AGE-RELATED PECULIARITIES OF THYMUS REACTION TO THE EXPOSURE TO HELIUM-NEON LASER AND INJURED MUSCLE ALLOPLASTY WITH THE MUSCLE TISSUE FROM THE ANIMALS OF THE SAME AGE

全文:

С целью улучшения регенерации при имплан-снижение чувствительности Т-лимфоцитов к тации клеток и тканей широко применяется низ-чужеродному антигену, подавление активности коинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) [19]. антителообразования в В-лимфоцитах [12, 18]. НИЛИ способно вызывать обратимые разнона-Воздействие лазерного излучения может вызыправленные эффекты. В зависимости от дозы, вать дисфункцию ретикулоэпителиальных клеток режима и области облучения НИЛИ может ока-тимуса, способствуя нарушению синтеза важнейзывать как иммуностимулирующее, так и имму-ших тимических гормонов - тимозина-α и тимуносупрессирующее действие, вызывать деструк-лина, недостаточность которых, в свою очередь, тивные изменения в тимусе и периферических приводит к замедлению пролиферации и снижелимфоидных органах [2, 3, 5, 7, 11, 13]. Показано нию функции тимоцитов и лимфоцитов [6, 9]. В связи с этим вопрос о состоянии иммунной системы при использовании лазерного излучения для подготовки органов и тканей к аллопластике имеет большое практическое значение. Цель данной работы - изучить возрастные особенности реактивных изменений в тимусе у крыс в ходе регенерации мышц при аллопластике области травмы мышечной тканью животного того же возраста и предварительного воздействия лучей гелий-неонового (He-Ne) лазера на мышцы реципиента, подготавливаемые к операции, или на мышцы донора, из которых будет извлечена мышечная ткань для аллопластики. Материал и методы. Тимус был исследован у беспородных крыс-самцов в возрасте 1, 3-4 и 24-30 мес (по 24 животных в каждой возрастной группе) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные каждой возрастной группы были разделены на 2 подгруппы. У крыс 1-й подгруппы (n=12) обе задние конечности в области проекции икроножных мышц перед операцией в течение 2 нед подвергали предварительному курсовому воздействию лазерных лучей. Крыс 2-й подгруппы (n=12) не облучали. На следующий день после лазерного воздействия между подгруппами облученных и необлученных животных была проведена перекрестная аллопластика правых икроножных мышц с помощью мышечной ткани, извлеченной в момент операции из левой икроножной мышцы. Крыс оперировали под нембуталовым наркозом (по 0,04 г/кг) в асептических условиях. В результате в 1-й серии были крысы-реципиенты (1-месячные, взрослые и старые) с необлученными икроножными мышцами и имплантированной в область травмы предварительно облученной лазером мышечной тканью. Во 2-й серии были крысы-реципиенты (1-месячные, взрослые и старые) с предварительно облученными икроножными мышцами и имплантированной в область травмы необлученной мышечной тканью. Условия воздействия He-Ne-лазера (установка ОКГ-12, Россия): длина волны 632,8 нм, лазерный луч был расфокусирован с помощью линзы, диаметр поля облучения 2-2,5 см, плотность мощности составляла 2,5-3 мВт/см2. Облучение проводили в режиме: 10 экспозиций по 3 мин в течение 2 нед за исключением выходных дней, суммарно в дозе 4,5-5,4 Дж/см2 на каждую конечность. По завершении лазерного облучения каждая крыса получила дозу 9,0-10,8 Дж/см2. Животных выводили из опыта инъекцией больших доз нембутала. Крыс и их тимус взвешивали. Определяли относительную массу органа, принимая массу животного за 100%. Тимус исследовали через 7, 14 и 30 сут после аллопластики области травмы икроножных мышц, а также перед операцией у необлученных крыс и у облученных крыс после 10 сеансов лазерного воздействия (по 4 крысы на каждый срок исследования). Поскольку в группе 1-месячных крысят животных начинали облучать за 2 нед до операции, был исследован также тимус необлученных 2-недельных животных. Тимус фиксировали в смеси Карнуа, срезы