MORPHOLOGICAL SUBSTANTIATION OF THE POSSIBILITY OF CREATING A BILATERAL MODEL OF ISCHEMIA- REPERFUSION

Full Text

Введение. В течение последних 25 лет час-тота возникновения острого почечного повреждения возросла в 20 раз и составляет в среднем 13-20% от всех госпитализаций [1, 2]. Парал-лель-но росту заболеваемости увеличиваются инвалидизация и смертность от острого почечного повреждения. Ишемическое повреждение, усугуб-ляющееся впоследствии реперфузией органа, является ведущей патогенетической причиной в этиологии острого почечного повреждения [3-5] и остается актуальной мультидисциплинарной проблемой [6]. Высокий уровень финансовых и социальных потерь от острого почечного повреждения, инициированного ишемией-реперфузией, а также сложность прогнозирования эффективности различного рода вмешательств у пациентов с нарушением функции почек, определили целесообразность проведения морфологических исследований при экспериментальной ишемии почек в различные сроки после реперфузии. Цель работы - выявить и изучить степень выраженности морфологических изменений структур коркового и мозгового вещества почки на фоне смоделированной билатеральной модели ишемии-реперфузии, изучение морфологических изменений в корковом веществе почек у крыс на фоне билатеральной модели ишемии-реперфузии на 1-е и 3-и сутки после оперативного вмешательства. Материал и методы. Работа проведена на 30 крысах-самцах массой 180-220 г, которые были разделены на 3 группы по 10 особей, включающие интактных крыс, ложнооперированных крыс и экспериментальную группу с моделированием билатеральной ишемии-реперфузии. На проведение исследования получено разрешение регионального этического комитета ФГАОУ ВО БГНИУ от 08.06.2016 г. (протокол 6). Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдались в соответствии с «European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123». Под общей анестезией (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) проводили срединную лапаротомию с последующим выделением почечных ножек и последовательным наложением атравматичных сосудистых зажимов на обе ножки с ишемическим периодом 40 мин под контролем микроциркуляции. Далее снимали зажимы, промывали брюшную полость физиологическим раствором и послойно ушивали рану. Через 24 или 72 ч после эксперимента животных подвергали эвтаназии с последующим забором почек для морфологического исследования. Для проведения гистологического исследования полученный материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина, после чего иссекали участок тканей размерами 1×1 см и заливали в парафин по стандартной методике с последующим изготовлением срезов толщиной 5-7 мкм. Полученные гистологические срезы окрашивали гематоксилином - эозином, по методу Ван-Гизона, Маллори. Микроскопирование и фотографирование осуществляли с помощью оптической системы, состоящей из микроскопа Leica CME и окулярной камеры DCM-510 при увеличениях 100, 200 и 400 с документированием снимков в программе FUTURE WINJOE, входящей в комплект поставки окулярной камеры. На микрофотографиях с использованием программы ImagoJ проводили измерение высоты эпителиоцитов в проксимальных и дистальных извитых канальцах нефрона, площади поперечного сечения почечного тельца, площади клубочка и ширины капсулярного пространства. Для всех данных применена описательная статистика, данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m). В случаях ненормального распределения были рассчитаны медиана (Me) и квартильный размах (QR). Межгрупповые различия анализировались с применением параметрического t-критерия Стьюдента или непараметрического критерия Манна-Уитни в зависимости от типа распределения. Различия считались значимыми при р<0,05. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Statistica 10.0. Результаты исследования. В группе интактных животных при макроскопическом исследовании почек видимых структурных нарушений не отмечалось: поверхность их была гладкая, фиброзная капсула снималась легко, на разрезе корковое и мозговое вещество имели выраженную границу. В группе ложнооперированных животных также не отмечалось видимых структурных нарушений почек, однако в брюшной полости содержалось небольшое количество выпота серозного характера. После ишемии-реперфузии на 1-е и 3-и сутки эксперимента в брюшной полости также содержалось небольшое количество серозного выпота, брюшина оставалась неизмененной. Почки имели неоднородную окраску с мелко- и крупноочаговыми включениями, на разрезе утрачивалась четкая граница между корковым и мозговым веществом. При микроскопическом изучении гистологических срезов почки у интактных животных в области коркового вещества хорошо визуализировались почечные тельца, основу которых составлял сосудистый клубочек, окруженный двухлистковой капсулой. Внутренний листок капсулы клубочка очень плотно прилежал к кровеносным капиллярам, а наружный листок, образованный плоскими эпителиоцитами, отделялся от внутреннего листка щелевидной полостью капсулы. На апикальной поверхности кубических эпителиоцитов, выстилающих проксимальные извитые канальцы, хорошо визуализируется щеточная каемка. В дистальных извитых канальцах определяется четкий широкий просвет. В собирательных трубках, выстланных кубическими эпителиоцитами со светлой цитоплазмой, просвет еще более широкий. Между канальцев визуализируются тонкие прослойки соединительной ткани, образующие строму почки. В группе наблюдений с ложнооперированными животными значимых микроструктурных отличий от группы интактных животных выявлено не было. В условиях эксперимента через 1 сут после ишемии в корковом веществе почки наблюдались выраженные дистрофические изменения в ка-нальцах и интерстиции. В корковом