SUBPOPULATIONS OF CALBINDIN-, CALRETININ- AND PARVALBUMINIMMUNOREACTIVE INTERNEURONS OF THE DORSAL HORN OF THE SPINAL CORD OF FEMALE C57BL/6 MICE

Full Text

Введение. Ионы кальция являются универсальным внутриклеточным посредником и играют ведущую роль в регуляции разнообразных нейрональных процессов [4, 10, 11]. К внутриклеточным кальций-связывающим белкам, наиболее распространенным в центральной и периферической нервной системе различных видов животных, селективно экспрессирующимся в определенных популяциях нейронов, относятся кальбиндин (КАБ) с массой 28 килодальтон, кальретинин (КАР) и парвальбумин (ПАВ) [2, 3, 6, 7, 9]. Клетки, содержащие КАБ, КАР и ПАВ, присутствуют во всех пластинках дорсального рога спинного мозга (СМ) [2-4, 7], но имеются уровневые различия в экспрессии кальцийсвязывающих белков, в частности в большем количестве интернейронов с КАБ в поясничных сегментах взрослых самцов мышей [2], крыс [3], кошек [7] по сравнению с шейными (СVI-СVII) [3], верхними (ТII) [2] и средними (ТVI-ТVIII) [3] грудными, а также крестцовыми (SI-SIII) сегментами СМ [7]. Гетерогенность серого вещества СМ проявляется не только в рострокаудальном, но и в вентродорсальном направлении. Группы интернейронов, принимающих импульсы различной модальности [2, 4, 5, 8] и в соответствии с известным соматотопическим принципом проекции периферических афферентов к интернейронам дорсального рога СМ, гистотопографически обособляются в пластинки. В современных исследованиях очень трудно выделить участие нейрональных субпопуляций, содержащих КАБ, КАР и ПАВ в каждой отдельной пластинке, что обусловлено объединением морфофункциональных характеристик интернейронов различных пластинок дорсального рога СМ: пластинки I-II [3, 4, 9], пластинки II-VI [7], пластинки III-VI [2, 3]. Таким образом, наряду с широко известными данными о механизмах, обеспечивающих низкую концентрацию ионов кальция в цитоплазме клетки, до настоящего времени отсутствуют сведения об особенностях клеточного состава и морфологической характеристике субпопуляций КАБ-, КАР-и ПАВ-содержащих интернейронов в пластинках дорсального рога СМ. Целью настоящей работы было проведение сравнительного анализа иммуногистохимических и морфометрических характеристик интернейронов дорсального рога грудного отдела СМ мышей, содержащих различные кальцийсвязывающие белки. Материал и методы. Работа выполнена на самках мышей C57BL/6 в возрасте 16 нед (n=4). Изучали локализацию, морфометрическую и иммуногистохимическую характеристики интернейронов в СМ. Линия мышей C57BL/6 является универсальной экспериментальной моделью с подробно изученным фенотипом, широко используется во всех областях медико-биологических исследований [1]. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Мышей выводили из эксперимента под уретановым наркозом (3 г/кг, внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии раствора стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (PBS; 0,01М, pH 7,4) (БиолоТ, Россия), затем 4 % pаcтвоpа паpафоpмальдегида (Sigma, США) на PBS. Извлекали ТIII- ТV-сегменты СМ, которые дополнительно фиксировали в течение 2 чв 4 % растворе параформальдегида на PBS при 4 ºС. После этого промывали трехкратно в растворе PBS в течение 30 мин и оставляли в 30 % растворе сахарозы на 24 ч при 4 ºС. Из выделенных сегментов СМ на криостате Shandon E (Thermo Scientific, Великобритания) готовили поперечные серийные срезы толщиной 14 мкм. Выявление интернейронов, cодержащих кальций-связывающие белки, проводили с использованием меченых антител: первичные антитела (Abcam, Великобритания) - поликлональные кроличьи против КАБ - разведение 1:500; против КАР - разведение 1:100; против ПАВ - разведение 1:300; вторичные ослиные антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США) против кроличьего иммуноглобулина G, конъюгированные с флюоресцеин-изотиоцианатом - FITC (разведение 1:100), флюоресцирующим в зеленой области спектра. Окраску клеток всей популяции интернейронов проводили красителем, флюоресцирующим в красной области спектра, NeuroTrace Red Fluorescent Nissl Stains (Molecular Probes, США) - разведение 1:200. После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции VectaShield (Vector Laboratories, США). Для исключения неспецифической реакции часть срезов инкубировали без первичных и(или) вторичных антител. Препараты просматривали в микроскопе Олимпус BX43 (Olympus Corporation, Япония), оснащенном набором