CELLULAR COMPOSITION OF THE LAMINA PROPRIA OF JEJUNAL MUCOUS MEMBRANE IN C57BL/6 MICE DURING THE RECOVERY PERIOD AFTER PROLONGED SPACE FLIGHT

全文:

Активное изучение космического пространства ставит новые задачи перед космической медициной для сохранения здоровья будущих астронавтов [9]. Для обеспечения длительных полетов разрабатываются новые программы по усовершенствованию условий жизнеобеспечения человека и животных. В частности, одной из таких программ явилось создание биоспутника «Бион-М1», запущенного с мышами на борту [2]. На пребывание человека и животных в условиях околоземной орбиты реагируют все системы организма, а после завершения полета резистентность организма некоторое время остается сниженной, что непосредственно связано с состоянием иммунной системы [5, 7]. Подавляющее большинство работ, посвященных ее изучению у субъектов, побывавших в космосе, имеют физиологическую направленность [6, 7, 9], значительно меньше морфологических исследований [3, 4], хотя именно строение лимфоидных органов и их структур определяет физиологические показатели иммунной системы. Условия космоса требуют особенностей жизнеобеспечения человека (животных), в частности, приема и состава пищи (корма), обладающей специфическими физическими свойствами, что не может не оказывать влияния на состояние стенки кишечника, в том числе и на его иммунокомпетентные лимфоидные структуры [1, 10]. Однако неизвестно, в какие сроки после приземления происходит восстановварения и их лимфоидной ткани. В связи с этим целью данного исследования явилось изучение клеточного состава собственной пластинки слизистой оболочки тощей кишки у мышей после завершения длительного космического полета. Материал и методы. По программе полета «Бион-М1» [2] исследованы 2 группы мышей-самцов С57BL/6 в возрасте 4-5 мес. В первую (контрольную) группу входили 6 мышей, которых содержали в стандартных условиях вивария. Вторая (полетная) группа животных (n=5) была исследована на 7-е сутки после завершения 30-суточного полета на биоспутнике. Различия в содержании животных заключались и в получаемом ими корме. Мыши контрольной группы в свободном доступе питались стандартным сухим гранулированным кормом. Экспериментальная группа мышей в период полета получала пастообразный корм, приготовленный из стандартного комбикорма, в состав которого были введены вода (76-78%) и казеин в качестве загустителя. Эвтаназию осуществляли методом цервикальной дислокации, одобренной комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН ГНЦ РФ. Фрагменты начального отдела тощей кишки фиксировали в 10% нейтральном формалине, после обезвоживания заливали в парафин, срезы толщиной 5 мкм окрашивали азуром II - эозином (для проведения цитологического анализа) и гематоксилином - эозином (БиоВитрум, Россия) (для обзорного изучения). Исследовали клеточный состав собственной пластинки слизистой оболочки в центральной части ворсинок (СПВ) и между криптами (СПК). Клетки лимфоидного, фибробластического ряда, макрофаги, а также гранулоциты и клетки, находящиеся в состоянии деструкции, подсчитывали под микроскопом Leica DМ 2500 (Leica, Швейцария) при об. 100, ок. 10, для чего использовали 25-узловую сетку (с шагом 10 мкм), вмонтированную в окуляр микроскопа. Определяли абсолютное и относительное содержание (в %) всех клеток на стандартной площади гистологического среза, равной 880 мкм². Статистический анализ содержания клеток осуществляли с использованием программного обеспечения Statistica 6. и Excel. Различия считали значимыми при Р≤0,05. Работу с мышами проводили в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (г. Страсбург, 18 марта 1986 г.) [13], а также с приказом № 742 Министерства высшего и среднего специального образования СССР «Об утверждении Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» от 13.11.1984 г. Результаты исследования. Анализ клеточного состава СПВ у контрольных животных показал, что на стандартной площади среза располагается 41,2±1,9 клетки. Самыми многочисленными среди них являются малые лимфоциты (рисунок), которые составляют около 1/3 от всех клеток (12,0±1,0 клетка в абсолютном выражении или 28,6±1,7% от общего числа клеток). Значительно меньше содержится плазмоцитов и плазмобластов -10,31%, при этом доминируют плазмоциты (3,3±0,5 клетки или 8,9±1,6%), плазмобласты встречаются в 6 раз реже (0,53±0,21 клетки или 1,4±0,5%). Изредка встречаются сегментоядерные нейтрофилы (0,73±0,20 или 1,8±0,5%). Эозинофилы в СПВ у контрольных животных также редки (0,40±0,21 клетки или 0,9±0,5%). Процесс деструкции клеток у живот ных контрольной группы выражен слабо. На стандартной площади среза присутствует всего 1,33±0,22 разрушающихся клеток (3,2±0,5% от всего клеточного состава). Чрезвычайно