THE PROLIFERATION ACTIVITY IN RAT OLFACTORY BULB IN A NEURODEGENERATION MODEL

Full Text

Введение. Оценка интенсивности нейрогенеза в стволовых нишах головного мозга в норме и при экспериментальных воздействиях открывает новые перспективы изучения регенераторных способностей и закономерностей развития мозга. К каноническим зонам головного мозга позвоночных животных, в которых на протяжении всей жизни сохраняется нейрогенез, относят субвентрикулярную зону латеральных желудочков (СВЗ) и субгранулярную зону гиппокампа (СГЗ). Новообразованные нейроны из СВЗ и СГЗ мигрируют в ростральном направлении, это явление имеет тангенциальный характер на всем протяжении рострального миграционного потока (РМП). Лишь достигнув середины обонятельной луковицы (ОЛ), цепочки незрелых нейронов распадаются, и клетки начинают радиальную миграцию. Так они достигают наружных клеточных слоёв ОЛ, где происходит их окончательная дифференцировка. Мигрирующие нейробласты расходятся в радиальном направлении во все слои ОЛ, формируя множественные синаптические контакты, интегрируясь в нейрональную сеть. Для изучения тонкостей нейрогенеза, как процесса, течение которого контролируется разнообразными факторами, существуют селективные маркёры для выявления мигрирующих, пролиферирующих и дифференцирующихся нейробластов. Одним из маркеров пролиферации является Ki-67, который присутствует только в активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2 и M), является ядерным белком, связанным с транскрипцией р-РНК в ядрышках клетки. В настоящее время появилось большое количество работ, посвященных изучению факторов и состояний, оказывающих воздействие на нейрогенез. Многими исследователями доказано, что ишемия, инсульт [11, 13], травмы [8, 9] активируют нейрогенез в стволовых нишах. Ряд медикаментов также оказывают стимулирующее воздействие: флуоксетин [6], семакс [3], церебролизин [14] и др. Изменяется активность нейрогенеза и при нейродегенеративных состояниях: при болезни Альцгеймера в стадии компенсации активируются пролиферация и миграция нейробластов [7], при болезни Паркинсона происходит, наоборот, депрессия нейрогенеза [11]. Основным фактором, определяющим активность нейрогенеза, является возраст - после рождения активность пролиферации в стволовых нишах резко снижается. Вопрос о том, зависит ли реакция стволовых ниш на воздействия от возраста, остается открытым. Целью данного исследования является оценка влияния гибели части нейронов в неонатальном периоде на пролиферативную активность в обонятельной луковице. Материал и методы. Исследование проведено на 48 крысах-самцах линии Wistar разного возраста: 1, 3, 7, 14, 21, 35, 60, 75, 90 сут жизни (по 3 крысы в каждой возрастной группе). Экспериментальную группу составили 21 белая крыса, которых исследовали через 7 сут после введения капсаицина в указанные выше сроки до 90 сут. Контрольную группу составили 27 интактных крыс, которых исследовали в те же сроки, начиная с 1-х суток жизни. Объектом исследования служила правая обонятельная луковица. Моделирование нейродегенерации проводили путем однократного подкожного введения крысятам на 1-е сутки жизни 10 % раствора капсаицина (N-vanillylonanamide, Sigma) в смеси, состоящей из 1 части спирта, 1 части Твин-100, 8 частей изотонического раствора NaCl в дозе 100 мг/кг [5, 12]. Признаками, подтверждающими развитие нейродегенеративного процесса, считали уменьшение количества и дистрофические изменения нейронов в тройничном ганглии, снижение или отсутствие корнеального рефлекса спустя 14 сут после введения. Эксперимент одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (протокол № 20 от 14.12.2017 г.) и выполнен в соответствии с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларации 1975 г. в редакции от 2000 г. Ki-67 выявляли с помощью моноклональных кроличьих антител (ab16667, UK, 1:100) и вторичных антител (ab97051, UK, 1:1000) с пероксидазной меткой на парафиновых парасагиттальных срезах ОЛ, система