PANCREATIC ISLETS OF REGENERATING PANCREAS AFTER CHRONIC ADMINISTRATION OF THYROXINE

Full Text

Введение. Нет оснований сомневаться в том, что панкреатические островки (ПО) - центральная мишень в патогенезе сахарного диабета. Однако, несмотря на колоссальное количество работ, посвященных различным аспектам строения, происхождения, развития и функционирования островковых клеток, многое остается недостаточно изученным, о чем свидетельствует повсеместный рост заболеваемости сахарным диабетом [15]. Среди гормонов, влияющих на строение и реактивность панкреатического эпителия, пальма первенства принадлежит гормонам щитовидной железы, нормальные уровни которых необходимы для репликации, последующей пролиферации и нарастания массы В-клеток в постнатальном онтогенезе [11], а в условиях возрастания потребности в инсулине - для репрограммирования ацинарных панкреацитов в инсулинпродуцирующие клетки [12]. Еще один аспект действия гормонов щитовидной железы - способность предотвращать апоптоз островковых В-клеток [10]. Известно, что аутоиммунные заболевания щитовидной железы, приводящие к нарушению гормональной регуляции, часто сочетаются с сахарным диабетом 1-го типа в рамках широко распространенных полиорганных аутоиммунных синдромов: 2-го типа, или синдрома Шмидта (APS-2), а также 3-го и 4-го типов (APS-3 и APS-4), что придает особую актуальность изучению влияния гормонов щитовидной железы на строение и реактивность ПО [8]. Одной из наиболее фундаментальных моделей изучения реактивности на уровне тканей и органов является модель репаративной регенерации, позволившая еще в 70-е годы ХХ в. предсказать роль клеток эпителия протоков в репарации и экзо-, и эндокринного эпителия поджелудочной железы (ПЖ) [1]. Однако особенности реактивности панкреатического эпителия (и эндокринного в частности) при репаративной регенерации на фоне действия гормонов щитовидной железы изучены недостаточно. Цель работы - охарактеризовать некоторые параметры эндокринного эпителия в отдаленной от места резекции части ПЖ в условиях хронического введения тироксина. Материал и методы. Материалом для исследования служили 163 крысы-самцы Вистар. Из них 56 крыс cо средней начальной массой 165,0±3,5 г составили экспериментальную группу. ПЖ у крысы не является компактным органом, но диффузно распределена по брыжейке кишки, упираясь головкой в петлю двенадцатиперстной кишки, боковыми частями тела контактируя с кишкой, и сужающимся хвостом (иногда именуется селезеночным отделом) обычно касается facies visceralis селезенки. Животным экспериментальной группы одновременно с продольной резекцией селезеночного отдела ПЖ (для краткости - «частичной панкреатэктомией») [6] ежедневно подкожно вводили dl-тироксин (Реанал, Венгрия) в дозе 0,001 мг/г массы тела. Головка и тело ПЖ составляли «отдаленную от места резекции часть ПЖ». Остальные 107 крыс составили контрольные группы: контрольная группа «частичная панкреатэктомия» (64 крысы), этим крысам, как и животным экспериментальной группы, проводили продольную резекцию селезеночного отдела ПЖ [6]; контрольная группа «введение тироксина» (58 крыс), которым ежедневно подкожно вводили dl-тироксин (Реанал, Венгрия) в дозе 1 мкг/г массы тела; контрольная группа «0» (интактные животные+ложнооперированные животные, 49 крыс). В различные сроки после начала опыта (3, 5, 7, 15, 30 сут) животных выводили из эксперимента декапитацией в 11 ч утра после 24-часового голодания. Все процедуры по уходу и использованию животных выполняли в соответствии с требованиями European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC) и «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». На проведение исследования получено разрешение локального этического комитета (№ 8-2/ру от 19.01.2015 г.). Авторадиография. За 1 ч до декапитации животным внутрибрюшинно вводили 3Н-тимидин (Изотоп, Россия, удельная активность 9,8 мкКи/мл) в дозе 0,5 мкКи/г массы тела. За меченое считали ядро, над которым обнаруживались не менее 5 зерен восстановленного серебра. Одновременно с подсчетом количества ядер, меченных 3Н-тимидином (ИМЯ), учитывали количество митозов (МИ) и количество дегенерированных ядер (гиперхроматоз, пикноз, кариорексис). При подсчете ИМЯ и МИ для получения значимого значения показателя считали необходимым в каждом отдельном случае зафиксировать не менее 13 изучаемых объектов (метка, митоз). При этом количество