MORPHOLOGICAL PATTERN AND MORPHOMETRIC STUDY OF THE CEREBRAL CORTEX OF RATS WITH DIFFERENT TYPOLOGICAL CHARACTERISTICS OF HIGHER NERVOUS ACTIVITY

Full Text

Введение. Типологические особенности высшей нервной деятельности находятся в тесной взаимосвязи друг с другом и соматическими реакциями. Так, снижение частоты сердечных сокращений у нетревожных субъектов при решении когнитивных задач указывает на творческий, аналитический характер их деятельности [11]. В настоящее время показана взаимосвязь между уровнем развития когнитивных способностей у человека и смертностью [10, 14]. Вместе с тем, в исследованиях, проведенных на людях, нет возможности отделить влияние соматических факторов, ассоциированных с высоким уровнем когнитивных способностей, от культурных или социальных, обусловленных уровнем развития интеллекта [12]. Стрессоустойчивость также не является исключительно функциональной характе ристикой, так, низкая стрессоустойчивость ассоциирована с худшим прогнозом при хронической ишемии головного мозга [1]. Функциональная основа уровня стрессоустойчивости заключается в организации энергетического метаболизма мозга стрессоустойчивых и стрессонеустойчивых крыс. У первых животных определяется значимое, почти двукратное преобладание системы акцепторов водорода (НАД+НАДН) над системой макроэргов (АТФ и креатинфосфата), отмечено, что тестирование животных в «открытом поле» позволяет прогнозировать уровень «метаболической защиты мозга» [4]. Таким образом, представляет интерес выявление морфологических и морфометрических коррелятов стрессоустойчивости и когнитивных способностей лабораторных животных в коре больших полушарий головного мозга. Материал и методы. Эксперимент одобрен этическим комитетом ФБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (протокол № 8 от 24.03.2016 г.) и выполнен в соответствии с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г. Эксперимент проводили на 24 крысах (12 самцов и 12 самок) массой 180-200 г, линии Wistar, возраст 3 мес. Крыс содержали в стандартных условиях вивария. Ориентировочно-исследовательское поведение животных оценивали с помощью теста «открытое поле» [7]. По результатам тестирования 24 исследуемых животных были разделены на две одинаковых по численности подгруппы: животные с низким и высоким уровнем тревожности, которым соответствует высокий (ВУС) и низкий уровень стрессоустойчивости (НУС), по 12 животных в каждой подгруппе. Для оценки состояния когнитивных функций при гипоксии головного мозга (способности к пространственному обучению) использовали тест - водный лабиринт Морриса [6], по результатам которого 24 крысы были разделены на две подгруппы: с высоким (ВУК) и низким уровнем развития когнитивных функций (НУК), по 12 животных в каждой подгруппе. Животных выводили из эксперимента наркозом золетилом. Полученный материал фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине (БиоВитрум), дальнейшую проводку осуществляли промежуточными смесями Блик (БликМедиклПродакшн, Россия). Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с помощью HM 450 SlidingMicrotome (Карл Цейс, Германия), окрашивали по Нисслю (набор толуидиновый синий, модификация Ниссля, БиоВитрум). Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), маркер зрелых астроцитов, выявляли с помощью первичных поликлональных кроличьих антител (ab16997, UK, разведение 1:200) и вторичных антител (ab97051, UK, 1:1000) с пероксидазной меткой на парафиновых парасагиттальных срезах мозга. Детекцию пероксидазы производили DAB SubstrateKit (ab64238). Срезы докрашивали гематоксилином Майера, промывали в воде, обезвоживали, заключали в канадский бальзам. Для контроля и исключения артефактов при выполнении реакции часть препаратов обрабатывали только вторичными антителами, без нанесения первичных антител. При окраске по Нисслю на микропрепаратах определяли количество: ядросодержащих нейронов с необратимыми изменениями (Nn), нейронов с обратимыми изменениями с двумя ядрышками на 1 мм2 (Nя), постклеточных