толщиной 7-8 мкм окрашивали гематоксилином по Рего с докраской по Маллори. Относительную площадь коркового и мозгового вещества в дольках тимуса определяли с помощью тестовой окулярной сетки и бинокулярной лупы МБС-1 (ЛОМО, Россия) при увеличении 25. На 6-8 гистологических срезах, выбранных произвольно, подсчитывали количество точек, приходящихся на корковое и мозговое вещество и выражали в процентах от общего количества точек, подсчитанных на всем срезе тимуса, принимая его за 100. Подсчет проводили только в дольках, сохранивших свою структуру. Отдельно в корковом и мозговом веществе определяли митотический индекс тимоцитов (МИ, ‰) и долю лимфоцитов с кариопикнозом (%). В корковом веществе было просчитано 3500-4500 клеток, в мозговом веществе - 2000-2500 клеток. Количественные данные обрабатывали статистически, различия средних величин оценивали по критерию Стьюдента и считали их значимыми при P<0,05. Результаты исследования. У интактных 1-месячных крысят тимус состоял из двух крупных долей. Граница между корковым и мозговым веществом была четкая, корковое вещество значительно превалировала над мозговым, тимоциты в корковом веществе располагались плотно. В 1-й серии опытов через 7 сут после аллопластики четкость границ между корковым и мозговым веществом сохранялась, в корковом веществе отмечалось рыхлое расположение тимоцитов (рисунок, а). Через 14 сут реакция тимуса была более выражена. Визуально величина тимуса и площадь, занимаемая на срезе корковым веществом, уменьшались. В корковом веществе плотность расположения тимоцитов снижалась, отмечались небольшие очаги гибели лимфоцитов. На 30-е сутки тимус и количество коркового вещества в нем увеличивались, но описанные выше реактивные изменения в структуре тимуса местами сохранялись, что указывает на незавершенность процессов восстановления тимуса. Во 2-й серии опытов предварительному воздействию лазерного облучения подвергались мышцы крысят 2-недельного возраста. В 1-месячном возрасте границы между корковым и мозговым веществом были четкие, но уже во всем корковом веществе отмечалось рыхлое расположение лимфоидных клеток. Через 7 и 14 сут после аллопластики структура тимуса практически не изменялась (см. рисунок, б). К концу наблюдения (30 сут) полного восстановления не наблюдалось. Корковое вещество в тимусных дольках было сравнительно толстым, но среди рыхло расположенных лимфоидных клеток встречались очаги гибели лимфоцитов. Количественные показатели функционального состояния тимуса представлены в табл. 1. В 1-й серии опытов через 7 сут после аллопластики масса тимуса не изменялась, относительная площадь коркового вещества уменьшалась, МИ тимоцитов увеличивался, доля лимфоцитов с кариопикнозом имела тенденцию к увеличению. Реакция мозгового вещества была слабой. Через 14 сут по сравнению с 7-суточным сроком исследования реакция тимуса усиливалась, что могло быть связано с возросшей миграцией тимоцитов на периферию. Относительная масса тимуса резко снижалась и продолжала уменьшаться относительная площадь коркового вещества, доля лимфоцитов с кариопикнозом нарастала незначимо, но МИ тимоцитов сохранялся на высоком уровне. Усиливались реактивные изменения в мозговом веществе: увеличивались МИ тимоцитов и доля лимфоцитов с кариопикнозом. На 30-е сутки в тимусе отмечались процессы восстановления, но МИ тимоцитов в корковом веществе был в 1,2 раза ниже, чем в предыдущий срок исследования (наблюдалась тенденция к его снижению). Во 2-й серии опытов предварительное воздействие лазерного облучения на мышцы 2-недельных крысят сдерживало увеличение относительной массы тимуса, но не оказывало значительного влияния на функциональные показатели органа (сравнить 1-месячных интактных крыс до операции и 1-месячных крыс до операции после 10 сеансов лазерного облучения). В ответ на введение генетически чужеродной ткани реактивные