THE DISTRIBUTION OF HEME OXYGENASE-2 IN THE BRAINSTEM NUCLEI OF RATS

全文:

В последние годы получены весомые доказательства в пользу того, что монооксид углерода (СО) играет роль в различных функциях ЦНС [7, 9, 13, 14]. Субстратом для эндогенного образования СО является молекула гема, расщепление которой в мозгу катализируется главным образом гемоксигеназой-2 (ГО-2) [8, 10, 12]. В головном мозгу крыс определяется высокая концентрация этого фермента, но наибольший уровень экспрессии ГО-2 обнаружен в нейронах мозжечка, гиппокампа и обонятельной луковицы [15, 17]. Вместе с тем, иммуногистохимические исследования ГО-2-позитивных нейронов единичны и ограничиваются демонстрацией таких клеток в мозжечке и гиппокампе [13]. Цель настоящей работы — изучение локализации нейронов, экспрессирующих ГО-2, в ядрах различных отделов ствола головного мозга крысы. Материал и методы . Работа выполнена на 16 крысах-самцах линии Вистар массой 240–280 г, содержавшихся в условиях лабораторного вивария на стандартном рационе. Экспериментальные манипуляции производили в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крыс выводили из эксперимента внутривенным введением раствора нембутала (5 мг на 100 г массы). Из полости черепа извлекали головной мозг, отделяли от него продолговатый мозг, мост и средний мозг, которые фиксировали в течение 1 чв 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 °С. Из образцов мозга готовили криостатные срезы толщиной 30 мкм, которые обрабатывали для иммуноцитохимического выявления ГО-2. Для этого их последовательно инкубировали в 1% нормальной сыворотке лошади в течение 1 ч при комнатной температуре, затем с моноклональными антителами мыши против ГО-2 (Abcam, Bеликобритания) в разведении 1:1000 при температуре 4 °С в течение 18 ч, с биотинилированными антителами лошади против IgG мыши (Veсtor Labs, США) в разведении 1:100 в течение 2 ч и с авидинпероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, Veсtor Labs, США) 1 ч при комнатной температуре. Между инкубациями препараты отмывали фосфатным буфером. Для выявления продуктов реакции под контролем микроскопа срезы инкубировали в субстрате для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, VeсtorLabs, США). Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в полистирол. Для оценки специфичности реакции проводили окрашивание срезов без первичных или вторичных антител. В серии из последовательных срезов один обрабатывали 0,5% раствором метиленового синего, другой — использовали для иммуноцитохимического выявления в нём ГО-2. Для оценки специфичности реакции проводили окрашивание срезов без первичных или вторичных антител. В продолговатом мозгу изучали ядро солитарного тракта (ЯСТ), ретикулярные гигантоклеточное (РГЯ), парагигантоклеточное (РПГЯ), мелкоклеточное (РМЯ) и латеральное (РЛЯ) ядра, дорсальное ядро блуждающего нерва (ДЯБН), в мосту — оральное (РОМЯ) и каудальное (РКМЯ) мостовые ядра, в среднем мозгу — клиновидное (КЯ) и подклиновидное (ПКЯ) ядра. При изучении топографии ядер каждый из двух срезов исследовали раздельно в двух микроскопах, в окуляры которых помещали одинаковые сетки с равновеликими квадратами. Каждое ядро ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях, после чего его контуры воспроизводили на экране монитора в соответствии с положением ядер относительно координат сетки. Для уточнения положения ядер использовали атлас мозга крысы [16]. На срезах каждого ядра определяли общее число нейронов, выявленных при окраске метиленовым синим и вычисляли долю, приходящуюся на ГО-2-позитивные нейроны. Среди последних определяли: размеры, среднее значение оптической плотности продукта реакции (ОППР) — по сумме яркости пикселей образующегося преципитата при сканировании профиля каждого нейрона [3]. По этому признаку выделяли иммунопозитивные нейроны с характерным для каждого из них уровнем ОППР: низкой (30–50 усл. ед.), умеренной (51– 70 усл. ед.) и высокой (свыше 71 усл. ед.). Количественную обработку материала проводили с использованием компьютерных программ автоматизированной системы анализа изображений Allegro MC только в тех ядрах, в которых постоянно и в достаточном количестве для статистической обработки определялись ГО-2-позитивные нейроны. