STIMULATION OF RAT SKELETAL MUSCLE ANGIOGENESIS BY DIRECT AND CELL-MEDIATED ADMINISTRATION OF RECOMBINANT ANGIOGENIN GENE

Full Text

Введение. Согласно популяционным исследованиям, распространенность хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) достигает 10 % [15]. С начала XXI в. отмечен рост количества пациентов с этой патологией более чем на 23 % [13]. В настоящее время задача по поиску способов эффективного лечения пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий, приводящих к ХИНК, остается актуальной проблемой ангиологии и сосудистой хирургии, прежде всего, в связи с высокой распространенностью данной патологии, трудностями и длительностью лечения, его высокой стоимостью, а также степенью инвалидизации данной категории пациентов. В 1993 г. М.Höckel предложил стимулировать ангиогенез в ишемизированной ткани при помощи ангиогенных факторов, например, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) [14]. Более 15 лет проводятся экспериментальные и клинические исследования с применением генетических конструкций для лечения ХИНК. В этом направлении активно изучают гены VEGF, факторов роста фибробластов (FGF), трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF). Эффекты генотерапевтических конструкций изучали на различных экспериментальных моделях: ишемии задних конечности у крыс и кроликов, острой и хронической ишемии миокарда у собак и мини-свиней. Показано, что введение генов факторов роста стимулировало развитие новых коллатералей и капилляров [9, 11, 12, 17]. В эксперименте на модели ишемии конечности крысы показано, что плазмиды с геном Ang обладают выраженным стимулирующим влиянием на ангиогенез [3]. В другом исследовании показано усиление перфузии в ишемизированной скелетной мышце крысы на 30 % от исходного уровня при внутримышечном введении плазмидного вектора с геном Ang [1]. Таким образом, введение генетических конструкций, полученных методом генной инженерии, в ткани, испытывающие ишемию, обеспечивает длительный синтез ростовых факторов, что в результате ведет к развитию выраженного коллатерального русла и, следовательно, к увеличению перфузии ткани и снижению степени ишемии. В экспериментальных и клинических условиях показано стимулирующее влияние ангиогенина (Ang) на ангиогенез в ишемизированной скелетной мышце, что проявляется в усилении перфузии ишемизированной ткани и увеличении количества капилляров [2, 3, 5]. В эксперименте на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов и модели ишемии конечности крысы показано, что плазмиды с геном Ang обладают ангиогенной активностью. В исследованиях на пациентах показано уменьшение выраженности ишемии конечности, что подтверждено данными допплеровской флоуметрии и тестирования двигательной функции на беговой дорожке [3]. Изучены эффекты введения плазмид с генами VEGF и Ang, а также вирусных векторных конструкций CELO-Ang, Ad5-Ang, Ad5-(Ang+VEGF) при введении их в ишемизированные нижние конечности у пациентов [2]. При использовании этих генетических конструкций было выявлено увеличение расстояния безболевой ходьбы, улучшение перфузии мышцы, уменьшение времени восстановления исходных показателей кровотока и повышение качества жизни. Введение генетических конструкций приводило к развитию системной воспалительной реакции, однако в случае использования аденовирусных векторов ее выраженность была минимальной [2]. При внутримышечном введении плазмидного вектора со встроенными ангиогенными генами достигается эффективное стимулирование ангиогенеза в ишемизированных конечностях [7]. Для проведения клеточно-опосредованной терапии наиболее перспективными на сегодняшний день представляются мононуклеарные клетки крови пуповины (МККП). Основанием для их применения являются пригодность как для алло-, так и для аутотрансплантации у человека, низкая иммуногенность, доступность, простота получения и хранения. В крови пуповины присутствуют стволовые клетки, являющиеся источником многочисленных ростовых и трофических факторов и способные давать начало специализированным клеткам разных тканей и стимулировать ангиогенез [16]. Процедура введения МККП малоинвазивна и, согласно многочисленным экспериментальным данным, эффективна [10, 15]. Цель данного исследования - оценить эффективность реваскуляризации ишемизированной скелетной мышцы крысы при введении в область ишемии рекомбинантного гена Ang, а также при его доставке с помощью МККП. Материал и методы. Исследования были проведены на 45 крысах линии Wistar (обоего пола массой 180-250 г). Все вмешательства соответствовали правилам, утвержденным локальным этическим комитетом Казанского медицинского