PECULIARITIES OF THE CELLULAR COMPOSITION OF SPLENIC LYMPHOID TISSUE IN MICE AFTER LONG-TERM USE OF LIGHT WATER AND IRRADIATION

全文:

В настоящее время продолжается активный поиск средств, снижающих повреждающее действие ионизирующих облучений на организм человека [3, 9], что особенно важно для обеспечения радиационной безопасности экипажа космонавтов [8, 9, 11]. Экспериментальные исследования последних лет показали, что использование легкоизотопной воды (воды, очищенной от дейтерия) до облучения животных увеличивает выживаемость животных, предотвращает снижение их массы, восстанавливает гемопоэз и может применяться как средство, замедляющее процессы старения [2, 3, 5], что указывает на выраженные радиопротекторные свойства «легкой» воды [6, 8, 9]. Отмечено, что употребление легкоизотопной воды усиливает продукцию аденозинтрифосфата в клетках и повышает энергетические ресурсы организма [9, 12], в связи с чем применение ее в клинической практике дает положительный эффект при лечении многих видов заболеваний (онкологических, почечно-каменной болезни, колита и др.) [11, 12]. Значительный интерес представляет изучение воздействия легкоизотопной воды на органы иммуногенеза. Однако в литературе практически нет сведений, касающихся морфофункционального состояния органов иммунной системы при действии легкоизотопной воды в условиях облученного организма. В связи с этим целью данного исследования являлось изучение перестройки клеточного состава лимфоидной ткани селезенки у мышей после длительного употребления легкоизотопной воды с последующим гамма-облучением в 50 рад. Материал и методы. Экспериментальная часть работы выполнена на базе Института медико-биологических проблем (ИМБП) РАН. Для получения воды с пониженным содержанием дейтерия (дейтерия и кислорода 18О) использовали метод ректификации [7] на лабораторной установке ИМБП РАН. Содержание дейтерия в легкоизотопной воде по результатам лазерной спектрометрии составило 35 ppm. Полученная вода максимально очищена от солей и других примесей, поэтому наиболее адекватным контролем для легкоизотопной воды в данном случае является дистиллированная вода, в которой отсутствуют соли [4, 5]. Эксперимент проведен на мышах-самцах Balb/с 3-месячного возраста. Изучены 2 группы животных. 1-я (подопытная) группа мышей в течение 2 мес в свободном доступе получали легкоизотопную воду. Мыши 2-й (контрольной) группы 2 мес получали дистиллированную витаминизированную воду. После употребления легкоизотопной и дистиллированной воды проводили облучение животных в ИМБП РАН на установке РХ-y-30. Экспериментальных животных подвергали гамма-облучению 60Со дважды по 25 рад - в суммарной дозе 50 рад, что составляет 0,5 Гр. Мощность дозы составляла 0,32 сантиГр/мин. После облучения мыши продолжали принимать легкоизотопную и дистиллированную витаминизированную воду до периода забоя. Спустя 7, 15 и 30 сут после окончания облучения, животные выведены из эксперимента методом цервикальной дислокации в соответствии с приказом № 742 Министерства высшего и среднего специального образования СССР «Об утверждении Правил проведения с использованием экспериментальных животных» от 13.11.1984 г. Программа экспериментов рассмотрена и одобрена комиссией по биоэтике ИМБП РАН. В эксперименте использованы по 10 мышей в каждой группе (всего 60 особей). Селезенку фиксировали в 10% формалине, проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы органа толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином, азуром II-эозином. Под микроскопом DM2500 (Leica, Германия) изучали качественный и количественный клеточный состав лимфоидных структур селезенки мышей (центров размножения лимфоидных узелков и периартериальных лимфоидных муфт - ПАЛМ) на единице площади гистологического среза (в 880 мкм²). Проведена статистическая обработка цифрового материала по программе «Statistika 6.0» и Excel. Значимыми считали различия при P<0,05. Результаты исследования. У мышей на 7-е сутки после облучения в центрах размножения лимфоидных узелков и ПАЛМ при употреблении легкоизотопной воды содержание молодых клеток, особенно бластов, и количество клеток с картинами митозов меньше (в 4,1-5,0 ив 2,8-2,9 раза соответственно), чем при употреблении дистиллированной воды (рисунок, а, б). Доля деструктивно измененных клеток в этот срок опыта в центрах размножения лимфоидных узелков значимо выше при употреблении легкой воды, чем дистиллированной воды (10,8±1,2 и 22,3±1,9% соответственно; см. рисунок, а, б). В ПАЛМ доля этих клеток сохраняется на примерно одном уровне в изучаемых группах мышей (10,2±1,1 и 