовать данные модели для углубленного изучения реактивных изменений и компенсаторно-приспособительных процессов в тканях надпочечника при генитальном герпесе. Цель настоящего исследования — оценка реактивных изменений коры надпочечника в экспериментальной модели острого генитального герпеса у половозрелых самок морских свинок. Материал и методы. Объектом исследования служили правый и левый надпочечники 12 половозрелых самок морских свинок (2 из которых составили группу контроля, 10 — группу инфицированных животных). Заражение производили штаммом MS вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) путем интравагинального введения 20 мкл вируссодержащего материала. Вирус предварительно был размножен на перевиваемой культуре клеток Vero. По данным анализа вагинальных мазков, все морские свинки в период заражения находились в фазе диэструса полового цикла. Надпочечники (правый и левый) фиксировали на 7-е сутки (в острый период, когда воспаление и специфические высыпания в области кожи и слизистой оболочки наружных гениталий отчетливо выражены) и на 21-е сутки (в период спонтанной реконвалесценции). В каждый срок эксперимента анализировали материал от 5 морских свинок. Выведение животных из опыта и взятие материала осуществляли после усыпления животных парами хлороформа в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных (1989)». Надпочечники фиксировали в 10% нейтральном формалине, готовили серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином—эозином. Поскольку все вирусы семейства Herpes viridae эпителиотропны, а возбудитель генитального герпеса обладает свойством инициировать воспаление, основное внимание было обращено на реакцию коры надпочечника, кортикостероциты (Ксц) которого имеют эпителиальную природу и синтезируют гормоны, участвующие в развитии воспалительных процессов. Для выявления вирусной природы повреждений Ксц использованы 2 тест-реакции на антигены вируса. Реакцию прямой иммунофлюоресценции на антигены ВПГ-2 проводили на депарафинированных срезах надпочечника. После промывки в дистиллированной воде срезы обрабатывали 3% перекисью водорода, затем фосфатным буфером (рН 7,4). Инкубацию срезов с поликлональными антителами к ВПГ-2 (Лабдиагностика, Россия), меченных флюоросцеин-изотиоцианатом, осуществляли в течение 90 мин при комнатной температуре. После промывки в фосфатном буфере (рН 7,4) и в дистиллированной воде срезы заключали в глицерин и просматривали под световым микроскопом Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) с люминесцентной приставкой MBQ 52 AC. Для электронной иммуноцитохимии использовали ультратонкие срезы надпочечника, заключенные в метакрилатную заливочную среду LR White (Polyscience GMBX, Германия). Cетки со срезами инкубировали в дистиллированной воде в течение 10 мин, далее 30 мин — в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере (рН 7,4). Инкубацию с первичными кроличьими поликлональными антителами к ВПГ-2 (Лабдиагностика, Россия) в разведении 1:100 осуществляли в течение 2 ч при температуре 37 °С. После отмывки в фосфатном буфере проводили инкубацию с антикроличьими антителами, конъюгированными с коллоидным золотом (Invitrogen, США) в течение 1 ч с последующей отмывкой в фосфатном буфере и фиксацией по методу S. Ito и M. Karnovsky [7]. Контрольные срезы инкубировали 2 чв 5% растворе бычьего сывороточного альбумина и с конъюгатами антител, меченных золотом. Срезы контрастировали по методу E. S. Reynolds [15]. Препараты изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEМ 100B (Jeol, Япония). Результаты исследования. Изменения гистологического строения коры надпочечника у всех инфицированных свинок в разгар заболевания (на 7-е сутки после введения вируса) были идентичными; разницы в реакции правого и левого надпочечников не отмечено. В клубочковой зоне коры на фоне общей сохранной гистологической структуры наблюдали локальные истончения зоны с признаками кровенаполнения сосудов и очаговыми нарушениями гистологического строения клубочков. При окраске гематоксилином—эозином Ксц таких клубочков имели светлую (оптически пустую) цитоплазму, сохранялось лишь ядро (рис. 1, а, б). На электронно-микроскопическом уровне в этих Ксц обнаружено разрушение мембранных органелл и присутствие различных мембранных структур, не свойственных этим клеткам в норме. Реакция иммунофлюоресценции