университета (выписка из протокола заседания № 2 ЛЭК КГМУ от 20.02.2018 г.). Все крысы получали стандартный лабораторный корм и имели доступ к воде и пище. Животных наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией раствора хлоралгидрата (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г, Sigma, США). Ишемию задней конечности создавали путем наложения на бедренную артерию диаметром 1 мм двух лигатур из проленовой нерассасывающейся нити Ethicon (4/0) на расстоянии 3 мм между лигатурами. Участок между лигатурами рассекали, проводили визуальный контроль гемостаза. Рану ушивали наглухо рассасывающимся шовным материалом Vicril Ethicon (3/0). После операции животные получали инъекцию 1 мл разведенного в физиологическом растворе цефтриаксона (Борисовский завод медицинских препаратов, Беларусь) в мышцу бедра на контралатеральной конечности. В экспериментах использовали аденовирусный вектор 5-го типа с встроенной экспрессионной конструкцией, несущей ген Ang (Ad5-Ang). В качестве носителей гена использовали МККП. Через 14 сут после операции крыс разделили на 3 группы. Животным 1-й группы (n=15) однократно вводили 60 мкл Ad5-Ang в 4 точки дистальной части икроножной мышцы, по 15 мкл в каждую точку, c общим количеством вирусных частиц 2×1010 (группа Ad5-Ang). Животным 2-й группы (n=15) однократно вводили 2×106 МККП, трансдуцированные Ad5-Ang, в 4 точки дистальной части икроножной мышцы по 15 мкл в каждую точку (группа МККП+Ad5-Ang). Животным 3-й группы (n=15) инъецировали физиологический раствор в объеме 60 мкл на одно животное в те же точки (группа контроля). Через 14 и 28 сут после введения генетической конструкции животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4 % раствором параформальдегида (4 ºС). Икроножную мышцу забирали и обрабатывали по стандартной методике для последующего иммуногистохимического анализа. Икроножную мышцу забирали и заливали в парафин по стандартной методике. Изготавливали поперечные срезы мышц толщиной 5 мкм и использовали их для гистохимического и иммуногистохимического анализа. Для морфометрического анализа мышечных волокон и подсчета центрально-ядерных волокон применяли окрашивание поперечных срезов гематоксилином. Для определения васкуляризации проводили иммуногистохимическую реакцию с антителами против CD31 (ab182981, abcam) эндотелия сосудов, для визуализации использовали вторичные антитела осла к IgG кролика, конъюгированные с флюорохромом Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A-31572). Ядра окрашивали DAPI. Флюоресцентные изображения получены с помощью лазерного конфокального микроскопа LSM 700 (Carl Zeiss, Germany) при ув. 630. Световые изображения оцифровывали с использованием сканера Aperio CS2. Морфометрический анализ проводили с помощью программного обеспечения Image Scope. Подсчет количества кровеносных сосудов и мышечных волокон с центральным расположением ядер (МЦЯ) осуществляли в области ишемии и на расстоянии в пределах 500 мкм от области введения генной или генноклеточной конструкции (рис. 1). Интенсивность кровотока регистрировали аппаратом для измерения микроциркуляторного русла Easy LDI (England). Для контроля наступления ишемии производили замеры, выраженные в перфузионных единицах (apu) в конечности до операции, на следующий день и 5-е сутки после операции. В ишемизированной конечности крысы после создания ишемии зарегистрировано стойкое снижение кровотока на 45 % на следующий день и 5-е сутки. Кровоток в прооперированной конечности уменьшился с 123±0,8 до 56±0,5 apu. В последующем значения кровотока сохранялись в пределах 62±1,3 apu до введения генетических конструкций. Усиление ангиогенеза оценивали как плотность распределения мышечных волокон, капилляров и соотношение количества капилляров/мышечные волокна. Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при p<0,05. Результаты исследования. На 14-е сутки в группе МККП+Ad5-Ang с клеточноопосредованной доставкой трансгена показатель отношения количества капилляров к количеству мышечных волокон увеличивается по сравнению с таковым в контрольной группе [1,77±0,31 (контроль) против 2,78±0,23 (МККП+Ad5-Ang), р<0,05]. На 28-е сутки после введения генетических конструкций в группе МККП+Ad5-Ang этот показатель также превышает его значение в контроле, но различия не были значимыми [2,08±0,42 (контроль) против 2,52±0,38 (МККП+Ad5-Ang), р>0,05]. В этот же срок значимые различия между контрольной и Ad5-Ang группами не обнаружены [2,08±0,42 (контроль) против 1,55±0,60 (Ad5Ang), р>0,05]. Количество мышечных волокон на 14-е сутки в исследуемой области в группе Ad5-Ang не изменяется [553±39,3 (контроль) против 