изменения в корковом и мозговом веществе тимуса были слабые. Через 7 сут после аллопластики только МИ тимоцитов в корковом веществе значимо снижался по сравнению с таковым у 1-месячных облученных крыс до операции. Реакция усиливалась на 14-е сутки, значимые изменения происходили как в корковом, так и в мозговом веществе. На 30-е сутки восстановительные процессы были менее активны. Несмотря на то, что характер изменения изученных параметров был такой же, как и в 1-й серии опытов, активность восстановления во 2-й серии была ниже: более низкие относительная масса тимуса и МИ тимоцитов, чем на 14-е сутки исследования. У интактных взрослых крыс (3-4-месячных) структура тимуса практически не отличалась от таковой у молодых животных. Лишь в некоторых местах отмечалось рыхлое расположение тимоцитов. В 1-й серии опытов через 7 сут после аллопластики тимус был крупнее, чем у интактных животных, корковое вещество в нем преобладало над мозговым. В большинстве долек наблюдались агломерация тимоцитов, рыхлое расположение лимфоидных клеток и очаговая гибель лимфоцитов коркового вещества (см. рисунок, в). В дальнейшем реакция тимуса усиливалась. На 14-е сутки уменьшалась относительная площадь коркового вещества в дольках, везде отмечалось рыхлое расположение тимоцитов. Возрасло количество очагов, и они стали крупнее. Через 30 сут процесс восстановления тимуса был не завершен. Относительная площадь коркового вещества увеличилась, но встречались дольки с нарушенной структурой. Во 2-й серии опытов, после предварительного лазерного воздействия, величина тимуса у крыс перед операцией была меньше, чем у интактных необлученных взрослых животных. В дольках тимуса наблюдались довольно толстый слой коркового вещества и четкая граница между ним и мозговым веществом. Вместе с тем, во многих дольках в корковом веществе отмечались рыхлое расположение тимоцитов и очаги гибели лимфоцитов. Через 7 сут после аллопластики тимус выглядел крупнее, утолщались междольковые прослойки соединительной ткани, но структура долек тимуса изменялась незначительно по сравнению с таковой в тимусе у крыс до операции (см. рисунок, г). На 14-е сутки структурные изменения в тимусе были выражены значительнее. Четкость границы между корковым и мозговым веществом в дольках сохранялась, но количество коркового вещества уменьшалось. В нем чаще встречались очаги гибели лимфоцитов. На 30-е сутки после операции все еще отмечались структурные изменения в тимусных дольках. Количественные показатели функционального состояния тимуса представлены в табл. 2. В 1-й серии опытов через 7 сут после аллопластики масса тимуса увеличивалась по сравнению с таковой у 3-4-месячных крыс до операции. На фоне увеличения относительного содержания коркового вещества в тимусе и доли лимфоцитов с кариопикнозом МИ тимоцитов снижался. Реакция мозгового вещества была слабой. Через 14 сут по сравнению с 7-суточным сроком исследования масса тимуса резко снижалась. Уменьшилась относительная площадь коркового вещества. МИ тимоцитов увеличивался при одновременном возрастании доли лимфоцитов с кариопикнозом. Усиливались реактивные изменения в мозговом веществе: на фоне лишь тенденции к снижению МИ тимоцитов значимо увеличивалась доля лимфоцитов с кариопикнозом. На 30-е сутки, по сравнению с предыдущим сроком исследования, в тимусе наблюдались процессы восстановления, увеличивалась относительная площадь коркового вещества, снижалась доля лимфоцитов с кариопикнозом как в корковом, так и в мозговом веществе, но МИ тимоцитов был сравнительно низким. Во 2-й серии опытов при предварительном лазерном облучении мышц у взрослого реципиента масса тимуса перед операцией, по сравнению с таковой у интактных животных, снижалась, но показатели функциональной активности тимуса возрастали: увеличивалась относительная площадь коркового вещества, повышалась пролиферативная