редко встречаются большие лимфоциты (0,07±0,06 клетки). Бластные формы и делящиеся клетки не обнаружены. В СПК у контрольной группы животных на стандартной площади среза насчитывается 40,1±1,6 клетки. Основную их часть (66,6±1,5%) составляют клетки стромы (26,8±1,3 клетки). Четверть клеток (25,3±1,4%) приходится на малые лимфоциты (10,2±0,7 клетки). Средних лимфоцитов содержится в 15 раз меньше, чем малых лимфоцитов (0,67±0,18 или 1,7±0,5%). В отличие от СПВ, в СПК плазматические клетки встречаются крайне редко (см. рисунок). Как плазмобластов, так и плазмоцитов насчитывается всего по 0,07±0,06 клетки на стандартной площади среза (0,16±0,15 и 0,18±0,17% соответственно). Малочисленную группу также составляют нейтрофилы (1,33±0,26 клетки или 3,5±0,8%). Еще реже встречаются эозинофилы (0,40±0,16 или 1,0±0,4%) и макрофаги (0,07±0,06 или 0,18±0,17%). Процесс деструкции клеток в СПК кишки у контрольной группы животных также выражен слабо (0,53±0,19 деструктивно измененных клеток или 1,3±0,5%). Через 7 сут после приземления у животных, побывавших в космосе, отмечаются изменения в клеточном составе как СПВ, так и СПК. В СПВ общее количество клеток на стандартной площади среза у экспериментальных животных равно 36,2±0,8. В основном это клетки стромы, на которые приходится половина присутствующих здесь клеток (18,3±0,8 клетки или 50,5±2,2%). Малые лимфоциты составляют четвертую часть клеток СПВ (9,8±0,7 или 7,0±1,8%). Средние лимфоциты встречаются в 7 раз реже, их доля равна 3,7±0,7% (1,33±0,24 клетки на стандартной площади среза). Плазматические клетки представлены в основном плазмоцитами (1,5±0,4 клетки или 4,1±1,1%), а их незрелых форм (плазмобластов) всего 0,8±0,5% (или 0,27±0,15 клетки). Среди клеток в СПВ встречаются нейтрофилы, на долю которых приходится 6,9±1,2% (2,5±0,4 клетки). Эозинофилы практически отсутствуют (0,07±0,06 или 0,20±0,20%). Несколько чаще отмечаются макрофаги (0,27±0,11 клетки или 0,8±0,3%) и клетки, находящиеся в состоянии деструкции (1,87±0,26 или 5,2±0,8%). На 7-е сутки после приземления животных в СПК насчитывается 36,0±1,8 клетки на стандартной площади среза. Среди них половину составляют стромальные (18,5±1,2 клетки или 51,8±2,9%). Менее многочисленными являются малые лимфоциты, на долю которых приходится 31,9±2,3% (11,6±1,2 клетки). Средние лимфоциты встречаются гораздо реже: 0,60±0,18 на стандартной площади среза (1,6±0,5%). Плазматические клетки также являются редкими элементами и представлены, главным образом, плазмоцитами (0,93±0,22 клетки или 2,5±0,6%). Плазмобласты практически отсутствуют (0,07±0,06 или 0,17±0,17%). Другие гранулоциты - нейтрофилы, представленные преимущественно сегментоядерными клетками, встречаются в бóльшем количестве. На стандартной площади среза их насчитывается 2,5±0,5 клетки (7,2±1,4%). Макрофаги представлены всего 0,27±0,11 клетками и составляют 0,66±0,29% от общего числа клеток. Доля клеток, находящихся в состоянии деструкции, у животных, побывавших в длительном орбитальном полете, равна 3,8±0,9% (1,33±0,28 на стандартной площади среза). Обсуждение полученных данных. Исследование клеточного состава собственной пластинки слизистой оболочки тощей кишки у мышей через 7 сут после орбитального полета показало, что в сравнении с контрольными животными полного восстановления клеточных популяций ни в ворсинках, ни в области крипт не происходит. Эти данные согласуются с результатами исследований, полученными после полета животных (крыс, монгольских песчанок) на биоспутниках «Космос-782» и «Фотон-М3» [3, 4]. Как показали наши исследования, в СПВ кишки сниженными оказались абсолютные показатели содержания средних (в 1,6 раза) и малых лимфоцитов (1,2 раза). При этом изменения относительного содержания этих клеток мало отличаются от изменений абсолютных показателей. Аналогичные результаты были получены в крови космонавтов после 18-суточного полета [11]. В СПВ у экспериментальных животных число больших лимфоцитов после приземления животных оказывается выше контрольных показателей (в 4,7 раза), но при этом их доля среди клеток СПВ в 7,5 раза ниже показателей у животных контрольной группы. На 7-е сутки восстановления животных отмечаются сниженные абсолютные показатели содержания и плазматических клеток: плазмобластов (в 2 раза), плазмоцитов (в 2,2 раза). Аналогичным образом изменяются и относительные показатели содержания этих клеток. Уменьшение количества плазматических клеток в ворсинках может быть объяснено ускоренной деструкцией этих клеток, а также торможением процессов трансформации клеток, косвенным подтверждением чего служит невысокое содержание в ворсинках средних лимфоцитов и плазмобластов. Уменьшенное содержание лимфоцитов и плазматических клеток в ворсинках