CHANGES IN THE EXPRESSION OF GAT1 (GABA TRANSPORTER) IN VENTROLATERAL PART OF THE SOLITARY NUCLEUS IN PRENATAL SEROTONIN DEFICIENCY IN RAT

Full Text

Введение. Латеральная и вентральная группы нейронов (субъядра) располагаются в каудальной части ядра одиночного пути (ЯОП), входят в состав дорсальной респираторной группы нейронов и включаются в состав бульбарного дыхательного центра [3]. Регуляция функций субъядер ЯОП осуществляется многими нейромедиаторами: ГАМК, серотонином, глицином, глутаматом и т. д., нейропептидами и соответствующим рецепторным звеном. Основным тормозным нейротрансмиттером в ЦНС млекопитающих является ГАМК. У взрослых животных ГАМКергические нейроны диффузно рассеяны и обнаруживаются на всей площади каудальной части ЯОП. Одним из основных транспортеров ГАМК считается GAT1, который относится к Na+-зависимым нейротрансмиттерным белкам обратного захвата, локализованный на плазматической мембране нейронов и клеток нейроглии [1, 2]. Известно, что как ГАМК, так и серотонин (5-HT) через проекции нейронов каудальных серотонинергических ядер шва, а также рецепторного звена (5-HTRA и 5-HTRB рецепторов), регулируют общий нейротрансмиттерный гомеостаз в этой области [11, 14]. Изменение баланса уровней содержания этих биологически активных веществ в ядрах дыхательного центра может вызывать респираторную дисфункцию [12]. О влиянии серотонина на становление элементов тормозной ГАМК-ергической сети и механизмах контроля трансмиссии ГАМК в дыхательных нейронах в период раннего постнатального развития в настоящее время известно крайне мало. В связи с этим задачей работы было провести исследование экспрессии транспортера GAT1 в вентролатеральной части ядра солитарного тракта на ранних постнатальных сроках в норме и при пренатальном дефиците серотонина. Материал и методы. Работа проведена на лабораторных крысах линии Wistar (n=21) из питомника Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. Содержание животных и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Директивы (2010/63/ÅU) Европейского Союза по защите животных, используемых в научных целях (Directive 2010/63/ÅU of the European Parliament and of the Council on the protection of animals used for scientific purposes). Протоколы экспериментов (№ 04/02 от 04.02.2019 г.) были утверждены комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных при Институте физиологии им. И. П. Павлова РАН. Для снижения уровня эндогенного серотонина в эмбриональный период использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы пара-хлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА в дозе 400 мг/кг самкам крыс вводили внутрибрюшинно на 9-е сутки беременности. Головной мозг родившихся крысят извлекали, фиксировали в цинк-этанолформальдегиде на фосфатно-солевом буфере (рH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 6-7 мкм на уровне брегмы - 12,24-12,36 мм [13]. Изучали латеральное и вентральное субъядра ЯОП. Исследование проводили на 5- (n=4), 10-е (n=4) и 20-е сутки (n=4) постнатального развития (П5, П10 иП20). Контролем служили крысята соответствующих сроков развития, полученные от интактных самок (n=3 на каждый срок исследования). Иммуногистохимическую реакцию на выявление GAТ1 проводили с использованием первичных кроличьих поликлональных антител (anti-GABA transporter 1; GAТ1) (AbCam, Великобритания). В качестве вторичных реагентов для GAТ1 использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта реакции применяли хромоген DAB+ (Dako, Дания). Срезы заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Для оценки оптической плотности продукта реакции в нейропиле опцией системы анализа изображений выделяли участки сети иммунопозитивных отростков и терминалей, а также скоплений мелких зерен и крупных гранул, которые считаются терминальными синаптическими структурами и их скоплениями [10]. Уровень GAТ1 выражали в относительных единицах оптической