подсчитанных клеток определяли индексом мечения или митотическим индексом соответственно; так, к примеру, если МИ 1 %, то теоретически достаточно просчитать 1300 клеток, а если МИ 0,1 %, то следует просчитать 13 000 клеток. Морфометрия. А. Масса тела животных. Всех животных взвешивали после 24-часового голодания до начала опыта и в момент декапитации. Сравнивали средние значения массы тела до и через 30 сут опыта. Количество животных: в подопытной серии - 16, в серии «0» - 31, в серии «частичная панкреатэктомия» - 24, в серии «введение тироксина» - 10. Б. Изучение массы головки и тела железы. Головку и тело железы помещали в жидкость Буэна на 24 ч, после чего кусочки тщательно обсушивали и взвешивали на торсионных весах (Россия). Сравнивали средние значения массы головки и тела ПЖ через 30 сут в контрольных и подопытной группах. Количество животных : в подопытной серии - 16, в серии «0» - 31, в серии «частичная панкреатэктомия» - 24, в серии «введение тироксина» - 10. В. Изучение общего островкового объема. Изучение общего объема ткани островков проводили на материале, фиксированном в жидкости Буэна. В каждом десятом из 200 серийных срезов толщиной 4 мкм, окрашенных паральдегидфуксином и трехцветной смесью Гомори, подсчитывали число ПО VI и >VI классов (средние и крупные островки). Детали реализации метода приведены ранее [6]. Число животных в подопытной и контрольных группах : в подопытной серии - 5, в серии «0» - 5, в серии «частичная панкреатэктомия» - 6, в серии «введение тироксина» - 5. Г. Изучение В/А-клеточного объемного отношения. Использовали срезы, на которых проводили анализ общего объема ткани островков. Для получения значений относительных объемов островковых составляющих применяли «выборку по точкам». Детали техники определения приведены ранее [6]. Оценивали три группы островков: мелкие - II-IV классы, средние - V-XI классы, крупные - XII-XIV классы. Количество животных: в подопытной серии - 5, в серии «0» - 5, в серии «частичная панкреатэктомия» - 4, в серии «введение тироксина» - 5. Д. Определение площади ядер и клеток. Наибольший и перпендикулярный ему диаметры ядер клеток ПО определяли винтовым окулярным микрометром МОВ-15Х (ЛОМО, Россия) на срезах, предназначенных для изучения количества РНК. Детали техники определения приведены ранее [7]. Количество животных: в подопытной серии - 9, в серии «0» - 10, в серии «частичная панкреатэктомия» - 9, в серии «введение тироксина» - 9. Е. Количество цитоплазматической РНК определяли на цитофотометре МУФ-5 (ЛОМО, Россия), сканируя срезы, окрашенные галлоцианин-хромовыми квасцами. Детали метода приведены ранее [7]. Количество животных: в подопытной серии - 3, в серии «0» - 3, в серии «частичная панкреатэктомия» - 3, в серии «введение тироксина» - 3. Ж. Электронно-микроскопическое (ЭМ) исследование. Кусочки ПЖ брали под тиопенталовым наркозом, фиксировали в 2 % глутаральдегиде, постфиксировали по Колфилду, обезвоживали и заливали в смесь эпон-аралдита или эпон-812 [6]. После предварительного просмотра полутонких срезов производили прицельную заточку блоков. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-7A (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Количество животных при ЭМ-анализе было 6 (по 3 крысы через 15 и 30 сут соответственно). Во всех случаях анализа количественных данных для определения значимости различий средних величин в контроле и опыте использовали t-критерий [4]. Результаты исследования. Через 30 сут опыта масса тела экспериментальных животных значимо не изменилась, тогда как масса тела животных в контрольной группе «0» возросла на 11%, а в контрольной серии «частичная панкреатэктомия» - на 10 %. В контрольной серии «введение тироксина» животные потеряли 10 % своей первоначальной массы. Через 30 сут опыта средняя масса головки и тела ПЖ подопытных крыс была на 58 % больше, чем аналогичное значение у крыс серии «0», и на 75 % больше, чем у крыс серии «частичная панкреатэктомия». Объем ткани островков в ПЖ подопытных крыс через 30 сут опыта возрос на 85 % при сравнении со значениями, полученными в серии «0», и на 66 % при сравнении со значениями, полученными в серии «введение тироксина». Средние абсолютные значения площади ПО малых размерных классов через 30 сут опыта были значимо снижены при сравнении со значениями в сериях «0» и «частичная панкреатэктомия», но увеличены при сравнении со значениями, полученными