активность тимоцитов (тенденция к увеличению) и увеличивалась доля лимфоидных клеток с кариопикнозом. Однако реактивные изменения в ответ на введение генетически чужеродной ткани как в корковом, так и мозговом веществе тимуса были слабее, чем в 1-й серии опытов. Так, через 7 сут после аллопластики масса тимуса увеличивалась по сравнению с таковой у взрослых облученных крыс до операции, но в корковом веществе значительно снижался МИ тимоцитов, а в мозговом веществе увеличивалась доля лимфоцитов с кариопикнозом. На 14-е сутки реактивность тимуса повышалась, что выражалось в резком снижении массы тимуса, уменьшении относительной площади коркового вещества и повышении в нем МИ тимоцитов. Показатели функциональной активности в мозговом веществе не изменялись. На 30-е сутки в тимусе также отмечалось увеличение некоторых функциональных показателей по сравнению с таковыми в предыдущий срок исследования, но МИ тимоцитов был на более низком уровне. Тимус у старых крыс (24-30-месячных) был небольшого размера и состоял из двух узких неравных долей, в которых наблюдались разрастание соединительнотканной стромы и увеличение количества жировой ткани. В результате лимфоэпителиальная ткань в тимусе сохранялась лишь в виде отдельных островков (долек), разделенных жировой тканью. Мозговое вещество превалировало над корковым. Местами нарушалась четкость границ между ними. В 1-й серии опытов через 7 сут после аллопластики в дольках тимуса с относительно сохранившейся структурой отмечались уменьшение относительной площади коркового вещества (см. рисунок, д), рыхлое расположение тимоцитов и увеличение доли лимфоцитов с кариопикнозом в нем. Оголялись большие участки ретикулоэпителиальной стромы. В дальнейшем в ходе восстановления оперированных мышц постепенно нарастало число долек с инволютивными изменениями. Через 14 сут после операции полная инволюция коркового и мозгового вещества наблюдалась уже во многих дольках, однако еще сохранялись дольки, в которых можно было определить их соотношение. К 30-м суткам тимус состоял из мелких долек. Отмечались как инволютивные изменения в них, так и формирующееся корковое вещество (в виде узкой прерывающейся полоски или более широкой непрерывной полосы). Во 2-й серии опытов предварительное лазерное облучение икроножных мышц, подготавливаемых к аллопластике, оказывало угнетающее воздействие на тимус у старых крыс. Тимус был небольшого размера. В его дольках преобладали инволютивные изменения. Через 7 сут после аллопластики были обнаружены разрастание междольковой соединительной ткани и замещение лимфоэпителиальной ткани жировой. На 14-е сутки во всем тимусе наблюдалась полная инволюция коркового и мозгового вещества (см. рисунок, е). Через 30 сут в тимусе, по-видимому, начинались процессы восстановления. Так, уже в некоторых дольках отмечалось формирование тонкого коркового и широкого мозгового вещества, но четкая граница между ними видна была не везде. Количественные показатели функционального состояния тимуса представлены в табл. 3. В 1-й серии опытов через 7 сут после аллопластики активность тимуса повышалась: значимо увеличивалась масса тимуса, а в сохранившихся дольках - относительная площадь коркового вещества и МИ тимоцитов. Доля лимфоцитов с кариопикнозом возрастала. На 14-е сутки эти показатели в корковом веществе снижались, но усиливалась реакция в мозговом веществе тимуса: увеличивался МИ тимоцитов, и намечалась тенденция к увеличению доли лимфоцитов с кариопикнозом. Через 30 сут там, где в дольках можно было разграничить корковое и мозговое вещество, были отмечены некоторые признаки восстановления (увеличение относительной площади коркового вещества и усиление в нем пролиферативной активности тимоцитов по сравнению с показателями на 14-е сутки). Однако масса тимуса не увеличилась по сравнению с массой тимуса у интактных старых крыс