плотности. Количественную оценку иммунореактивности осуществляли при помощи системы анализа изображения, включающей световой микроскоп Olympus CX31 (Япония), цветную цифровую камеру VideoZavr Standard VZ-C31Sr и программное обеспечение Видеозавр Мультиметр 2,3 (разработка ООО «АТМпрактика», Санкт-Петербург). Оценивали среднее значение оптической плотности продукта реакции в относительных единицах при увеличении 1000. Измерения проводили на 10 серийных срезах мозга, взятого от 3-4 животных каждой исследуемой группы. Математическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Все величины представлены как средняя арифметическая величина ± ошибка средней. Значимость различий средних величин определяли с использованием t-критерия Стъюдента и метода oneway ANOVA. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты исследования. Распределение GAT1 в латеральном субъядре ЯОП у контрольных животных. У контрольных крысят в синаптических структурах показатель уровня GAТ1 в ходе развития постепенно увеличивается: от П5 до П10 - в 1,1 раза, от П10 до П20 - в 1,7 раза. В нейропиле в сети иммунопозитивных отростков и терминалей имеет место увеличение уровня GAТ1 от П5 до П10 в 1,6 раза, а от П10 до П20 - в 1,7 раза (табл. 1). Распределение GAT1 в латеральном субъядре ЯОП у животных с пренатальной недостаточностью серотонина. У экспериментальных животных в синаптических структурах имеет место колебание показателя уровня GAТ1. Так, от П5 до П10 он увеличивается в 1,5 раза, а от П10 до П20 - снижается в 1,2 раза (см. табл. 1). В нейропиле в сети иммунопозитивных отростков и терминалей отмечено повышение уровня GAТ1 от П5 до П10 в 1,3 раза, а от П10 до П20 - значимое снижение в 2,6 раза (см. табл. 1). Распределение GAT1 в вентральном субъядре ЯОП у контрольных животных. У контрольных крысят в синаптических структурах показатель уровня GAТ1 в ходе развития также постепенно увеличивается: от П5 до П10 - в 1,5 раза, от П10 до П20 - в 3 раза (табл. 2). В нейропиле в сети иммунопозитивных отростков и терминалей имеет место увеличение уровня GAТ1 от П5 до П10 в 8 раз, а от П10 до П20 - в 6,4 раза (см. табл. 2). Распределение GAT1 в вентральном субъядре ЯОП у животных с пренатальной недостаточностью серотонина. У подопытных животных на разных сроках постнатального развития в синаптических структурах отмечено колебание уровня GAТ1. Так, от П5 до П10 его значения увеличиваются в 2,6 раза, а от П10 до П20 - снижаются в 1,6 раза (см. табл. 2). В нейропиле в отростках, так же как и в синапсах, ко 2-й неделе постнатального развития показатель уровня GAТ1 увеличивается в 2,8 раза, а к концу 3-й недели - вновь снижается в 2,8 раза, т. е. на П5 иП20 значения уровня GAТ1 не различаются (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. Известно, что у млекопитающих ГАМК, как тормозной нейротрансмиттер, играет важную роль в регуляции возбудимости нейронов. При синаптической тормозной нейропередаче обратный захват нейротрансмиттера из синаптической щели или межклеточного пространства осуществляется транспортерами, при этом эффективность нейропередачи определяется скоростью обратного захвата медиатора. Изменения этих процессов могут приводить к функциональным нарушениям ЦНС [2]. Для ГАМК известны четыре класса транспортных белков: GAT1, GAT2, GAT3 и GAT4 (или BGT-1, betaine), из которых GAT1 считается одним из основных транспортеров при синаптической нейропередаче [9]. Результаты данной работы показали, что у контрольных животных в латеральном и вентральном субъядрах ЯОП в нейропиле в отростках, терминалях и синаптических структурах уровень экспрессии GAT1 от ранних неонатальных сроков и до начала ювенильного возраста постепенно повышается. При этом в латеральном субъядре уровень экспрессии GAT1 существенно выше, чем в вентральном. Выявлено, что у животных, развивавшихся в условиях пренатального дефицита серотонина, в обоих субъядрах ЯОП на всех исследованных сроках имеет