в серии «введение тироксина» (табл. 1). В ПО средних размерных классов эти параметры были снижены при сравнении с группами «0» и «частичная панкреатэктомия» (см. табл. 1). Через 30 сут опыта доля капилляров и соединительной ткани в мелких ПО была на 56 % больше при сравнении со значениями серии «0», а в средних ПО - на 102 % больше при сравнении с серией «0» и на 45 % - больше при сравнении с серией «введение тироксина» (см. табл. 1). В/А-клеточное объемное отношение в мелких ПО возросло до 6,81±0,32, а в средних ПО, составляющих основную массу общего островкового объема, - до 7,41±0,29 (см. табл. 1). Через 30 сут опыта в средних ПО средняя площадь ядра и средняя площадь клетки были значимо снижены для А-клеток при сравнении со всеми контрольными группами, а для В-клеток - при сравнении с контрольной серией «0» (табл. 2). Результаты оценки количества цитоплазматической РНК в клетках ПО представлены в табл. 3. Через 30 сут опыта содержание цитоплазматической РНК возросло в А-иВ-клетках на 75,3 и 23 % соответственно, тогда как через 3 сут опыта содержание цитоплазматической РНК вА-клетках было снижено на 13,6 %. Результаты ауторадиографического исследования включения 3Н-тимидина в ядра клеток ПО представлены в табл. 4. Через 3 сут опыта ИМЯ в эпителии мелких ПО заметно ниже, чем в серии «частичная панкреатэктомия» (-66 %). При этом, МИ был 1,67±0,15 %. Заметно ниже, чем в контроле (-60 %), был ИМЯ в эпителии средних ПО. Через 5 сут опыта ИМЯ в мелких ПО был ниже, чем в серии «частичная панкреатэктомия». Через 15 сут опыта ИМЯ и в мелких, и в средних ПО был меньше, чем в контроле, на 58 и 70 % соответственно. Параллельно снижалась и митотическая активности до единичных митозов. Через 15 сут опыта островковые В-клетки представлены преимущественно «темными В-клетками II» c тем отличием, что они обнаруживают многочисленные признаки выделения секреторного материала и в перикапиллярные (ПКП), и в межклеточные пространства чаще в виде целых гранул (микроапокриния). Другая особенность - цистерны пластинчатого комплекса (ПК), занимающие значительные области цитоплазмы, заметно расширены и содержат единичные созревающие гранулы, имеющую структуру сердцевины в виде «тутовой ягоды». Еще одна особенность - лентовидные митохондрии (М), имеющие сильно уплотненный матрикс («плотно сопряженные» по классификации Е. В. Козыревой и М. В. Митюшина [3]). Светлые В-клетки представлены немногочисленными «светлыми В-клетками II». Особенность их ультраструктуры - многочисленные картины выделения секреторного материала в ПКП и межклеточные пространства. Плазматические мембраны формируют многочисленные выросты, образующие с соседними клетками контакты типа взаимопроникновений. Многочисленные цитоплазматические выросты образованы и апикальными участками цитоплазмы, прилежащими к капиллярам. Между этими выростами видны цельные секреторные гранулы (СГ), располагающиеся за пределами плазматической мембраны в ПКП и межклеточных пространствах. Четко выявляется феномен расположения СГ вдоль плазматических мембран. Многие СГ имеют сердцевину в виде «тутовой ягоды». Практически все М являются «плотно сопряженными». Общую картину дополняет большое количество плотных телец и кринофагических вакуолей и в темных, и в светлых клетках. А-клетки представлены «темными» клетками, чья цитоплазма содержит немногочисленные типичные А-гранулы, располагающиеся преимущественно на периферии цитоплазмы, вблизи соседних эндо-и экзокриноцитов. Ми ПК обычного вида располагаются в окружении мембран гранулярной цитоплазматической сети (ГЦС) и свободных рибосом. Отдельные плотные тельца дополняют картину. Через 30 сут опыта в ПО преобладают светлые клетки, среди В-клеток - «светлые В-клетки I», имеющие слегка расширенные перинуклеарные пространства и заметно расширенные пространства мембран ГЦС. СГ не многочисленны, часть их группируются вдоль плазматических мембран. Видны картины выделения СГ в ПКП и межклеточные пространства. Достаточно большие участки цитоплазмы заняты элементами ПК, представленного цистернами, вакуолями и пузырьками. Цистерны содержат формирующиеся СГ. М обычного вида группируются вблизи цистерн ПК и среди расширенных цистерн ГЦС. Плотные тельца и кринофагические вакуоли довольно многочисленны. Апикальная цитоплазма образует многочисленные выросты. Базальные мембраны клеток и капилляров разрыхлены. Реже встречаются темные