детекции DAB Substrate Kit (ab64238). Срезы докрашивали гематоксилином Майера, дегидратировали и заключали в канадский бальзам. Для контроля и исключения артефактов при выполнении реакции часть препаратов обрабатывали только вторичными антителами, без нанесения первичных антител. Микроскопию проводили при помощи светового микроскопа Optica DM-20 (Италия) со встроенной камерой. На микрофотографиях стандартных срезов, проходящих через центральную зону ОЛ, определяли численную плотность нейронов (шт./мм2). Статистическую обработку данных проводили методами вариационной статистики с использованием пакетов Microsoft Excel 2010 и Statistica 8 (Statsoft). Вариационные ряды соответствовали распределению, близкому к нормальному (критерий Колмогорова-Смирнова), что позволило для проверки статистических гипотез использовать параметрические методы (t-критерий Стьюдента). Значимым считали различие сравниваемых показателей при p<0,05. Средние значения изучаемых показателей представлены в виде (x-±sx-), -где х - среднее арифметическое, а s- - стандартная ошибка среднего. Результаты исследования. У контрольных животных иммунопозитивные клетки распределялись в трёх слоях ОЛ: субэпендимальном, гранулярном и гломерулярном. По плотности распределения хроматина в ядре можно выделить 2 субпопуляции клеток: у одних - в ядре преобладает конденсированный гетерохроматин, у других - неконденсированный эухроматин. Ростральный миграционный поток переходит в центральную часть ОЛ - субэпендимальный слой, который в эмбриональном и раннем постнатальном периодах имеет полость - продолжение переднего рога латерального желудочка. В субэпендимальном слое на 1-е сутки наибольшее скопление иммунопозитивных клеток наблюдается вокруг полости зародышевого желудочка, плотность 1251,2±47,1 шт./мм2. Иммунопозитивные ядра - мелкие, содержат как гетеро-, так и эухроматин; имеют форму «гантелей» с первичной перетяжкой либо в виде «диплококка» с завершённым кариокинезом. В неонатальном периоде к 3-м суткам численная плотность Ki-67-позитивных ядер снижается (p<0,05). В последующие сроки заданная динамика параметра сохраняется (таблица), ик 21-м суткам численная плотность в 5 раз ниже, чем при рождении (p<0,05). На 35-е сутки плотность распределения пролиферирующих клеток в окончании рострального миграционного потока не изменяется. В ювенильном возрасте на 60-е сутки численная плотность пролиферирующих клеток вновь многократно в 9-11 раз снижается. В зрелом возрасте в центральной зоне ОЛ пролиферирующие клетки встречаются редко (единичные). Представленные данные свидетельствуют об активном функционировании собственной герминативной зоны в области зародышевого желудочка до 14-х суток жизни. В дальнейшем заполнение центральной зоны пролиферирующими клетками происходит из рострального миграционного потока. У новорожденных крысят гранулярный слой заполнен округлыми клетками с крупным ядром, занимающим практически всю клетку, в ядре хорошо дифференцируется хроматин, Ki-67позитивные клетки встречаются с численной плотностью 512,8±28,3 шт./мм2, у 7-суточных крысят плотность снижается в 2 раза и затем у 14-суточных ещё раз вдвое (p<0,05), ядра приобретают округлую форму, хроматин конденсирован (рисунок). В последующие сроки экспрессия Ki-67 в клетках гранулярного слоя практически отсутствует. В гломерулярном слое ОЛ иммунопозитивные клетки диффузно распределяются на фоне иммунонегативных. Выявляются ядра с фестончатыми краями, находящиеся на стадии кариокинеза. У новорожденных крысят (1 сут) численная плотность Ki-67-позитивных клеток составляет 1616,6±92,7 шт./мм2. На 3-и сутки жизни гломерулы окружены иммунопозитивными клетками, плотность которых значимо ниже, чем в предыдущий срок (p<0,05). У 7-суточных крысят гломерулярный слой приобретает более зрелую морфологию: клубочки выстраиваются в ряд по периметру ОЛ, приобретают капсулу. Перигломерулярные клетки с крупными ядрами содержат преимущественно гетерохроматин, большинство из них