623,43±109,39 (Ad5-Ang), р>0,05], в то время как в группе МККП+Ad5-Ang уменьшается [553,31±79,74 (контроль) против 349,52±29,80 (МККП+Ad5Ang), р<0,05]. К 28-м суткам этот показатель в группе МККП+Ad5-Ang также меньше такового в контрольной группе [813,48±200,71 (контроль) против 415,52±106,15 (МККП+Ad5-Ang), р<0,05]. Он также уменьшается в группе Ad5-Ang [813,48±200,71 (контроль) против и 273,34±82,09 (Ad5-Ang), р<0,05]. Количество МЦЯ к 14-м суткам существенно увеличивается в обеих экспериментальных группах с применением генетических конструкций, но между этими группами различия не обнаружены [0,125±0,35 (контроль) против 3,2±0,84 (Ad5-Ang), р<0,05] и [0,125±0,35 (контроль) против 2,4±1,52 (МККП+Ad5-Ang), р<0,05]. Они не обнаружены и при сравнении по этому показателю любой пары групп, включая контрольную, на сроке 28 сут (рис. 2). Обсуждение полученных данных. Доставка рекомбинантного гена Ang человека в область ишемии конечности крысы приводит к увеличению отношения количества капилляров к количеству мышечных волокон в этой области, что указывает на проявление ангиогенных свойств Ang в данной экспериментальной модели. Эти результаты нашего исследования соотносятся с данными литературы. Согласно этим данным, введение в экспериментальных и клинических условиях рекомбинантного гена Ang при помощи аденовирусного вектора Ad5 оказывает выраженное стимулирующее влияние на ангиогенез в ишемизированной скелетной мышце, что проявляется в усилении перфузии ишемизированной скелетной мышцы и увеличении количества капилляров [2, 3]. Однако в этих исследованиях генетические конструкции с Ang вводили в комбинации с выполнением оперативных вмешательств на артериях нижних конечностей. Ввиду этого объективная оценка причины улучшения у пациентов с ХИНК представляется затруднительной. Прямая генная терапия имеет ряд определенных недостатков - невысокая эффективность трансфекции, отсутствие способов прекращения избыточного синтеза ангиогенного фактора трансфицированными клетками реципиента, возможный иммунный ответ организма на белок, синтезируемый в организме с помощью вирусного вектора [4]. Альтернативным направлением является доставка генетического материала на клеточных носителях (клеточно-опосредованная доставка). Предложено использовать различные клетки (костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови и др.). Во многих работах отмечается значительный положительный опыт применения данных технологий [4, 6]. Уменьшение количества мышечных волокон под действием трансгена может свидетельствовать об ускорении их обновления новыми волокнами в результате интенсификации обменных процессов вследствие усиления перфузии в области ишемии. Этот эффект наблюдается на всех сроках наблюдений, т.е. проявляется в течение длительного периода и является достаточно устойчивым. Об усилении постишемической регенерации мышечной ткани свидетельствует увеличение количества МЦЯ под действием Ang. Стимулирование репаративного миогенеза под влиянием Ang может быть результатом прямого действия фактора на миогенные клеткипредшественницы или следствием усиления перфузии и активации обменных процессов в области ишемического повреждения. На 14-е сутки в группе МККП+Ad5Ang показано значимое увеличение показателя отношения количества капилляров к количеству мышечных волокон. На 28-е сутки в группе МККП+Ad5-Ang и группе Ad5-Ang значимые различия по данному показателю при сравнении с контрольной группой не зарегистрированы. Количество мышечных волокон на 14-е сутки в группе Ad5-Ang не изменяется, а в группе МККП+Ad5-Ang - уменьшается. Количество МЦЯ существенно увеличивается в обеих экспериментальных группах с применением генетических конструкций на 14-е сутки. При сравнении двух экспериментальных подходов доставка гена Ang при помощи МККП по сравнению с прямым введением гена Ang оказалась более эффективной по критерию отношения количества капилляров к количеству мышечных волокон. Но при прямом введении гена Ang по сравнению с клеточно-опосредованной доставкой этого гена лучшие результаты получены по критерию увеличения количества МЦЯ. Эти результаты указывают на перспективность сочетанного применения двух апробированных в этой работе способов доставки гена Ang в область ишемии с целью преодоления ее последствий. Заключение. Таким образом, доставка рекомбинантного гена Ang при помощи МККП стимулирует постишемический ангиогенез и регенерацию в скелетной мышце. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

I. V. Samatoshenkov

Kazan State Medical University

Email: mr.samatoshenkov@mail.ru
49 Butlerova St., Kazan 420012

References

Supplementary files