до операции. Во 2-й серии опытов после лазерного воздействия функция тимуса перед операцией снижалась. Масса тимуса уменьшалась в 1,44 раза по сравнению с таковой у интактных необлученных животных. При этом, несмотря на увеличение относительной площади коркового вещества и доли лимфоцитов с кариопикнозом, МИ тимоцитов имел тенденцию к снижению. Реакция мозгового вещества в тимусе была слабой. Через 14 сут после аллопластики в дольках тимуса наблюдалась полная инволюция коркового и мозгового вещества, поэтому МИ и долю лимфоцитов с кариопикнозом в них определить не представлялось возможным. Через 30 сут тимус окончательно не был восстановлен. Несмотря на то, что масса тимуса была выше на 8,7%, чем масса тимуса у облученных крыс до операции, изменения функциональных показателей были определены только в дольках, в которых уже различалось корковое и мозговое вещество. В большинстве долек наблюдались деструктивные изменения. Обсуждение полученных данных. Полученные результаты показали, что в обеих сериях опытов у молодых, взрослых и старых крыс в тимусе наблюдались гистологические, морфометрические и цитологические изменения, свидетельствующие о происходящих функциональных перестройках. Поскольку по условию эксперимента в каждой серии опытов одно и то же животное было и донором, и реципиентом, то генетические различия у животных обеих серий, т. е. варианты несовместимости мышечной ткани в обеих сериях, одинаковы, что позволило сравнить между собой результаты 1-йи 2-й серий. Реакция тимуса на имплантацию генетически чужеродной ткани у животных всех исследованных возрастных групп в 1-й серии опытов (необлученный реципиент и облученный мышечный аллотрансплантат) была более активна, чем во 2-й серии (облученный реципиент и необлученный мышечный аллотрансплантат). Так, в каждой группе крыс в 1-й серии уже через 7 сут после аллопластики практически все изучаемые показатели морфофункционального состояния тимуса значимо отличались от таковых у интактных крыс соответствующего возраста до операции. Во 2-й серии опытов у всех предварительно облученных животных реакция тимуса на аллопластику была слабее. Через 7 сут после операции изменения затрагивали в основном МИ тимоцитов и проявлялись его значимым снижением в корковом веществе тимуса и наличием к снижению в мозговом веществе. У старых крыс на 14-е сутки наблюдалась полная инволюция коркового и мозгового вещества в дольках тимуса. Выявленные различия в реакции тимуса на аллопластику у крыс в 1-йи 2-й сериях опытов, очевидно, объясняются неодинаковой активностью тимуса, соответственно, у необлученных и облученных крыс-реципиентов перед операцией. Регистрируемые морфофункциональные изменения в тимусе облученных He-Ne-лазером крысреципиентов перед операцией и в ходе последующего восстановления мышц после аллопластики (2-я серия) говорят о его более низкой функции. Подобные структурные и цитологические изменения в тимусе крыс-реципиентов были описаны некоторыми исследователями ранее при ксенопластике кожного лоскута в условиях подавления иммунной активности с помощью введения иммунодепрессантов [8]. По условию эксперимента предварительному курсовому лазерному облучению подвергались задние конечности крыс в области проекции икроножных мышц. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о возможности дистанционного влияния на иммунную систему организма при воздействии лазера на различные участки поверхности кожи, в том числе и при облучении задних конечностей [2, 3, 5, 7, 11, 13]. Согласно современным представлениям, кожный покров вместе с другими органами представляет единую диффузную нейроиммуноэндокринную систему [10, 14]. В эпидермисе и дерме кожи, как известно, присутствуют иммунные клетки: кератиноциты, клетки Лангерганса и эпидермотропные Т-лимфоциты [17, 20]. Кератиноциты содержат тимопоэтин и тимический фактор и