структур, расположенных на расстоянии диаметра ядра глиоцита [2] (Npc), клеток глии на 1 мм2 среза (Ng), среднее расстояние между кариолеммами ядер нейрона и его сателлита (Sn-s), глиоцитов рядом с гемокапилляром на расстоянии, не превышающем 25 мкм (Nh-g) (по Ю. Г. Васильеву [3]), среднюю площадь перикариона интактных нейронов с ядрами (Sp) и ядер таких нейронов (Sc). Исследовали при помощи светового микроскопа Optica DM-20 (Italy 2015) со встроенной камерой. Маркер GFAP выявляется в цитоплазме и отростках астроцитов. Астроциты после проведения иммуногистохимической реакции визуализируются как клетки округлой или полигональной формы со светлым ядром и с 3-5 извитыми ветвящимися отростками. На каждом срезе в 50 полях зрения оценивали численную плотность распределения астроцитов (ед./мм2), площадь распределения отростков астроцитов (мкм2). Морфометрию осуществляли с использованием программного обеспечения (ImageJ Version). Статистическая обработка данных включала вычисление среднеарифметического значения, его ошибки, оценки амплитуды вариационного ряда. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при p<0,05. Результаты исследования. При морфометрии микропрепаратов, окрашенных по Нисслю, выявлено значимое превышение количества двуядрышковых нейронов в подгруппе животных с НУС, также для животных этой подгруппы характерны значимо бóльшие размеры ядер и площадь цитоплазмы нейронов и, вместе с тем, значимо бóльшее количество нейронов с необратимыми изменениями. Среднее расстояние между перикарионом нейронов и глиоцитами в этой подгруппе также больше. При этом количество погибших клеток сателлитов у животных с низким уровнем стрессоустойчивости меньше, также меньше и периваскулярно расположенных глиоцитов. Анализ срезов, окрашенных по Нисслю, при делении животных по уровню развития когнитивных способностей выявил меньшее количество значимых различий между изучаемыми параметрами исследуемых подгрупп. При этом характер отличий в парах изучаемых параметров ВУК-НУК во многом аналогичен отличиям в парах параметров ВУС-НУС. Для подгруппы с НУК также характерно большее количество нейронов с двумя ядрышками, большая площадь перикарионов и ядер у нейронов с обратимыми изменениями. Для подгруппы с ВУК, так же как и для животных с ВУС, характерно значимо большее количество постклеточных структур в непосредственной близости от перикарионов, что может трактоваться как гибель сателлитоцитов. Эта аналогия нарушается для количества нейронов с необратимыми изменениями: их количество значимо больше у животных с ВУК и НУС (табл. 1). При морфометрии GFAP+-астроцитов установлено, что выявленные при окрашивании по Нисслю параллели характерны только для средней площади распределения отростков одной GFAP-позитивной клеткой (мкм2): в паре животные с ВУС - животные с НУС и в паре животные с ВУК - животные с НУК значимо более высокие значения характерны для животных с НУС и НУК. Для других параметров морфометрии иммуногистохимических препаратов параллели нарушаются со стороны численной плотности распределения астроцитов. Так, и для животных с ВУС, и для животных с ВУК характерна низкая площадь распределения отростков астроцитов (рисунок, а). При этом для животных с ВУК характерно значимо большее количество тел GFAP-позитивных тел клеток на 1 мм2, а для животных с ВУС - значимо меньшее (табл. 2). Таким образом, для животных с ВУК характерно большее количество астроцитов в срезе, более короткие, но более многочисленные отростки первого порядка и меньшая площадь распределения отростков (см. рисунок, а). Для животных с НУК свойственны самые низкие значения численной плотности астроцитов и при этом чуть бóльшая площадь, занимаемая их отростками (см. рисунок, б). Обсуждение полученных дан ных. Известно, что концентрация астроцитов вблизи кровеносных капилляров, а также рост числа сателлитных форм глиоцитов являются адаптационным механизмом и условием выживания клеток при различных ишемических воздействиях на головной мозг [5]. Учитывая, что астроциты активно участвуют в нейрональном метаболизме, в частности в синтезе и транспорте одного из важнейших нейрональных энергетических субстратов - лактата [13], близость к перикарионам, безусловно, облегчает трофическую функцию астроцитов клеток по отношению к нейронам и минимизирует собственный нейрональный метаболизм. Поэтому увеличение их плотности в периваскулярной зоне и близости к гемокапиллярам у животных с высоким уровнем стрессоустойчивости может рассматриваться как один из механизмов нейроглиальных адаптаций. Также у стрессоустойчивых животных на расстоянии 20 мкм от перикарионов наблюдается бóльшее количество постклеточных структур. Учитывая трофическую роль, которую способны выполнять апоптотические тельца погибших клеток по отношению к микроокружению [8], можно предположить, что низкие показатели метаболической нейрональной активности у животных с высоким уровнем стрессоустойчивости (меньшее количество двуядерных нейронов, меньшая площадь ядра и перикариона) обусловлены более выраженной трофической функцией глиальных клеток. В пользу этого предположения свидетельствует и большее количество нейронов с необратимыми изменениями, выявляемое у животных с НУС. Учитывая большую близость глиальных элементов к перикарионам нейронов животных с ВУС, логично выглядит меньшая площадь покрытия отростками GFAP+-клеток. Вместе с тем, обеспечение нейроглиальных взаимодействий у стресснеустойчивых животных происходит в условиях большей удаленности глиальных элементов от перикарионов нейронов, это сочетается с большей плотностью распределения тел GFAP-позитивных клеток и большей площадью покрытия отростками одной GFAPположительной клетки. С позиций представления об астроцитарной сети, как об экстранейрональной сигнальной системе в ЦНС [9], особый интерес представляет факт, что у животных с ВУК большая численная плотность астроцитов сочетается с меньшей средней площадью покрытия отростками. У животных с НУК, наоборот, меньшему количеству клеток соответствует большая площадь покрытия отростками, которая сочетается с меньшим количеством глиальных клеток при окраске по Нисслю и меньшим количеством погибших клеток-сателлитов. Больший радиус отростков астроцитов, на наш взгляд, приводит к большему радиусу паракринных эффектов и расширению микроокружения одного астроцита, что обеспечивает лучшую синхронность и, как следствие, лучшую метаболическую защиту нейронов у животных с НУК. Об этом свидетельствует большая доля нейронов с необратимыми изменениями у животных с ВУК. Кроме того, в наших исследованиях выявлена значимо большая смертность среди животных с ВУК после операции по моделированию перманентной гипоксии головного мозга путем необратимой перевязки обеих сонных артерий [7]. Можно предполагать, что выявленная в исследовании морфологическая специфика типологических особенностей высшей нервной деятельности приобретет большую значимость в условиях нагрузочных тестов и адаптаций. Заключение. Таким образом, установлено, что уровень стрессоустойчивости животного находится во взаимосвязи с характером нейроглиальных взаимоотношений, ВУС и ВУК связаны с меньшим количеством нейронов с двумя ядрышками, большим количеством погибших сателлитоцитов, низкими значениями средней площади распределения отростков астроцита, другие параметры, ассоциированные с ВУС и ВУК, носят взаимоисключающий или незначимый характер. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. В. К. Сбор и обработка материала: В. В. К., Д. А. П. Статистическая обработка данных: В. В. К. Анализ и интерпретация данных: В. В. К. Написание текста: В. В. К., Д. А. П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

V. V. Krishtop

Ivanovo State Medical Academy

Email: chrishtop@mail.ru
Scientific Research Center 8 Sheremetyevsky Pr., Ivanovo 153012

D. A. Pozhilov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: dmitry.oldman@yandex.ru
Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

References

Supplementary files