на антигены ВПГ-2, как правило, была положительна в ядрах нескольких Ксц в каждом из очагов (рис. 2, а), а также в ядрах эндотелиоцитов рядом расположенных сосудов. При электронной иммуноцитохимии обнаружено, что метка коллоидного золота локализовалась в деструктивно измененных митохондриях (см. рис. 2, б) и в ядрах описанных выше Ксц с резко просветленной цитоплазмой. На остальных участках клубочковой зоны, как гистологическое строение, так и ультраструктура Ксц, практически не отличались от таковых в контроле, а результаты тест-реакций на антигены вируса были отрицательны. Пучковая зона коры надпочечников во всех случаях выглядела утолщенной по сравнению с контролем. На фоне обычного гистологического строения с расширенными капиллярами и отдельными диффузно расположенными Ксц с признаками пикноза ядра в этой зоне имелись крупные скопления гипертрофированных Ксц. Подобные скопления в контроле отсутствовали. По своей локализации скопления гипертрофированных Ксц часто топографически совпадали с очагами деструкции Ксц в клубочковой зоне. Светооптически Ксц в составе указанных скоплений утрачивали вид, свойственный им в норме (рис. 3, а): они имели крупные размеры и в разной степени вакуолизированную цитоплазму (см. рис. 3, б). Электронно-микроскопически в гипертрофированных Ксц были выявлены разрушенные митохондрии и гранулярная эндоплазматическая сеть, резко расширенные канальцы агранулярной эндоплазматической сети, отсутствие липидных включений. Вместе с тем, в таких скоплениях в ядрах только отдельных Ксц была отмечена положительная иммунофлюоресценция при реакции на антигены ВПГ-2, а метка коллоидного золота — в ядрах и митохондриях. Сетчатая зона коры была несколько утолщена по сравнению с контролем и содержала расширенные микрососуды. Ее Ксц выглядели гетероморфными: одни имели темную эозинофильную цитоплазму (ТКсц), другие — светлую вакуолизированную (СвКсц). Различий в светооптическом строении ядер ТКсц и СвКсц отмечено не было. Аналогичный гетероморфизм Ксц был присущ и сетчатой зоне контрольных надпочечников. Видимой разницы в соотношении ТКсц и СвКсц в контроле и опыте не отмечено. В обоих случаях СвКсц имели тенденцию группироваться вблизи венул (рис. 4), в то время как ТКсц располагались вокруг капилляров. Использованная реакция иммунофлюоресценции на антигены вируса позволила выявить присутствие последних только в отдельных Ксц сетчатой зоны надпочечников инфицированных морских свинок, определить принадлежность которых к ТКсц или СвКсц не представлялось возможным. Ни в одном из случаев в коре надпочечников не были обнаружены признаки воспаления с лейкоцитарной макрофагальной инфильтрацией, как не были отмечены и признаки апоптоза Ксц. Рядом с очагами деструкции Ксц в клубочковой зоне, а также на границе клубочковой и пучковой зон были обнаружены скопления малодифференцированных клеток небольшого размера с относительно крупным округлым или овальным гиперхромным ядром, окруженным узким ободком цитоплазмы. Часть этих клеток внедрялись в пучковую зону (рис. 5). Таким образом, в остром периоде развития генитального герпеса морфофункциональные изменения Ксц наиболее отчетливо проявлялись в клубочковой и пучковой зонах коры надпочечника. К 21-м суткам после инфицирования (период спонтанной реконвалесценции) гистологическое строение коры надпочечника у всех подопытных животных практически не отличалось от контроля. Ультраструктурные признаки Ксц всех зон коры соответствовали таковым в норме. В пограничной области между клубочковой и пучковой зонами располагались немногочисленные малодифференцированные клетки небольшого размера с гиперхромным ядром, окруженным узким ободком цитоплазмы. Обсуждение полученных данных. В остром периоде генитальной герпесвирусной инфекции наблюдаются структурные изменения коры надпочечников. Данные изменения связаны с присутствием в Ксц вируса, что подтверждают результаты двух параллельно выполненных тест-реакций. Выявленную разницу в присутствии антигенов вируса в Ксц разных зон коры надпочечника (градиент реакции иммунофлюоресценции на антигены вируса) можно трактовать в связи с особенностями кровоснабжения органа [2]. Капиллярная сеть клубочковой зоны, на которую распадаются многочисленные субкапсулярные артерии, является, по сути, первым (по вектору кровотока и, соответственно, вектору движения