способствуют созреванию Т-лимфоцитов подобно кортикальному эпителию в тимусе. Воздействие лазерного облучения стимулирует пролиферацию кератиноцитов [21], выработку ангиогенного фактора Т-лимфоцитами [16]. При транскутанном воздействии лазерного света в тканях улучшается микроциркуляция, в плазме циркулирующей крови повышаются концентрации ростовых факторов и цитокинов, способных влиять на лимфоидную ткань [4]. Воздействие лазерного излучения, как и любого другого внешнего фактора, способствует развитию общего адаптационного синдрома и активации стрессреализующих систем организма [3, 9]. Результаты данного исследования показали, что в условиях лазерного воздействия повреждения скелетных мышц и имплантации генетически чужеродной ткани в травмированные скелетные мышцы стрессорный эффект усиливается, и возрастает нагрузка на тимус у крыс-реципиентов. Но изменения морфофункциональной активности тимуса различались как в зависимости от условий воздействия He-Ne-лазера (на мышцу реципиента или имплантируемую мышечную ткань), так и возраста животного. У предварительно облученных лазером 1-месячных крысят перед операцией значимых изменений исследуемых показателей не наблюдалось по сравнению с интактными необлученными животными того же возраста. Можно отметить лишь тенденцию к снижению массы тимуса. У взрослых крыс, несмотря на увеличение ширины коркового вещества в дольках тимуса, усиливался пикноз лимфоцитов и значимо снижалась масса тимуса. У облученных старых крыс перед операцией к тому же наблюдалась тенденция к снижению МИ тимоцитов. Реакция тимуса после аллопластики скелетных мышц (снижение пролиферативной активности тимоцитов на 7-е сутки у молодых и взрослых крыс и инволюция в дольках тимуса в течение 14 сут у старых крыс) также говорит о том, что функция тимуса была снижена перед операцией. Как известно, повышение митотической активности тимоцитов направлено, прежде всего, на восстановление тимуса [1]. Отмеченные различия, очевидно, связаны с возрастной инволюцией иммунной системы. Согласно современным представлениям [15], у молодых крыс миграция, пролиферация, созревание тимоцитов, секреторная активность эпителиальных клеток довольно активны. С увеличением возраста животных постепенно снижаются абсолютная масса тимуса, количество лимфоидной ткани и увеличивается площадь, занимаемая соединительнотканной стромой и жировой тканью. Нарушается кортико-медуллярная структура органа, ослабляется функция кортикомедуллярного барьера, что приводит к миграции в кору тимуса нехарактерных для нее клеток, например, В-лимфоцитов. Снижаются пролиферативная и секреторная активность эпителиальных клеток и концентрация гормонов в тимусе. При старении активизируются тучные клетки, макрофаги. Однако тимус у старых животных полностью не утрачивает своих функций, и миграция лимфоидных клеток и секреция тимусных гормонов продолжаются, но, как установлено, на сравнительно низком уровне. Изменения функциональных показателей в тимусе старых крыс, отмеченные нами в обеих сериях опытов, подтверждают этот факт. Итак, предварительное воздействие He-Neлазера в изученных дозе и режиме облучения на мышечный аллотрансплантат (1-я серия) или на мышцу, подготавливаемую к операции (2-я серия), оказывает влияние на функциональную активность тимуса реципиента. При этом, у молодых, взрослых и старых крыс-реципиентов во 2-й серии опытов предварительное лазерное облучение снижало функцию тимуса перед операцией, что выражалось в уменьшении реактивных изменений в ответ на аллопластику в начальные сроки восстановительного процесса в мышцах. Эффект нарастал с увеличением возраста животного.

作者简介

N. Bulyakova

RAS A. N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution

Email: bulyakova38@mail.ru

V. Azarova

RAS A. N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution

Email: vazarova@mail.ru

参考

补充文件