В-клетки. Они представлены «темными В-клетками I», имеющими округлые ядра с заметно выделяющимся ядрышком. Перинуклеарные пространства не расширены. Немногочисленные СГ группируются вдоль плазматических мембран и в околокапиллярной цитоплазме. Цитоплазма заполнена мембранами ГЦС, полисомами, рибосомами. М обычного вида группируются вблизи мембран ГЦС и выраженного ПК. Секретируются и типичные В-гранулы, и гранулы с сердцевиной в виде «тутовой ягоды». В местах выделения секреторного материала базальные мембраны клетки и капилляра заметно разрыхлены. Количество кринофагических вакуолей и плотных телец увеличено. А-клетки представлены «светлыми» клетками с малым количеством СГ, с расширенными пустыми цистернами ПК, занимающего значительные участки цитоплазмы, с небольшим количеством М обычного вида, немногочисленными мембранами ГЦС и свободными рибосомами. На периферии островков, в районах гетероклеточных зон, встречается большое количество «смешанных» («промежуточных») клеток, часто образующих симпласт. В их цитоплазме располагаются и гранулы зимогена, и эндокринные гранулы различных типов. Обсуждение полученных данных. У животных подопытной серии, несмотря на то, что они получали ту же дозу тироксина, что и животные серии «введение тироксина», отсутствовали внешние проявления типичного состояния, обусловленного избытком гормонов щитовидной железы (беспокойство, гиперкинез, возбуждение, падение массы тела, гиперфагия, частый стул), которые развивались у контрольных животных серии «введение тироксина» и что - в их случае - свидетельствовало о моделировании выраженного избытка гормонов щитовидной железы. Именно отсутствие проявления эффектов избытка гормонов щитовидной железы у экспериментальных животных обусловило, скорее всего, тот факт, что в отличие от животных серии «введение тироксина», которые потеряли 10 % своей массы, подопытные животные имели через 30 сут тенденцию к возрастанию массы тела. Полученные данные заметного увеличения массы головки и тела ПЖ у подопытных крыс согласуются с классическими данными P. Herring об увеличении массы ПЖ при избытке гормонов щитовидной железы [13] и с данными, полученными нами ранее в ходе анализа особенностей репаративной регенерации панкреатического эпителия [6]. Следует особенно подчеркнуть, что условия тироксинизации резко повышают способность эпителия ПЖ к регенерации: масса изученного участка ПЖ железы у животных подопытной группы была на 75 % больше, чем в серии «частичная панкреатэктомия». При этом, возрастание объема ткани островков у подопытных животных было сходно с тем, что имело место в серии «частичная панкреатэктомия». Несмотря на то, что некоторые механизмы, формирующие эффект возрастания ткани островков при действии избытка гормонов щитовидной железы (в частности, В-клеточного компонента за счет антиапоптотического действия [10]) в настоящее время проясняются, полученный результат - несомненное свидетельство мощного влияния гормонов щитовидной железы на экзокринный эпителий ПЖ. Дальнейший анализ морфометрических параметров показал, что средняя площадь ПО (и мелких, и средних) у подопытных животных уменьшена, равно как и средняя площадь, занятая в ПО и А-, иВ-клетками. При этом показатель для А-клеток был изменен более значительно, что и повлекло заметное возрастание В/А-клеточного объемного отношения. Представляется существенным тот факт, что заметно возросла капилляризация ПО, о чем свидетельствует возрастание средних площадей, занятых структурами, иными, чем А-иВ-клетки, и в мелких, и в средних ПО. Включение 3Н-тимидина в ядра клеток ПО и митотическая активность островковых клеток имели фазный характер: на ранних сроках опыта (3, 5, 15 сут) - снижение индекса мечения при сравнении с аналогичными параметрами серии «частичная панкреатэктомия», а через 30 сут опыта цифры индекса мечения возвращались к значениям контрольной серии «0». Такой характер динамики включения изотопа был характерен и для мелких (наиболее молодых островков), и для ПО средних размерных классов, составляющих основную массу общего островкового объема. При этом и в мелких, и в средних ПО на ранних сроках имела место довольно высокая митотическая активность, тогда как в серии «частичная панкреатэктомия» митозы в клетках ПО не встречались, а в серии «0» - были единичны. Фазность действия гормонов щитовидной железы на пролиферативные процессы (конкретно - на митотическую