вируса) звеном в коре, где вирусы могут вступить в контакт с Ксц надпочечника. В пучковой и сетчатой зонах концентрация вирусов в крови, вероятно, снижается из-за их адгезии клетками клубочковой зоны, и специфическое мечение клеток на антигены вируса в этих зонах становится более редким явлением. Кроме того, имеются сведения [12], что разные концентрации преднизолона, дексаметазона, гидрокортизона способны уменьшить активность вирусной репликации до 99%. Очаговая деструкция Ксц клубочковой зоны коры надпочечников рассматривается как реакция на присутствие вируса. Однако в отличие от ранее полученных данных [1, 5, 6, 8, 11, 14] зарегистрированные изменения Ксц нельзя отнести ни к категории некротических, ни к категории апоптотических изменений. Гипертрофия Ксц пучковой зоны и появление скоплений Ксц с вакуолизированной цитоплазмой являются компенсаторной реакцией, направленной на усиление синтеза противовоспалительных гормонов и подавление острой воспалительной реакции в области входных ворот инфекции и, возможно, на снижение активности репликации вируса в самих надпочечниках [12]. В сетчатой зоне нами не было отмечено каких-либо структурных различий с контролем за исключением расширения микрососудов. Этот признак может служить косвенным указанием на возможную активацию поступления в кровь андрогенов, участие которых в развитии воспалительного процесса в области входных ворот инфекции также вероятно [19]. Связано ли это с присутствием вируса не ясно, поскольку в сетчатой зоне имму нопозитивные Ксц при реакции на антигены вируса были в абсолютном меньшинстве. Обнаружение на 7-е сутки малодифференцированных по светооптическим признакам клеток в клубочковой зоне и на ее границе с пучковой зоной, а также наличие этих клеток непосредственно в пучковой зоне мы расцениваем как их участие в клеточной регенерации в период спонтанной ремиссии герпесвирусной инфекции. Это согласуется с результатами исследований по регенерации коры надпочечников после гипертермических воздействий [9]. Автор указывает, что первое появление малодифференцированных клеток регистрируется под капсулой надпочечника примерно на 7-е сутки, далее клетки мигрируют вдоль капилляров по направлению к пучковой зоне, дифференцируясь впоследствии в типичные Ксц клубочковой и пучковой зон. По материалам проведенного исследования регенерация Ксц клубочковой зоны наступает к 21-м суткам, что хронологически согласуется с данными авторов, которые наблюдали на 20-е сутки появление субкапсулярно расположенных клеток клубочковой зоны после энуклеации надпочечников [4]. Регенерация Ксц клубочковой зоны, помимо участия малодифференцированных клеток [10], реализуется также за счет внутриклеточных механизмов [3]. В пучковой зоне восстановление обычной структуры Ксц происходит, вероятно, преимущественно путем внутриклеточной регенерации. Однако не исключается и участие малодифференцированных клеток. В сетчатой зоне не выявлены существенные морфофункциональные признаки повреждения Ксц. Итак, в использованной экспериментальной модели в остром периоде генитального герпеса развиваются реактивные изменения коры надпочечников в виде появления очаговых морфологических изменений Ксц в клубочковой зоне и формирования скоплений гипертрофированных (функционально напряженных) Ксц в пучковой зоне. Отмеченные нарушения строения не сопровождаются развитием воспаления, некроза, а также апоптоза Ксц. Выявленные реактивные изменения Ксц указанных зон имеют преимущественно обратимый характер, поскольку с наступлением спонтанной реконвалесценции (21-е сутки после инфицирования) они практически исчезают. Восстановление нормального гистологического строения клубочковой и пучковой зон протекает путем внутриклеточной регенерации и при участии малодифференцированных эпителиальных клеток надпочечника.

作者简介

Tat'yana Borovaya

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: tbor27@yandex.ru

N. Shevlyagina

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

A. Ivanova

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

N. Narovlyanskiy

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

N. Kalmykova

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

O. Tretyakov

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

L. Didenko

N. F. Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology

参考

补充文件