Ki-67-негативны. Численная плотность пролиферирующих клеток значимо снижена. На 14-е сутки экспрессия Ki-67 резко падает почти в 4 раза. С 21-х суток встречаются одиночные иммунопозитивные нейроны с крупным ядром, ровными краями и плотно конденсированным хроматином, по 1-2 клетки на гломерулу. На 35-е сутки гломерулярный слой становится Ki-67-иммунонегативным (см. таблицу). Эксперимент с неонатальным введением капсаицина показал, что у экспериментальных животных наиболее выраженные изменения экспрессии маркера пролиферации наблюдаются в субэпендимальном слое ОЛ. На 7-е сутки численная плотность позитивных ядер в экспериментальной группе превышает контрольную в 1,5 раза (p<0,05) (см. рисунок, г). Иммунопозитивные клетки локализуются группами по несколько штук, образуя скопления в герминативной зоне зародышевого желудочка ОЛ. При иммерсионной микроскопии визуализируются Ki-67позитивные ядра, находящиеся на стадии телофазы митоза (кариокинез). Размеры этих ядер вариабельны, чем крупнее ядро, тем интенсивнее хромоген заполняет кариоплазму нейронов. Это говорит о сохранении высокой пролиферативной активности данной зоны, причем различия с показателями у 3-суточных крысят незначимы. В следующий срок наблюдения (14 сут) относительная плотность позитивных ядер продолжает превышать уровень контрольной группы в 1,5 раза (p<0,05). На 21-е сутки полость зародышевого желудочка закрывается. Подсчёт Ki-67позитивных клеток в центральной зоне у крыс на этом сроке показал значимо меньшую их численную плотность по сравнению с 14-суточными. На 35-е сутки численная плотность пролиферирующих клеток в окончании рострального миграционного потока значимо не отличается от предыдущего срока, но превышает контрольный уровень в 2,7 раза (p<0,05). На 60-е сутки активность маркера резко снижена в 6,6 раза, на 75-е сутки - в 4,4 раза и на 90-е сутки - в 1,5 раза по сравнению с предыдущим сроком эксперимента (см. таблицу) (p<0,05 для всех групп сравнения). В контрольной группе на 75-еи 90-е сутки встречаются лишь единичные Ki-67-иммунопозитивные клетки. Введение капсаицина приводит к сохранению высокого уровня и пролонгации пролиферации до 90-х суток в центральной части ОЛ, т. е. активации нейрогенеза. При этом направленность динамики показателя - снижение плотности к периоду полового созревания - не изменяется. Гистотопографические особенности распределения маркера пролиферации в гранулярном слое ОЛ при моделировании нейродегенерации не отличаются от таковых в контрольной группе. У 7-суточных крысят гранулярные клетки достаточно плотно заполняют одноименный слой, часть ядер экспрессируют Ki-67. Численная плотность иммунопозитивных ядер превышает в 1,62 раза этот показатель в контрольной группе (p<0,05), но значимо ниже, чем у 3-суточных животных контрольной группы. На 14-е сутки иммунопозитивные ядра имеют округлую форму с конденсированным хроматином (см. рисунок, б), численная плотность их снижается в 1,57 раза, но вдвое превышает таковую в контрольной группе (p<0,05). К 21-м суткам у крыс экспериментальной группы показатель численной плотности ещё в 1,7 раза ниже, но остаётся на уровне, соответствующем 2-недельнному контролю, при том, что у контрольных животных, начиная с 21-х суток, встречаются лишь единичные в поле зрения Ki-67-позитивные ядра. К 30-м и 60-м суткам показатель продолжает значимо снижаться (p<0,05) (см. таблицу). Популяция клеток с Ki-67-позитивными ядрами гранулярного слоя морфологически однородна. Через 7 сут после введения капсаицина в гломерулярном слое ОЛ Ki-67 выявляется в ядрах перигломерулярных нейробластов, численная плотность пролиферирующих клеток в 1,16 раза превышает контроль (p<0,05) ив 1,17 раза меньше показателя у 3-суточных контрольных крысят (см. рисунок, в). К 14-м суткам этот показатель снижается в 2,6 раза, но сохраняет высокие значения, превышая в 1,67 раза данные в контрольной группе (p<0,05). Количество иммунопозитивных перигломерулярных клеток составляет 6-7 штук на