веществе наблюдались интерстициальный отек, увеличение площади клубочка на срезе и, как следствие, уменьшение ширины капсулярного пространства. В строме почки наблюдалась инфильтрация лимфоцитами. Повреждения клеток почечных канальцев проявлялись уплощением или утратой щеточной каймы, набуханием и вакуолизацией цитоплазмы. На единице площади среза число клубочков почки было снижено в сравнении с группами контроля. На границе между корковым и мозговым веществом в почечных канальцах наблюдались также отрыв клеток от базальной мембраны, слущивание их в просвет канальца, склеивание и образование конгломератов, способствующих закупорке просвета канальцев. В мозговом веществе почки почечные канальцы были расширены, в собирательных трубочках на поперечных разрезах также обнаруживались конгломераты из отслоившихся от базальной мембраны погибших клеток эпителия, способствующих нарушению оттока мочи. На 3-и сутки после оперативного вмешательства наблюдалось нарастание выявленных ранее повреждений эпителиоцитов канальцев. Единично визуализируемые в поле зрения сморщенные клубочки ранее имели тенденцию к увеличению их количества, встречались некротизированные почечные тельца, наблюдался застой крови. Кровеносные капилляры, окутывающие канальцы, были расширены, кровенаполнены. Интерстициальный отек, часто сопровождающийся лейкоцитарной инфильтрацией стромы и канальцев, продолжал усиливаться. В некоторых участках наблюдался очаговый некроз канальцев. Щеточная кайма на апикальной поверхности эпителиоцитов была разрушена полностью. Наблюдались разрыв межклеточных контактов в эпителии и отслойка эпителиоцитов от базальной мембраны. Также следует отметить увеличение количества локальных участков с хорошо визуализируемой обструкцией просвета почечных канальцев цилиндрами из слущенных эпителиоцитов. Почечные канальцы выглядели расширенными, при этом площадь конгломератов была больше, чем на 1-е сутки эксперимента. Увеличивался просвет собирательных трубочек, нисходящие и восходящие отделы петель нефронов были расширены. Высота эпителия в проксимальных извитых канальцах в почках интактных и ложнооперированных крыс составила 10,54±0,23 и 11,28±1,56 мкм соответственно. Через 1 сут после оперативного вмешательства высота эпителиоцитов в проксимальных канальцах уменьшилась в 1,4 раза в сравнении с ложно-оперированными животными. На 3-и сутки было выявлено значимое уменьшение высоты уже в 1,7 раза (6,56±0,74 мкм). Полученные количествен-ные данные были вполне сопоставимы с выявленными качественными изменениями в прокси-мальных канальцах, а именно, раз-рушением щеточной каймы на апикальной поверхно-сти эпителиоцитов и отслойкой клеток от ба-зальной мембраны. В дистальных извитых канальцах нефрона высота эпителия имела те же изменения. Максимальное снижение высоты эпителиоцитов в 1,7 раза происходило через 3-и сутки после оперативного вмешательства, высота эпителиоцитов уменьшилась до 4,24±0,73 мкм. Было также выявлено, что на фоне незначительного уменьшения размеров почечного тельца показатель площади клубочка был значимо меньше (в 1,7 раза). Все приведенные данные морфометрии представлены в табл. 1 и 2. Обсуждение полученных данных. Согласно современным представлениям, в патогенезе острого почечного повреждения ишемически-реперфузионного генеза ведущую роль играет первичное поражение почечных канальцев - острый канальцевый некроз, развивающийся в первые несколько суток после патологического стимула [2, 8]. Результаты данного исследования согласуются с общепризнанной концепцией: после 40-минутного эпизода ишемии на 1-е сутки изменения затрагивают в большей степени почечные канальцы - снижается высота однослойного кубического эпителия, наблюдаются нарушение полярности клеток, целостности их межклеточных контактов, уплощение или утрата щеточной каймы, набухание и вакуолизация цитоплазмы, выраженность которых нарастает к 3-м суткам реперфузии. Изменения структуры клубочков носят вторичный характер, при этом выраженность патологических структурных изменений также нарастает через 72 ч реперфузии. Заключение. Выявленные нами структурные изменения в почках являются морфологическим обоснованием возможности применения разработанной 40-минутной билатеральной модели ишемии-реперфузии в экспериментальных исследованиях с целью дальнейшей экстраполяции полученных данных в клиническую практику. Предлагаемая экспериментальная модель острого почечного повреждения позволяет со--здать комп-лекс патоморфологических изменений в почках, соответствующих реальной клинической практике и сопутствующих кардиохирургическим, урологическим и трансплантологическим вмеша-тельствам. Типичная гистологическая картина, соответствующая современным пред-ставлениям о патогенезе острого почечного повреждения, позволяет использовать 40-минутную билате-ральную модель ишемии-реперфузии почек с оценкой патоморфологической картины и морфомет-рии в качестве экспериментальной модели для оценки характера и выраженности нефропротективных свойств различного рода вмешательств с целью профилактики и лечения острого почечного повреждения. Представленная модель ишемически-реперфузионых повреждений почек является адекватной и может быть использована для оценки нефропротективных свойств новых лекарственных препаратов. Вклад авторов: Кон цепция и дизайн исследования: В. В. Е., Д. А. К., О. И. Б., Т. Г. П. Сбо р и обработка материала: В. В. Е., Д. А. К., М. А. З., В. В. Г. Статистическая обработка данных: М. А. З., Е. С. З. Ана лиз и интерпретация данных: В. В. Е., Д. А. К., М. А. З., С. Л. К. Нап исание и редактирование текста: В. В. Е., Д. А. К., О. И. Б., Т. Г. П., М. А. З., С. Л. К., В. В. Г. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