12,5±1,3%, различия незначимы). При этом в подопытной и контрольной группах мышей в центрах размножения лимфоидных узелков отмечается равное содержание плазмобластов (по 0,70%), малых лимфоцитов (12,3±1,0 и 10,2±0,9%) и макрофагов (различия незначимы) (см. рисунок, а, б). При употреблении легкой воды на 7-е сутки после облучения в ПАЛМ выявлены незрелые и зрелые плазматические клетки (1,10±0,10% плазмобластов и 0,30±0,10% плазмоцитов), которые отсутствуют при употреблении дистиллированной воды. В ПАЛМ после действия легкой воды отмечается большее содержание малых лимфоцитов на 6,5%, а макрофагов в 1,6 раза при равном уровне деструктивно измененных клеток в изучаемых группах животных (различия незначимы, см. рисунок, в, г). Спустя 15 сут после облучения мышей после употребления легкой и дистиллированной воды в центрах размножения лимфоидных узелков и ПАЛМ выравниваются показатели содержания бластов (различия незначимы, см. рисунок, в, г). При этом число клеток с картинами митозов в ПАЛМ в 1,8 раза больше при употреблении легкой воды, чем дистиллированной (различия значимы). В изучаемых зонах органа после употреблении легкой воды на фоне уменьшения числа незрелых форм плазматических клеток значимо увеличивается доля зрелых (антителопродуцирующих) плазматических клеток, особенно в ПАЛМ (в 1,9 раза) и меньше - в центрах размножения лимфоидных узелков (в 1,5 раза). Наряду с этим, на 15-е сутки после облучения в подопытной группе мышей при употреблении легкоизотопной воды, в центрах размножения лимфоидных узелков и ПАЛМ содержание малых лимфоцитов превышает контрольные показатели в 2,0 и 1,2 раза (11,9±1,0 и 24,7±1,9% малых лимфоцитов в центрах размножения; 39±3 и 43±3% в ПАЛМ соответственно, различия значимы). В этот срок опыта после действия легкой воды в центрах размножения лимфоидных узелков отмечается более высокое число разрушающихся клеток (в 1,3 раза, P<0,05), тогда как в ПАЛМ их число значимо не отличается от контрольных значений. Та же закономерность отмечается и в соотношении макрофагов, число которых значимо (в 1,2 раза) превышает контрольное значение в центрах размножения узелков при употреблении легкой воды, незначимые их различия - в ПАЛМ в изучаемых группах (2,50±0,10 и 2,9±0,3% соответственно). В отдаленный период, спустя 30 сут после гамма-облучения мышей, в центрах размножения лимфоидных узелков после употребления легкой воды содержание молодых форм клеток меньше, чем при употреблении дистиллированной воды. Однако в этот период в ПАЛМ в подопытной группе мышей выявлено в 1,3 раза больше бластных форм и обнаружены клетки с картинами митозов, отсутствующие в контроле (см. рисунок, в, г). В этот период в центрах размножения лимфоидных узелков сохраняются плазматические клетки (1,4±0,3%), которые полностью исчезают в контрольной группе. В ПАЛМ число этих клеток в 3,3 раза больше, чем при употреблении дистиллированной воды, в том числе сохраняются антителопродуцирующие (зрелые) плазматические клетки (0,60±0,10%), отсутствующие в контроле (различия значимы при Р=0,05). На 30-е сутки после облучения, по сравнению с 7-ми и 15-ми сутками опыта, при употреблении легкой и дистиллированной воды в ПАЛМ и центрах размножения лимфоидных узелков показатели деструкции клеток постепенно снижаются. Исключение составляют показатели деструкции при употреблении дистиллированной воды в центрах размножения лимфоидных узелков, где во все сроки опыта число деструктивно измененных клеток незначимо колеблется в небольших пределах (от 10,8±1,2 до 11,9±0,7%). В большей степени число разрушенных клеток уменьшается в ПАЛМ при употреблении дистиллированной воды (в 1,9 раза). При употреблении легкоизотопной воды деструкция клеток наиболее активно снижается (в 2,0 раза) в центрах размножения лимфоидных узелков (от 22,3±1,9 на 7-е сутки до 11,5±0,8% на 30-е сутки) и значительно меньше - в ПАЛМ (в 1,3 раза). В ПАЛМ на фоне снижения деструкции клеток число макрофагов в 1,7 раза больше при употреблении легкой воды, чем дистиллированной (см. рисунок, в, г, различия значимы). Обсуждение полученных данных. Результаты исследования показали, что после гамма-облучения мышей (в 50 рад) при употреблении ими легкоизотопной и дистиллированной воды на протяжении всех сроков эксперимента (от 7 до 30 сут) происходит перестройка клеточного состава морфофункциональных зон селезенки. Установлено, что при приеме легкоизотопной воды на 7-е сутки после облучения лимфоцитопоэз ниже, чем после употребления дистиллированной воды. Это подтверждается более низким содержанием митотически делящихся клеток, бластов и более высоким уровнем деструкции