у животных, побывавших в космосе, является свидетельством неполного восстановления лимфоидной ткани спустя 7 сут после их приземления, что согласуется с данными других исследователей [8]. В то же время, увеличение абсолютного количества больших лимфоцитов можно расценивать как благоприятный фактор, способствующий восстановлению клеточных популяций. Отсутствие в СПВ бластных форм и митотически делящихся клеток при пониженном содержании средних лимфоцитов позволяет высказать предположение о задержке в ворсинках процессов бласттрансформации [11, 14]. Подавление бластогенной активности лимфоцитов было отмечено и у космонавтов после космических полетов, что связывали с отсутствием гравитационного вектора [14]. В области крипт разница в содержании лимфоцитов в контрольной группе мышей и на 7-е сутки после длительного пребывания в космосе менее выражена, чем в ворсинках. Количество средних и малых лимфоцитов у экспериментальных животных практически достигает контрольных показателей. Доля малых лимфоцитов даже несколько увеличивается (в 1,2 раза). Появляется небольшое количество больших лимфоцитов, которые отсутствовали у контрольных животных. Содержание плазмобластов не отличается от такового в контроле, но количество плазмоцитов в 13,3 раза превосходит показатели в контрольной группе (в 14 раз в процентном выражении). Это свидетельствует об усилении местного иммунитета в стенке тощей кишки спустя 7 сут после приземления животных. Изменения количества гранулоцитов одинаковы как в СПВ, так и СПК. Число эозинофилов на 7-е сутки восстановления животных после полета в этих зонах тощей кишки оказывается в 5,7 раза ниже контрольных показателей (относительное содержание в 4,5 и 5,9 раза соответственно). Количество нейтрофилов в стенке кишки после полета, наоборот, оказывается увеличенным: в ворсинах - в 3,5 раза (относительное содержание - в 4 раза), а в области крипт - в 1,9 раза (относительное содержание - в 2 раза). Увеличение числа нейтрофилов отмечено также в селезенке у крыс после полета на биоспутнике « Космос-782» [4]. У человека на 7-е сутки после длительного космического полета отмечалось повышение фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов, при этом синтез цитокинов снижался [8]. Имеются также данные, свидетельствующие, что в наземных экспериментах на людях активность нейтрофилов снижается, уменьшается титр лизоцима [11]. В целом, исследователи отмечают значительное ослабление иммунной защиты организма человека в период пребывания в условиях космического полета и после приземления [5, 7, 8]. Это сопровождается усилением вирулентности экзогенной и эндогенной микрофлоры [12], что увеличивает риск развития инфекционных заболеваний различной этиологии [7, 8]. На 7-е сутки после приземления животных по сравнению с контрольной группой в исследованных зонах тощей кишки наблюдается повышенное число клеток с отеком цитоплазмы и кариолизисом. В ворсинках деструктивно измененных клеток несколько больше, чем в области крипт. Однако в ворсинках у экспериментальных животных число разрушающихся клеток по сравнению с таковым у контрольных мышей больше в 1,4 раза, а в области крипт - в 2,5 раза. Меньшее количество разрушающихся клеток в ворсинках, вероятнее всего, связано с более благоприятными условиями для резорбции погибающих клеток, а также продуктов их распада и активной всасывающей функцией в лимфатическое русло. Макрофаги как в ворсинках, так и в области крипт кишки, встречаются нечасто. Их количество после приземления животных увеличивается: в ворсинках - в 2 раза, в области крипт - в 3,8 раза. Увеличение числа этих клеток, как и нейтрофилов, вероятнее всего, обусловлено деструктивными процессами, которые продолжаются в стенке кишки и после полета и, возможно, изменениями пристеночного слоя слизи и активизацией населяющей кишку микрофлоры [8, 12]. Клетки стромы, представленные в собственной пластинке слизистой оболочки кишки, главным образом, фибробластами и фиброцитами, являются доминирующими. На их долю у контрольных и экспериментальных животных приходится в СПР половина клеток, а в СПК - более половины. У животных, побывавших в космосе, по сравнению с контрольной группой количество этих клеток в СПК оказывается несколько уменьшенным (в 1,3 раза), в СПВ оно не снижается. Отсутствие полного восстановления лимфоидной ткани в собственной пластинке слизистой оболочки тощей кишки у мышей C57BL/6 спустя 7 сут после 30-суточного орбитального полета можно объяснить повторным стрессом, испытываемым животными в период приземления, а также необходимостью их адаптации к новым условиям существования.

作者简介

G. Aminova

RAS Institute of Human Morphology

Email: lab-funkanat@yandex.ru
Laboratory of Functional Anatomy

参考

补充文件