V. V. Elagin

Kursk State Medical University

Email: vlad.elagin2014@yandex.ru
Department of Urology 3 Karl Marx St., Kursk 305041

D. A. Kostina

Belgorod State National Research University

Email: kostina_da@bsu.edu.ru
Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology 85 Victory St., Belgorod 308015

O. I. Bratchikov

Kursk State Medical University

Email: bratov45@mail.ru
Department of Urology 3 Karl Marx St., Kursk 305041

T. G. Pokrovskaya

Belgorod State National Research University

Email: pokrovskaia-tg@mail.ru
Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology 85 Victory St., Belgorod 308015

C. L. Kuznetsov

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: vakmedbiol@rambler.ru
Department of Histology, Embryology, Cytology 8/2 Trubetskaya St., Moscow 119991

M. A. Zatolokina

Kursk State Medical University

Email: marika1212@mail.ru
Department of Histology, Embryology, Cytology 3 Karl Marx St., Kursk 305041

V. V. Gureev

Belgorod State National Research University

Email: produmen@yandex.ru
Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology 85 Victory St., Belgorod 308015

Ye. S. Zatolokina

Kursk State Medical University

Email: jenazatolokina@gmail.com
Department of Histology, Embryology, Cytology 3 Karl Marx St., Kursk 305041

References

Supplementary files