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных при обработке не менее 12 срезов каждого отдела мозга. Различия оценивали по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. При иммуноцитохимической реакции во всех исследованных отделах головного мозга выявляются ГО-2позитивные нейроны, различающиеся формой, размерами, плотностью расположения (рис. 1, а–е). Большая часть энзимпозитивных нейронов имеют овальную или веретеновидную форму и размеры от 9 до 30 мкм. Значительно реже встречаются более крупные клетки звездчатой или треугольной формы. Мелкогранулярный осадок, выпадающий в местах локализации фермента, в зависимости от интенсивности реакции окрашивает нейроны в различные оттенки коричневого цвета. В нейронах с более интенсивной иммуноцитохимической реакцией гомогенный осадок темно-коричневого цвета равномерно заполняет большую часть цитоплазмы, оставляя свободной лишь зону ядра. В нейронах с низким и умеренным содержанием продукта реакции в цитоплазме осадок концентрируется в основном на периферии их тел. В таких случаях он — светло-коричневого или коричневого цвета и образует отдельно расположенные небольшие скопления в виде гранул. Доля ГО-2-позитивных нейронов, а также количественное соотношение клеток с высоким, умеренным или низким содержанием продукта реакции в исследованных ядрах значительно различаются, что приводит к соответствующим изменениям в них величины ОППР (рис. 2). В продолговатом мозгу и мосту самую многочисленную группу ГО-2-позитивные нейроны образуют в ЯСТ и РЛЯ (16,4 и 14,3% соответственно). В них же определяются наибольшее содержание клеток с умеренной и высокой интенсивностью реакции и значения ОППР (см. рис. 2). Энзимпозитивные нейроны чаще встречаются на периферии каудальной части ядер, где обычно имеют небольшие размеры (9–14 мкм), овальную или веретеновидную форму и дают интенсивную иммуноцитохимическую реакцию (см. рис. 1, а). В ростральной части этих ядер, наряду с мелкими округлыми или веретеновидными иммунопозитивными клетками, встречаются компактные группы нейронов треугольной или звездчатой формы диаметром 30–40 мкм с низким и умеренным содержанием продукта реакции (см. рис. 1, б). Почти вдвое ниже доля ГО-2-позитивных нейронов и величина ОППР в ДЯБН и РМЯ, в которых преобладают клетки с умеренным содержанием продукта реакции (см. рис. 2). Большая часть иммунопозитивных нейронов в этих ядрах имеют округлую или веретеновидную форму (см. рис. 1, в) и небольшие (9–12 мкм) размеры. В РКМЯ выявляются полигональные нейроны, преимущественно в дорсомедиальной части диаметром около 30–40 мкм с низким и умеренным содержанием продукта реакции. Среди них встречаются единичные клетки, в которых осадок образует плотные скопления. В РОМЯ энзимпозитивные нейроны концентрируются в основном в вентральной части ядра, где располагаются мелкие и средние по величине клетки веретеновидной, иногда треугольной формы, большая часть которых отличается интенсивной реакцией (см. рис. 1, г). В РГЯ и РПГЯ выявляются минимальное количество иммунопозитивных клеток (1,5–3,8%) и наименьшие значения ОППР (см. рис. 2). В большинстве нейронов этих ядер интенсивность реакции очень низкая. В крупных (50–60 мкм) мультиполярных нейронах светло-коричневые гранулы образующегося осадка заполняют большую часть цитоплазмы, включая отростки (см. рис. 1, д). Зато в мелких клетках, которые обычно располагаются на периферии этих ядер, определяется более интенсивное отложение продукта реакции. В среднем мозгу максимальное количество ГО-2-позитивных нейронов выявляется в ростральной и центральной частях КЯ, где их доля достигает 12–16% (в среднем в ядре — 9,2%). В этих участках преобладают мелкие округлые клетки коричневого и темно-коричневого цвета. В каудальной части ядра чаще выявляются мультиполярные нейроны с низким или умеренным содержанием преципитата. В ПКЯ наиболее плотно