клеток. Заметная перестройка клеточного состава структурных зон селезенки после облучения происходит с 15-х суток эксперимента. Установлено, что на 15-е сутки после облучения при употреблении легкой воды в ПАЛМ в большей степени, чем в центрах размножения лимфоидных узелков, увеличивается доля бластов, клеток с картинами митозов и плазмоцитов, что свидетельствует об опережающем восстановлении функциональной активности ПАЛМ. Увеличение числа отмеченных видов клеток в ПАЛМ после употребления легкой воды связано, видимо, с усилением притока малодифференцированных клеток по микроциркуляторному руслу, где происходит их дальнейшая трансформация в зрелые клетки, которые способны к иммунному ответу [7]. На 30-е сутки опыта отмечена дальнейшая перестройка клеточного состава лимфоидных зон органа. Так, в ПАЛМ после употребления легкоизотопной воды преобладающее содержание молодых клеток и клеток с картинами митозов связано с более активными процессами лимфоцитопоэза по сравнению с таковыми при применении дистиллированной воды [7]. Важным показателем состояния местного иммунитета является высокое содержание в изучаемых структурных зонах селезенки плазматических клеток у животных, употреблявших легкую воду, при полном отсутствии этих клеток у получавших дистиллированную воду, что свидетельствует об активном уровне иммуноцитопоэза и усилении реакций гуморального иммунитета в органе в отдаленные сроки после облучения [3, 10]. Результаты исследования показали также, что после употребления легкой воды в изученных зонах селезенки число молодых форм клеток и клеток с картинами митозов от 7-х к 30-м суткам опыта увеличивается, что указывает на усиление лимфоцитопоэза в пострадиационный период [7, 11]. Вместе с тем, установлено, что наиболее уязвимой морфологической зоной в селезенке в отдаленные сроки после облучения животных (на 30-е сутки) при употреблении легкой воды являются центры размножения лимфоидных узелков. Полученные результаты показали, что при употреблении легкоизотопной воды в результате перестройки клеточного состава в центрах размножения лимфоидных узелков содержание клеток с картинами митозов и бластных форм, характеризующих состояние лимфоцитопоэза в органе, значительно меньше, чем при употреблении дистиллированной воды. После употребления легкоизотопной воды наиболее выраженные процессы восстановления клеточной структуры от 7-х до 30-х суток отмечаются в ПАЛМ. Полученные результаты согласуются с данными А. А. Ярилина [10] о том, что при облучении животных в органах иммуногенеза В-клетки более радиочувствительны по сравнению сТ-клетками. Выявлено, что наиболее значительный эффект воздействия легкой воды проявляется в ПАЛМ на 30-е сутки после облучения, в период, когда процессы лимфоцитопоэза и созревания антителопродуцирующих плазматических клеток протекают значительно активнее, чем при действии дистиллированной воды. Известно, что при радиационном воздействии в органах иммунной системы усиливаются процессы деструкции клеток с последующим уменьшением количества малых лимфоцитов [7, 10]. Настоящее исследование показало, что наиболее стабильной популяцией клеток в ПАЛМ селезенки являются именно малые лимфоциты. Стабилизирующим фактором популяции малых лимфоцитов в ПАЛМ, вероятно, является воздействие легкой воды. Полученные результаты согласуются с данными других авторов [1, 6], отметивших, что при употреблении легкой воды уже на 3-и сутки после облучения мышей низкими дозами (в 25 рад) клеточный состав тимуса и его функциональная активность восстанавливаются быстрее, чем в селезенке. Исходя из литературных и собственных данных, отмеченное усиление процессов восстановления в ПАЛМ, по сравнению с центрами размножения лимфоидных узелков при приеме легкой воды после высоких доз облучения (50 рад), связано, видимо, с активным поступлением в селезенку Т-лимфоцитов из тимуса. Таким образом, исследование показало, что в отдаленные сроки пострадиационного периода (через 30 сут) восстановление морфофункционального состояния структурных зон селезенки протекает более активно при употреблении легкоизотопной воды, чем при дистиллированной, что свидетельствует о ее иммуномодулирующих свойствах. Установлено, что в селезенке у мышей зона созревания Т-клеток (ПАЛМ) является более устойчивой к облучению, чем зона созревания В-клеток, что связано с усилением клеточного иммунитета в организме в отдаленные сроки после облучения при употреблении легкоизотопной воды.

作者简介

D. Grigorenko

RAS Research Institute of Human Morphology

Email: dinagrigorenko@yahoo.com
Laboratory of Functional Anatomy

参考

补充文件