место изменение экспрессии GAT1. Полученные данные показали, что как в синапсах, так и в отростках, и в терминалях, уровень экспрессии GAT1 значительно увеличивается в первые 2 нед, а к началу ювенильного возраста снижается. На 1-й неделе постнатального развития уровень экспрессии GAT1 в вентральном субъядре в синапсах, сети отростков и терминалей превышает таковой в контроле в 2,0 и 15,5 раза; на 2-й неделе - в 3,5 и 5,5 раза, а к концу 3-й недели - ниже в 1,3 и 3,2 раза соответственно. В латеральном субъядре на 1-йи 2-й постнатальной неделе в синапсах, сети отростков и терминалей уровень экспрессии GAT1 практически не отличается от такового в контроле, а к концу 3-й недели - существенно ниже в 1,7 и 4,0 раза соответственно. Известно, что ГАМК может находиться не только в синапсе, но и во внеклеточном пространстве. Источником внеклеточной ГАМК может быть её диффузия из синаптической щели, т. е. спилловер (spillover - разливаться) нейротрансмиттера [6, 7]. Вероятно, спилловер можно рассматривать как процесс, стимулирующий активный обратный захват нейротрансмиттера из внеклеточного пространства [8] и, следовательно, требующий увеличения синтеза транспортного белка. Подтверждением этого предположения могут служить данные, полученные при изучении синтеза поверхностных белков, показавшие, что увеличение экспрессии транспортера GAT1 коррелирует с увеличением транспорта ГАМК [2, 4]. Выявленное в данном исследовании повышение уровня экспрессии GAT1 в субъядрах ЯОП у подопытных животных, вероятно, является следствием спилловера ГАМК, который, в свою очередь, может иметь место при изменении структуры синапсов, задержке процесса интернализации GAT1, нарушении экспрессии постсинаптических рецепторов. Изменения в экспрессии транспортеров ГАМК были отмечены в результате нарушения метаболических процессов (фосфорилирования) [5, 7], осмотического стресса при высокой нейронной активности, при воздействии на мозг гипоксии-ишемии, травме [5, 12]. Более того, изменения экспрессии разных транспортеров ГАМК выявлены при болезни Альцгеймера. Увеличение уровня экспрессии GAT4 обнаружено в зубчатой фасции, в полях С2 иС3 гиппокампа и уменьшение его - в энторинальной коре [8]. Снижение уровня экспрессии GAT1 к началу ювенильного периода, отмеченное в данном исследовании, может быть следствием уменьшения экспрессии самой ГАМК у подопытных животных, не исключено, что имеют место ограничение синтеза рецепторных белков и нарушение синаптогенеза. Приведенные факты показывают, что имеют место специфические изменения экспрессии транспортеров ГАМК в разных формациях мозга при воздействии неблагоприятных факторов и при течении нейродегенеративных заболеваний, хотя механизмы этих изменений неизвестны. Заключение. Следует отметить, что у крыс в латеральном и вентральном субъядрах ЯОП, начиная с раннего неонатального периода и до начала ювенильного возраста, происходит постепенное увеличение уровня экспрессии GAT1 - транспортера ГАМК. Пренатальный дефицит серотонина приводит к нарушению экспрессии транспортера GAT1 в постнатальный период. Это может вызывать изменение трансмиссии ГАМК, что, в свою очередь, приведёт к дисбалансу тормозных и возбуждающих эффектов в дыхательных субъядрах на ранних сроках постнатального развития и послужит основой для развития респираторных нарушений. Полученные результаты способствуют пониманию механизмов регуляции экспрессии GAT1, его высвобождения и интернализации при формировании респираторных дисфункций. Более того, процесс экспрессии GAT1 может быть мишенью для фармакологической коррекции тормозных эффектов.

About the authors

L. I. Khozhai

I. P. Pavlov Institute of Physiology; St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: astarta0505@mail.ru
Laboratory of Ontogenesis of the Nervous System; Department of Histology and Embryology n.a. prof. A. G. Knorre 6 Makarova Emb., St. Petersburg 199034

References

Supplementary files