иммунопозитивные нейроны располагаются в дорсомедиальном отделе центральной части ядра, где определяются клетки средней величины (20– 30 мкм) с низкой и умеренной интенсивностью реакции. Среди них встречаются нейроны веретеновидной формы, в которых осадок откладывается более плотно (см. рис. 1, е). Однако в целом в ПКЯ доля ГО-2-позитивных нейронов и ОППР почти вполовину ниже, чем в КЯ (см. рис. 2). Обсуждение полученных данных . Несмотря на большое значение СО в жизнедеятельности организма, его функциональные свойства и механизмы действия до сих пор вызывают противоречивые оценки [7, 9, 13]. Имеются данные, что в ЦНС СО играет важную роль в обеспечении эффекта долговременной потенциации и ноцицептивной сигнализации [11, 14, 19]. Однако биохимические методы, с помощью которых был получен основной объем информации о СО, не позволяют судить о наличии и количестве энзимпозитивных нейронов в соответствующих отделах мозга, локализации и функциональной принадлежности ядер, клетки которых участвуют в синтезе СО, и других характеристиках, необходимых для формирования более полного представления о свойствах этой сигнальной молекулы. Проведенное исследование показало наличие морфологического субстрата для участия СО в центральной регуляции гемодинамики. ГО-2позитивные нейроны выявлены нами во многих ядрах сосудодвигательного центра головного мозга, где их количество варьирует от 1,5 до 16 %. В отличие от нейронов, связанных с функциями других газотрансмиттеров [2, 5, 6], концентрация ГО-2-позитивных нейронов в чувствительных ядрах в 3–5 раз больше, чем в двигательных. В ЯСТ, РЛЯ и КЯ, которые относятся к латеральному, сенсорному полю ретикулярной формации [1], находится самая многочисленная популяция ГО-2-позитивных нейронов. В них же обнаружены и наиболее высокие значения ОППР, что свидетельствует о большой значимости СО в обеспечении функций этих ядер. Есть сведения, что унилатеральная микроинъекция гемина в область ядра солитарного тракта приводит к освобождению СО и сопровождается значительным снижением кровяного давления и частоты сердечных сокращений, но при предварительном введении Zn-протопорфирина IX — ингибитора ГО-2 — такой эффект не наблюдается [12]. Исследование клеточных механизмов регуляции активности ГО-2 показало, что синтез СО увеличивается в ответ на повышение цитозольной концентрации кальция, активацию протеинкиназы С и тирозинкиназ [7]. В ЦНС в этом процессе задействованы метаботропные глутаматные рецепторы I типа [8]. Метаботропные рецепторы, активированные в ЯСТ, способны регулировать проведение нервного сигнала через специфические цГМФ-зависимые механизмы к ГО-2-позитивным нейронам тех ядер, которые, в свою очередь, обеспечивают эфферентные влияния на сердце и кровеносные сосуды. Как показали наши наблюдения, такие нейроны постоянно присутствуют в составе ДЯБН, а также в РГЯ, РПГЯ, ПКЯ и РКМЯ, которые относятся к медиальному моторному полю ретикулярной формации [1]. Мишенью для воздействий могут быть не только крупные иммунопозитивные нейроны, которые постоянно присутствуют во всех этих ядрах, но и небольшие нейроны, отличающиеся интенсивной ферментативной реакцией. Они, как указано выше, чаще располагаются на периферии ядер или между крупными нейронами. В этом случае СО может выступать в качестве модулятора, усиливающего спонтанную или вызванную секрецию ацетилхолина, норадреналина, серотонина и некоторых других медиаторов и гормонов [13, 18]. Далее сигнальная трансдукция осуществляется посредством нисходящих проводящих путей, приводя к активации преганглионарных симпатических нейронов промежуточно-латерального ядра спинного мозга и изменению кровяного давления. Ранее нами было отмечено снижение доли ГО-2позитивных нейронов и содержания в них ГО в ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра при артериальной гипертензии, что лишний раз подтверждает участие СО в центральных механизмах регуляции гемодинамики [4].

作者简介

A. Kotsiuba

Email: akotc@mail.ru
Vladivostok State Medical University

V. Chertok

Vladivostok State Medical University

参考

补充文件