активность) в ПЖ отмечена ранее и расценивается автором как вариант авторегуляции роста тканей [2]. Подобный подход позволяет понять, почему в нашем исследовании одновременно с возвращением ИМЯ к контрольным значениям через 30 сут опыта в цитоплазме и А-, иВ-клеток возрастало содержание цитоплазматической РНК. В это же время площадь ядра и клетки в ПО уменьшены и у А-, иуВ-клеток, что было более выраженным для А-клеток. В литературе отсутствуют данные, характеризующие ультраструктуру инсулоцитов в условиях, соответствующих избранным для данного эксперимента. Обсуждая результаты, следует заметить, что трудности трактовки состояния инсулоцитов на основании их ультраструктурной организации связаны с тем, что инсулоциты находятся на разных этапах секреторного цикла, и особенности их ультраструктурной организации обусловлены фазой секреторного цикла в момент взятия материала для исследования. Однако принадлежность инсулоцитов к эндокриноцитам с оформленным типом секрета позволяет, по нашему мнению, выделить определенные феноменологические шаблоны (что и было сделано нами ранее [5]), облегчающие задачу. Ультраструктурная картина островковых клеток у животных подопытной группы изменялась в ходе эксперимента от преимущественно «темных В-клеток II» через 15 сут опыта до преимущественно «светлых В-клеток I» через 30 сут опыта. На всех сроках наблюдения инсулоциты активно выделяют секрет и эндо-, и паракринно. Следует отметить выраженность микроапокринового способа выделения секреторного материала на всех сроках наблюдения. Принято считать, что микроапокриния - один из способов циклической формы секреторной деятельности В-клеток, характерный для костистых рыб и земноводных [9]. Основываясь на наших наблюдениях, следует предположить, что микроапокриновый способ выделения секреторного материала, с одной стороны, имеет более широкое распространение, чем считалось ранее, а с другой - возрастание доли микроапокринии - отражение факта рекапитуляции к филогенетически более древним вариантам выделения секрета в условиях эксперимента. Особенность выделяемого секрета - многие СГ имеют сердцевину в виде «тутовой ягоды». Традиционно принято, что различного вида сердцевины СГ представляют последовательные стадии созревания секреторного материала. Поскольку до настоящего времени не описано образования СГ с сердцевиной в виде «тутовой ягоды» на каком-либо этапе секреторного цикла, а повышенные уровни проинсулина в условиях избытка гормонов щитовидной железы [14] скорее отразились бы возрастанием доли СГ со светлой сердцевиной, следует предположить, что, скорее всего, имеет место изменение конформации молекулы инсулина, что, вероятно, обусловлено высокими уровнями гормонов щитовидной железы: СГ с такого вида сердцевиной обнаруживаются и в контрольной группе «введение тироксина» [7]. Заключение. Суммируя полученные результаты, следует заключить, что гормоны щитовидной железы способны стать важным фактором репарации панкреатического эпителия. Работа выполнена в рамках гранта Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах Российской Федерации № 14.W03.31.00009 от 13.02.2017 г. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. И. У. Сбор и обработка материала: В. И. У. Статистическая обработка данных: В. И. У. Анализ и интерпретация данных: В. И. У. Написание и редактирование текста: В. И. У., Т. В. Ф., Л. П. Ч. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

V. I. Utekhin

Saint Petersburg State University; St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: utekhin44@mail.ru
The Department of Pathology, Faculty of Medicine, Laboratory of Mosaic of Autoimmunity; The Department of the Pathological Physiology with a course of Immunopathology, Department of Histology and Embryology 7-9 Universitetskaya emb., St. Petersburg 199034

T. V. Fedotkina

Saint Petersburg State University; St. Petersburg State Pediatric Medical University

The Department of Pathology, Faculty of Medicine, Laboratory of Mosaic of Autoimmunity; The Department of the Pathological Physiology with a course of Immunopathology, Department of Histology and Embryology 7-9 Universitetskaya emb., St. Petersburg 199034

L. P. Churilov

Saint Petersburg State University

The Department of Pathology, Faculty of Medicine, Laboratory of Mosaic of Autoimmunity 7-9 Universitetskaya emb., St. Petersburg 199034

References

Supplementary files