флюоресцентных фильтров-блоков. Изображения получали посредством охлаждаемой цифровой видеокамеры TСC- 5.0ICE (Tucsen, Китай). Для выявления интернейронов использовали каждый пятый срез - всего 15 срезов с каждого образца. На срезах (объектив 10×0,30) изучали топографию ИР-интернейронов дорсального рога СМ, устанавливая их положение в пластинках СМ, конфигурация которых соответствовала верхним грудным сегментам [12]. На срезах (объектив 20×0,50) проводили подсчет всех интернейронов и интернейронов, содержащих исследуемые кальцийсвязывающие белки в пластинках СМ, и с помощью программы Image J (NIH, США) измеряли их площадь сечения (ПС). Долю ИР-интернейронов определяли как их отношение к общему количеству интернейронов, выявленных в пластинках с использованием NeuroTrace Red, которое принимали за 100 %. Анализу подлежали интернейроны, срез которых прошел через ядро с видимым ядрышком и флюоресценцией, превышающей фоновое свечение. Математическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., 2011). Все величины представлены как средняя арифметическая величина ± ошибка средней. Учитывая количественные различия выборок, значимость различий средних величин определяли по методикам ANOVA и критерию Тьюки Рost-hoc-анализа. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты исследования. Согласно табл. 1, наибольшее количество интернейронов, выявленных флюорецентным методом Ниссля (NeuroTrace Red), располагается в пластинке II дорсального рога СМ, а наименьшее - в области медиального края (ОМК) - область расположения части пластинки IV. Это топографически соответствует медиальному краю шейки и основания дорсального рога СМ, включая и область дорсальной серой спайки спинномозгового поля X (пластинка X). ИР-интернейроны выявлены во всех пластинках дорсального рога СМ (рисунок). Интернейронов, содержащих ПАВ, не обнаружено только в пластинке I (см. рисунок, в). ИР-интернейроны характеризовались яркой флюоресценцией нейроплазмы, проксимальных отделов нервных волокон и отсутствием флюоресценции в ядре. Интенсивность свечения была одинаковой во всех ИР-интернейронах. В каждой из пластинок относительное содержание ИР-интернейронов в зависимости от экспрессии исследуемого белка составляло: для КАБ - в I - 27,0 %, во II - 29,0 %, в III - 11,4 %, в IV - 7,2 %, в V - 10,9 %, в ОМК - 9,4 %; для КАР - в I - 5,1 %, во II - 21,5 %, в III - 1,5 %, в IV - 1,8 %, в V - 2,7 %, в ОМК - 0,7 %; для ПАВ - во II - 1,2 %, в III - 1,7 %, в IV - 5,7 %, в V - 6,2 %, в ОМК - 1,4 %. В пластинках I и II располагались ИР-интернейроны, которые имели округлую и веретеновидную форму, свечение в которых было выявлено лишь в клеточных телах (см. рисунок, а-в). В пластинках III и IV выявлены ИР-интернейроны, имевшие только веретеновидную форму с флюоресценцией, локализованной как в телах клеток, так и в их отростках. ИР-отростки интернейронов пластинок III и IV распространялись в вентральном направлении к пластинке II и вентромедиальном направлении к пластинке X. Длина их была одинаковой, не превышала 10 мкм. В пластинке V выявлены ИР-интернейроны треугольной и веретеновидной формы, расположенные параллельно дорсовентральной оси, флюоресцирующие отростки которых длиной до 30 мкм распространялись в дорсовентромедиальном направлении. В ОМК дорсального рога СМ ИР-интернейроны характеризовались округлой и веретеновидной формой и флюоресцирующими отростками длиной до 35 мкм, ориентированными в дорсомедиальном направлении. Топографически ИР-интернейроны локализовались и в области дорсальной спайки спинномозгового поля X вблизи с границей белого вещества и были представлены одиночными округлыми или веретеновидными клетками, клеточные тела которых располагались поперечно, а их отростки распространялись по направлению к дорсальному рогу, прослеживаясь в области его медиального края (см. рисунок, г). При анализе средней площади сечения ИР-интернейронов обнаружено, что в дорсальном роге СМ размеры клеток находятся в пределах от 37,2 до 175 мкм2 (табл. 2). При этом в субпопуляциях самыми крупными являлись интернейроны пластинки V - иммунореактивные ко всем кальций-связывающим белкам и ОМК - иммунореактивные к ПАВ (ПС превышала 100 мкм2), а самыми мелкими - интернейроны пластинки I - ИР к КАБ, пластинок I и II - ИР кКАР, пластинки II - ИР кПАВ. При этом размеры клеток были максимальными в субпопуляции ИР-интернейронов к КАР в пластинках I и III, к КАБ - в пластинках II, IV и V, а к ПАВ - в ОМК. Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования показали, что во всех пластинках дорсального рога верхних грудных сегментов СМ мыши выявляются субпопуляции интернейронов, которые содержат КАБ, КАР и ПАВ, за исключением пластинки I, где ПАВ-интернейроны отсутствуют. Относительное содержание ИР-интернейронов максимально в пластинках I и II дорсального рога СМ для субпопуляции клеток, содержащих КАБ (более 25 %), и только в пластинке II - содержащих КАР (более 20 %). Во всех остальных пластинках содержание ИР-субпопуляций интернейронов не превышает 11 % для КАБ, 3 % - для КАР и 6 % - для ПАР. По данным других исследований, количественное распределение субпопуляций кальций-связывающих белков в дорсальном роге СМ является преобладающим для КАБ [2, 4, 6, 7, 9] и КАР [3] и немногочисленным для ПАВ [3, 4] в поверхностной области дорсального рога (ПОДР), объединяющей пластинки I-II. В то же время, в нашей работе у самок мышей в пластинке I ПАВ-интернейроны не выявлены, а количественное распределение КАР-интернейронов не превышает 5 %. Распределение субпопуляции ПАВ-интернейронов в пластинках IV и V ИР-клеток оказалось большим, чем в других пластинках дорсального рога СМ. Это может быть обусловлено преимущественной выявляемостью ПАВ в нейронах дорсального ядра СМ и высоким уровнем экспрессии этого белка, определяемого методом вестерн-блоттинга, непосредственно в грудных сегментах СМ [3]. Возможно, большая выявляемость ПАВ в интернейронах пластинок IV и V по сравнению с другими пластинками определяется и его преимущественной экспрессией в тормозных интернейронах серого вещества СМ, содержащих ГАМК/глицин [11]. Самой малочисленной ИР-субпопуляцией оказались интернейроны, содержащие КАР в пластинках III, IV, V и ОМК и содержащие ПАВ - в пластинке III и ОМК. Особое внимание уделяют ОМК дорсального рога из-за преобладания клеточной плотности интернейронов в медиальной трети дорсального рога по сравнению со срединной и латеральной частями [9]. Именно здесь и локализуются премоторные интернейроны [5], содержащие КАБ [2, 7]. В то же время, нейроны ОМК дорсального рога, экспрессирующие нейрональные кальцийсвязывающие белки (NECAB 1/2), участвуют в формировании дорсальной комиссуральной области СМ, нейроны которой соединяют правый и левый дорсальные рога [11]. Как видно из полученных нами данных, в ОМК выявляются ИР-интернейроны, содержащие все исследуемые кальций-связывающие белки, но содержание субпопуляции КАБ-интернейронов преобладает. Субпопуляции ИР-интернейронов отличаются по своим морфометрическим характеристикам и, как видно из табл. 2, представлены нейронами различных размеров - от очень мелких до крупных. Но несмотря на значительную вариабельность показателя, средние размеры оказались больше у интернейронов, содержащих КАБ в пластинках II, IV и V, КАР - в пластинках I и III, ПАВ - в ОМК. Меньшие размеры имели интернейроны, содержащие ПАВ, которые расположены в пластинках II, III, IV и V. В предыдущих исследованиях ПАВ выявляли в более крупных интернейронах дорсального рога СМ на поясничном уровне [3], а КАБ и КАР - в пластинках глубокой области дорсального рога, объединяющей III-V пластинки грудных сегментов у взрослых крыс [2, 3]. Заключение. Топографически можно выделить четыре области расположения субпопуляций ИР-интернейронов, содержащих исследуемые кальций-связывающие белки, с характерными для каждой формами клеток: поверхностная область - пластинки I и II; глубокая область - пластинки III и IV, пластинка V, область медиального края. Количественные и морфометрические характеристики каждой субпопуляции ИР-интернейронов различны для каждой пластинки дорсального рога СМ. Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 17-04-00349-а). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: П. М. М. Сбор и обработка материала: А. И. Е. Статистическая обработка данных: В. В. П. Анализ и интерпретация данных: В. В. П. Написание текста: В. В. П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов

About the authors

V. V. Porseva

Yaroslavl State Medical University

Email: vvporseva@mail.ru
Department of Pathophysiology 5 Revolutsionnaya St, Yaroslavl 150000

A. I. Emanuilov

Yaroslavl State Medical University

Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St, Yaroslavl 150000

P. M. Masliukov

Yaroslavl State Medical University

Department of Normal Physiology 5 Revolutsionnaya St, Yaroslavl 150000

References

Supplementary files