гломерулу против 3-4 штук в контроле. К 21-м суткам численная плотность иммунопозитивных ядер, как и в гранулярном слое, находится на уровне 14-суточного контроля по сравнению с единичными перигломерулярными Ki-67-иммунопозитивными ядрами в контрольной 21-суточной группе (p<0,05). Последующее наблюдение показало, что экспрессия Ki-67 сохраняется до 75-х сут жизни животного (см. таблицу). Эффект введения капсаицина в гранулярном и гломерулярном слоях по направленности сопоставим с изменениями в центральной части ОЛ: также наблюдается пролонгация значимой экспрессии Ki-67 до 60-х суток (в контроле до 14-х суток), но численная плотность иммунопозитивных ядер увеличивается не более чем вдвое. Обсуждение полученных данных. В результате проведённого исследования доказано, что активность пролиферации Ki-67иммунопозитивных клеток в ОЛ зависит от возраста и слоя. В предыдущих исследованиях нами установлено, что максимальная экспрессия Ki-67 в ОЛ наблюдается в плодном периоде [2], а затем постепенно снижается на протяжении 2 нед постнатальной жизни до единичных случаев к 21-м суткам во всех слоях, за исключением центральной зоны. Сходные результаты получены в исследованиях ОЛ у мышей BALB/c [10]. Таким образом, характер распределения Ki-67иммунопозитивных ядер показывает, что активная пролиферация прогениторных клеток в слоях ОЛ ограничена подсосным возрастом. Можно предположить, что в последующих возрастах мигрирующие радиально клетки не пролиферируют, а только проходят стадии дифференцировки. Неонатальное введение капсаицина вызывает массовую гибель нейронов в ОЛ [1]. Нами показано, что в ответ на введение капсаицина пролиферативная реакция повышается уже в течение 1-й недели. Выраженность активизации имеет топологические особенности - максимальный и самый ранний эффект наблюдается в центре луковицы, затем распространяется на периферию в наружные слои. Скорость развития реакции доказывает, что в начале наблюдения основным источником пролиферирующих клеток является герминативная зона зародышевого желудочка ОЛ, а в последующие сроки - мигрирующие предшественники рострального потока. Пролиферирующие клетки начинают постепенную радиальную миграцию, заполняя слои ОЛ в течение 1 мес после воздействия. Данные об активизации субэпендимальных зон при нейродегенерации и ишемии у взрослых животных за пределами СГЗ и СВЗ представлены в ряде исследований [4]. Однако данные о возрастных особенностях реакции в литературе мы не встречали. Вероятно, выявленные изменения обусловлены целым рядом механизмов. К ним можно отнести как снижение выработки факторов, ингибирующих пролиферацию, так и появление сигнальных молекул от гибнущих нейронов, которые стимулируют нейрогенез. Заключение. Таким образом, диффузная гибель части нейронов, вызываемая введением капсаицина в неонатальном периоде онтогенеза, приводит к развитию компенсаторного процесса, проявляющегося активизацией канонических стволовых ниш и герминативной зоны ОЛ, а также пролонгацией пролиферативной активности радиально мигрирующих клеток до 90-х суток жизни крыс. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Т. А. Р., В. Е. В. Сбор и обработка материала: В. Е. В. Статистическая обработка данных: В. Е. В., Т. С. М. Анализ и интерпретация данных: Т. А. Р., В. Е. В., Е. В. К. Написание текста: В. Е. В., Т. А. Р. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов

About the authors

V. E. Varentsov

Yaroslavl’ State Medical University

Email: carabidolog@mail.ru
Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

T. A. Rumyantseva

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

E. V. Kiseleva

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Nervous Diseases with Medical Genetics and Neurosurgery 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

T. S. Myasishcheva

Yaroslavl’ State Medical University

Department of Human Anatomy 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl’ 150000

References

Supplementary files